Utilizzando la Toolchain di animazione FishSim per indagare il comportamento dei pesci: un caso di studio su Mate-scelta copia In Mollies Sailfin

Summary

Utilizzando il romanzo FishSim animazione Toolchain, presentiamo un protocollo per visual invasivo manipolazione dell'informazione pubblica nel contesto della copia di mate-scelta in sailfin mollies. FishSim Toolchain animazione fornisce un quadro di easy-to-use per la progettazione, l'animazione e la presentazione di stimoli di pesce animato al computer per esperimenti comportamentali con pesce di prova dal vivo.

Abstract

Nell'ultimo decennio, che impiegano animazioni al computer per la ricerca di comportamento animale è aumentato a causa della sua capacità di manipolare in modo non invasivo l'aspetto e il comportamento degli stimoli visivi, rispetto alla manipolazione di animali vivi. Qui, presentiamo la Toolchain di animazione FishSim , un quadro di software sviluppato per fornire ai ricercatori con un metodo facile da usare per l'implementazione di animazioni al computer 3D in esperimenti comportamentali con i pesci. La toolchain offre modelli per creare stimoli virtuali 3D di cinque diverse specie di pesci. Gli stimoli sono personalizzabili in aspetto e dimensioni, basato su fotografie scattate di pesci vivi. Stimoli multipli possono essere animati registrando nuoto percorsi in un ambiente virtuale utilizzando un controller per videogiochi. Per aumentare la standardizzazione del comportamento simulato, il percorso di nuoto preregistrato può essere riprodotti con diversi stimoli. Più animazioni più tardi possono essere organizzate in playlist e presentate sul monitor durante gli esperimenti con pesci vivi.

In un caso di studio con sailfin mollies (Poecilia latipinna), forniamo un protocollo su come condurre un esperimento di copiatura mate-scelta con FishSim. Abbiamo utilizzato questo metodo per creare e animare virtuali maschi e femmine di modello virtuale e poi presentato questi per vivere le femmine focale in un esperimento di scelta binaria. I nostri risultati dimostrano che animazione al computer può essere utilizzato per simulare i pesci virtuali in un esperimento di copiatura mate-scelta di studiare il ruolo della donne gravide macchie come un'indicazione di qualità per una donna modello copia di mate-scelta.

L'applicazione di questo metodo non è limitato agli esperimenti copia gemella-scelta ma può essere utilizzato in vari disegni sperimentali. Ancora, l'usabilità dipende dalle funzionalità visual studio specifico e deve prima convalida. Nel complesso, animazioni al computer offrono un elevato grado di controllo e standardizzazione negli esperimenti e sopportare il potenziale per 'ridurre la ' e 'sostituire' stimolo dal vivo animali pure quanto a 'perfezionare' procedure sperimentali.

Introduction

Recentemente, utilizzando le moderne tecniche per la creazione di stimoli artificiali, quali animazioni al computer e realtà virtuale, ha raccolto il gradimento in ricerca¹. Questi metodi offrono numerosi vantaggi rispetto ai classici approcci sperimentali con stimolo dal vivo animali^1,2. Animazione al computer consente la manipolazione non invasiva dell'apparenza (dimensione, colore) e il comportamento degli animali virtuali stimolo utilizzati negli esperimenti. Ad esempio, la rimozione chirurgica della spada nel maschio verde Portaspada (Xiphophorus helleri) per testare le preferenze compagno in femmine³ è stato reso inutile utilizzando animazione al computer in uno studio successivo su questa specie⁴. Inoltre, animazioni al computer possono creare fenotipi che solo raramente si incontrano in natura⁵. Le caratteristiche morfologiche di animali virtuali possono persino essere alterate nell'intervallo naturale di tale specie⁴. In particolare, la possibile manipolazione sistematica di comportamento è uno dei principali vantaggi dell'animazione al computer, dato che è quasi impossibile con animali vivi^6,7.

Esistono varie tecniche fino ad oggi per la creazione di animazioni al computer. Semplice bidimensionale (2D) animazioni in genere derivano da una foto di uno stimolo in movimento in due sole dimensioni e possono essere create con software comuni come MS PowerPoint⁸ o⁹di Adobe After Effects. Animazioni del tridimensionale (3D), che richiedono grafica 3D più sofisticata software di modellazione, abilitare lo stimolo di essere spostati in tre dimensioni, aumentando le possibilità di movimento fisico realistico e complesso^{6,7 , 10 , 11 , 12}. anche realtà virtuale disegni che simulano un ambiente 3D in cui navigare animali vivi sono stati usati^13,14. In una recente revisione Chouinard-Thuly et al. ² discutere queste tecniche uno ed evidenziare i vantaggi e gli svantaggi sulla loro attuazione nella ricerca, che dipende in particolare l'ambito dello studio e la capacità visiva dell'animale sperimentale (Vedi "Discussione"). Inoltre, Powell e Rosenthal¹⁵ dare consigli sul design sperimentale appropriato e quali domande potrebbe essere trattate impiegando stimoli artificiali nella ricerca di comportamento animale.

Dal momento che creazione di animazione al computer può essere difficile e richiede tempo, sorse la necessità di software facilitare e standardizzare il processo di progettazione di animazione. In questo studio, presentiamo il gratuito e open-source FishSim animazione Toolchain¹⁶ (breve: FishSim; https://bitbucket.org/EZLS/fish_animation_toolchain/), un approccio multidisciplinare che unisce biologia e informatica per risolvere queste necessità. Simile al più presto pubblicati strumento anyFish^17,18, lo sviluppo della toolchain seguito l'obiettivo di fornire ai ricercatori con un metodo facile da usare per l'implementazione di stimoli 3D animati negli esperimenti con i pesci. Il nostro software è costituito da un insieme di strumenti che possono essere utilizzati per: (1) creare pesce virtuale 3D (FishCreator), (2) animare i percorsi di nuoto del pesce virtuale con un video game controller (FishSteering) e (3) organizzano e presentano preregistrati animazioni su monitor a vivere pesci focale (FishPlayer). La nostra toolchain fornisce varie caratteristiche che sono particolarmente utili per il test in una situazione di scelta binaria, ma applicabile anche ad altri disegni sperimentali. Inoltre, l'animazione possibile di due o più pesci virtuali permette la simulazione di shoaling o corteggiamento. Le animazioni non sono vincolate ad uno stimolo specifico ma possono essere riprodotti con altri stimoli che permette di modificare l'aspetto di uno stimolo, ma mantenere costante il suo comportamento. La natura open source della toolchain, come pure il fatto che si basa sul sistema di funzionamento del robot ROS (www.ros.org), fornire elevata modularità del sistema e offrono possibilità quasi infinite per includere dispositivi di feedback esterno (come il controller o un sistema di tracciamento) e di adattare la toolchain alle proprie esigenze nella ricerca. Oltre a Poecilia latipinna, altre quattro specie sono attualmente utilizzabili: la Atlantic molly Poecilia mexicana, il guppy Poecilia reticulata, lo spinarello Gasterosteus aculeatus e un ciclide Haplochromis spp. Nuove specie possono essere creati in una grafica 3D modellazione strumento (ad es., frullatore, www.blender.org). Per esemplificare il flusso di lavoro con FishSim e fornire un protocollo su come condurre un esperimento di copiatura mate-scelta con la computer animation, abbiamo svolto uno studio di caso con sailfin mollies.

Scelta di Mate è una delle più importanti decisioni gli animali nella loro storia di vita. Gli animali hanno evoluto strategie differenti per trovare il miglior partner di accoppiamento. Essi può basarsi sulle informazioni personali quando valutare il potenziale accoppiamento partner in modo indipendente, possibilmente in base alle preferenze genetiche predeterminate per un certo tratto fenotipico^19,20. Tuttavia, possono anche osservare la scelta del compagno di conspecifici e quindi utilizzare informazioni pubbliche²¹. Se l'osservatore decide allora di scegliere il compagno stessa (o lo stesso fenotipo) come i conspecifici osservato — il «modello» — scelto in precedenza, questo è definito mate-scelta copia (in seguito abbreviato come MCC)^22,23. Mate-scelta copia è una forma di apprendimento sociale e, quindi, una strategia di mate-scelta non indipendente²⁴, che è stato osservato in entrambi vertebrati^{25,26,27,28, 29} e invertebrati^30,31,32. Finora, MCC è stato studiato principalmente in pesce e si trova sotto laboratorio condizioni^{33,34,35,36,37,38} e nella selvaggio^39,40,41,42. Copia di Mate-scelta è particolarmente importante per un individuo se due o più potenziali partner di accoppiamento sono apparentemente simili in qualità e una scelta di "buon" compagno — in termini di massimizzazione fitness — è difficile fare⁴³. La qualità di un modello femmina se stessa può influenzare il fatto focale femmine copia di sua scelta o non^44,45,46,47. Rispettivamente, qualità femminile modello "buono" o "cattivo" è stato attribuito alla sua più o meno sta vivendo a scelta, ad esempio per quanto riguarda le dimensioni e l'età^44,45,46, o dal suo essere un conspecifico o un heterospecific⁴⁷. In mollies sailfin che copiano la scelta del compagno di conspecifici^{39,48,49,50,51}, è stato trovato che le femmine focale copiare anche il rifiuto di un maschio⁵² . Poiché MCC è considerata un ruolo importante nell'evoluzione dei tratti fenotipici, come pure la speciazione e ibridazione^21,23,53,54, le conseguenze di copiare un " scelta falsa"può essere tremendo nel ridurre l'idoneità della copiatrice⁵⁵. Se un individuo decide di copiare la scelta di un altro individuo, che è importante valutare se il modello osservato è una fonte affidabile di informazioni, cioè, che il modello stesso è fare una scelta "buona" a causa di lui o il suo essere ben sperimentato in mate scelta. Qui si pone la questione: quali funzionalità visual può caratterizzare un modello affidabile per copiare da nelle femmine di sailfin molly?

Una caratteristica visiva distinta in mollies sailfin femminile e altri Pecilidi è il luogo gravido (noto anche come 'spot anale', 'covata patch' o 'gravidanza spot'). Questa zona scuro pigmentata nella loro regione anale deriva da melanizzazione del tessuto fodera la sacca ovarica⁵⁶. Le dimensioni e la presenza dello spot gravid sono variabili attraverso le femmine conspecifici e può ulteriormente modificare singolarmente durante la progressione di cicli ovarici^56,57. Gravid macchie possono servire per attirare i maschi e facilitare l'orientamento gonopodial per inseminazione interna⁵⁸ o come mezzo di pubblicità fertilità^59,60. Considerando il legame tra lo spot gravid e lo stato riproduttivo di una femmina, avevamo previsto che lo spot gravid serve come un segno di qualità femminile modello fornendo informazioni sul suo stato attuale riproduttiva a osservare femmine focale. Abbiamo studiato due ipotesi alternative. In primo luogo, se lo spot gravid è un segno generale per la maturità, come predetto da Farr e Travis⁵⁹, si denota un modello presumibilmente affidabile ed esperto, rispetto a un modello di immaturo (senza il punto). Qui, le femmine focale sono più probabili di copiare la scelta di un modello con una macchia, ma non quello di un modello senza macchia. In secondo luogo, se lo spot gravid segna non ricettività dovuto già sviluppando nidiate, come predetto da Sumner et al. ⁶⁰, il modello è presumibilmente meno affidabile poiché non ricettivo femmine sarebbero considerate meno esigente. In questo caso, le femmine focale non copierà loro scelta se non quella di modelli senza macchia. Finora, il ruolo dello spot gravid per MCC nelle femmine di molly Poecilia è mai stato testato, né manipolato sperimentalmente.

Abbiamo usato FishSim per eseguire un esperimento MCC presentando virtuale stimolo maschi e femmine di modello virtuale sul monitor del computer anziché dal vivo stimolo e modello pesce come usato nel procedimento sperimentale classico^{49,50 ,51,61}. L'usabilità generale del nostro software è stato convalidato in precedenza per il test di ipotesi circa la scelta del compagno in sailfin mollies¹². Qui, abbiamo provato se l'assenza o la presenza di una macchia gravid nelle femmine di modello virtuale influisce sulla scelta dell'accoppiamento di osservare dal vivo femmine focale. Lasciamo in primo luogo focale femmine acclimatare al serbatoio di prova (Figura 1.1) e far loro scegliere tra due maschi di stimoli diversi virtuale in un test di primo mate-scelta (Figura 1.2). In seguito, durante il periodo di osservazione, il precedente uomo virtuale non preferite è stato presentato insieme ad una donna di modello virtuale (Figura 1.3). In una successiva seconda prova di mate-scelta, femmine focale ha scelto ancora una volta tra i maschi stessi (Figura 1.4). Abbiamo analizzato se focale femmine avevano copiato la scelta del compagno della femmina modello osservati confrontando la sua decisione di mate-scelta nella prima e seconda prova mate-scelta. Abbiamo effettuato due diversi trattamenti sperimentali in cui abbiamo manipolato visivamente la qualità della femmina modello virtuale. Durante il periodo di osservazione, abbiamo presentato sia preventivo non preferite virtuale uomo (1) insieme a una donna di modello virtuale con una macchia gravid (trattamento "spot"); o (2) insieme a una donna di modello virtuale senza macchia gravid (trattamento "nessun punto"). Inoltre, in un controllo senza qualsiasi donna modello, abbiamo provato se femmine focale ha scelto costantemente quando è stata fornita alcuna informazione pubblica.

Figura 1. Panoramica generale delle operazioni sperimentali più importanti per un esperimento MCC con stimoli di pesce virtuale. (1) periodo di acclimatazione. Test (2) primo mate-scelta: live focale donna sceglie tra i maschi stimolo virtuale. Periodo di osservazione (3) : focale donna orologi il maschio non preferite prima insieme a una donna di modello virtuale con spot gravid. (4) mate-scelta seconda prova: la femmina focale ancora sceglie tra i maschi stimolo virtuale. In questo esempio, si copia la scelta del modello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

Gli esperimenti eseguiti e la manipolazione del pesce erano in linea con la legislazione sul benessere degli animali di tedesco (Deutsches Tierschutzgesetz) e approvato dal funzionario interno animaliste Dr. Urs Gießelmann, Università di Siegen e le autorità regionali ( Kreisveterinäramt Siegen-Wittgenstein; Permesso di numero: 53,6 55-05).

1. virtual Fish Design

Nota: Trovare un elenco di richiesta hardware e software nell'elenco materiali supplementari. Una descrizione dettagliata delle funzionalità generali del FishSim e ulteriori suggerimenti e trucchi può essere trovata nel manuale dell'utente (https://bitbucket.org/EZLS/fish_animation_toolchain/).

1. Preparazione di texture di corpo femminile con e senza macchia gravid
   1. Avviare GIMP e fare clic su File >> aprire per aprire l'immagine di trama del corpo femminile "PLF_body_6. png"dalla cartella modelli nella directory"fishsim_animation_toolchain". Utilizzare questa immagine come riferimento per tutte le nuove texture di corpo femminile creato con spot gravid. Selezionare zona spot gravid scura nell'immagine di riferimento con lo strumento di selezione libero e tagliarlo (fare clic su modificare >> taglio).
      Nota: GIMP (disponibile presso www.gimp.org) è un libero strumento, simile ad Adobe Photoshop, che può essere utilizzato per manipolare le immagini digitali e grafica di editing immagine.
   2. Aprire un secondo file di texture di corpo femminile in GIMP (ad es., "PLF_body_7.png") e trasferire l'area spot sulla seconda texture di corpo inserendo (Edit >> Incolla dentro) previo taglio zona spot come nuovo livello galleggiante. Regolare la posizione dello spot gravid negli strati secondo foto e stampa unione facendo clic strato >> àncora livello.
      Nota: Assicurarsi che l'area dello spot gravid ha la stessa dimensione e posizione identici su ogni donna modello virtuale (Figura 2)!
   3. Esportare (Edit >> Esporta come) la nuova texture "spot" con un nuovo nome (ad es., PLF_body_7_S. png) nella cartella modelli . Chiudere tutti i aprire finestre immagine in GIMP.
      Nota: Non apportare altre modifiche (ad es., scala) per la texture file poiché sono appositamente modificate per essere più tardi mappati sul pesce 3D.
   4. Creare una seconda texture di corpo senza macchia gravid, utilizzando lo stesso file di texture originale corpo femminile una seconda volta (per esempio, "PLF_body_7.png"). Ora, coprire le macchie già esistenti gravide nel file originale con l'aiuto di GIMP.
   5. Aprire la texture del corpo femminile in GIMP e selezionare lo strumento clona. Selezionare il motivo della zona addominale (senza pigmentazione scura) premendo Ctrl + tasto sinistro del mouse e utilizzare questa selezione per coprire esistente pigmentazione scura di pittura su di esso con lo strumento clone (Figura 2).
   6. Esportare l'appena creato "no spot" texture sotto un nuovo nome (ad esempio, PLF_body_7_NS.png) nella cartella modelli . Chiudere il GIMP.

Figura 2: immagini di esemplare del corpo femminile textures prima (originale) e dopo manipolazione di "spot" e "nessun punto" trattamento utilizzando l'editing di foto strumento GIMP. Il cerchio tratteggiato segna l'area che è stato manipolato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Il punto di vista di regolazione e impostazione della "scena" per l'animazione
   1. Avviare FishSim selezionando l'icona di FishSim in avvio sul lato sinistro del desktop. Configurare la risoluzione per il monitor di presentazione e fare clic su avvio.
      Nota: Si raccomanda di effettuare le seguenti operazioni (misure 1.2.2\u20121.2.4) sullo schermo di uno dei monitor di presentazione (se monitor dimensioni e risoluzioni diverse).
   2. Premere F1 sulla tastiera per passare dalla visualizzazione di modalità alla modalità di modifica (alternare tra la visualizzazione e la modalità di modifica premendo F1).
      Nota: Passaggio alla modalità di modifica consente la modifica della barra degli strumenti nella parte superiore della finestra. La scena come visto nella modalità di visualizzazione raffigura ciò che sarà presentato sullo schermo durante gli esperimenti.
   3. Regolare il punto di vista per abbinare le dimensioni dei monitor presentazione regolando l'angolo di macchina fotografica. Ruotare la fotocamera tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse e spostare il cursore. Spostare la telecamera tenendo premuto il pulsante destro del mouse e spostando il cursore. Zoom in e out tenendo la centrale del mouse (o entrambi i pulsanti del mouse) e muovendo il cursore.
   4. Fare clic su fotocamera impostazioni nella barra degli strumenti di editing (icona della macchina fotografica) e fare clic su copia a cam statico per impostare il punto di vista. Fare clic sul File >> salvare la scena per salvare la scena registrata come la nuova scena di default. Per questo, eseguire l'override del file "default_scene.scene" nella cartella della directory FishSim scene .
      Nota: La scena di default verrà visualizzata ad ogni avvio di FishSim e come la scena iniziale in FishPlayer. In FishPlayer la scena di default serve anche come una pausa durante gli esperimenti (Figura 3A). Regolando la scena deve essere eseguita una sola volta.

Figura 3: screenshot di una scena in FishSim. (A) la scena di default vuoto senza un pesce, (B) una scena che mostra un uomo solo, (C) una scena che mostra quello stesso uomo insieme a una donna di modello con una macchia e (D) una scena che mostra il maschio identico e il modello identico femmina senza una macchia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Progettazione di un virtuale stimoli maschio per presentazione durante le prove di mate-scelta
   Nota: Preparare virtuali stimoli maschi che più tardi saranno animati e presentati per vivere focale femmine durante le prove di mate-scelta.
   1. Se non è già aperta, avviare FishSim. Premere F1 per accedere alla modalità di modifica.
   2. Fare clic sul File >> modello di carico pesce dal menu a discesa e carico il predefinito sailfin maschio molly modello "default_PLM.x" selezionandolo dalla cartella modelli.
   3. Sinistra fare doppio clic sul pesce caricato per selezionarlo. Esso verrà evidenziata in una mesh. Fare clic sull'icona dell'ingranaggio sulla barra degli strumenti per aprire il set di strumenti di pesce. Una finestra pop-up con le opzioni di editing utilizzate per personalizzare l'uomo virtuale. Deselezionare Visualizza mesh per una migliore visione del pesce.
   4. Modificare il nome di maschio.
      Nota: Il nome del maschio è importante e rappresenta il "ruolo" che più tardi verrà riprodotto durante l'animazione. Questo nome deve essere identico per ogni uomo virtuale appena creato che verrà utilizzato più avanti durante gli esperimenti.
   5. Modificare la scala (dimensioni) del maschio modificando i valori per x, y e z, se necessario e fare clic su applica.
   6. Modificare texture del maschio facendo texture in Edit Toolbox. Fare clic su una caratteristica del pesce (corpo, dorsale, caudale) per modificarlo.
      Nota: La casella di scegliere una texture per pop-up con tutti i file con estensione png che possono essere utilizzati come texture. Texture appariranno con nomi come specificato nella cartella modelli .
   7. Fare clic su una struttura visualizzata nell'elenco (a destra) e direttamente apparirà e sostituire il precedente trama sul pesce.
   8. Quando viene creato il maschio desiderato, fare clic su applica sotto Config nella Casella degli strumenti di modificae fare clic su Salva pesci disco. Salvare il nuovo maschio come "Male_A.fish" nella cartella modelli .
   9. Inoltre, salvare tutta la scena (File >> Salva scena) comprese che un maschio nella cartella scene . Qui, si consiglia di utilizzare il nome "Male_A_alone.scene" (figura 3B).
   10. Fare clic sul File >> carico scena per caricare la scena di default vuoto e ripetere i passaggi 1.3.2 a 1.3.9 creare come molti diversi maschi virtuali come necessario e salvare ciascuna appena creato maschi sotto un nome univoco nella cartella modelli e come un nuovo file. scene in la cartella di scena .
4. Progettazione di pesce femmina modello virtuale per presentazione durante il periodo di osservazione
   1. Fare clic sul File >> carico scena per caricare la scena di default. Seguire passo 1.3.1 e fare clic su File >> modello di carico pesce per caricare il modello femminile predefinito "default_PLF.x" dalla cartella modelli .
   2. A sinistra fare doppio clic sulla femmina caricata per selezionarlo e aprire il set di strumenti di pesce. Modificare il nome in "donna". Scala la femmina se necessario come descritto al punto 1.3.5.
      Nota: Nome e ridimensionamento devono essere identici per tutte le femmine ai fini di questo esperimento.
   3. Sostituire la texture del corpo femminile predefinito con il "luogo", creato in precedenza-texture (elencato nella casella a destra) del corpo come descritto nei passaggi 1.3.6 a 1.3.7.
   4. Fare clic su applica sotto Config nella Casella degli strumenti di modifica, quindi salvare il pesce su disco facendo clic su Salva e creare un file "Female_1S.fish" (S = spot).
   5. Fare clic sul File >> carico scena per caricare la scena di default. Ripetere i passaggi da 1.4.1 a 1.4.4 per creare almeno uno (o anche necessario), ma donna modello identico senza la gravid spot e il nome "Female_1NS.fish" (NS non = nessun punto). Salvare ogni pesce nella cartella models .
      Nota: Per il periodo di osservazione dell'esperimento MCC, scene tra cui un maschio e una femmina devono essere creati e salvati.
   6. Fare clic sul File >> carico scena per caricare la scena vuota predefinito. Fare clic sul File >> modello di carico pesce per inserire un maschio virtuale "Male_A.fish" dalla cartella modelli . Fare clic File >> modello di carico pesce nuovo per aggiungere il virtuale modello femminile "Female_1S.fish" alla scena. Modificare la posizione di ogni pesce alterando loro assi x, y e z-coordinate in modo che i loro corpi non si sovrappongono.
      Nota: Eliminare un pesce dalla scena facendo doppio clic su di esso e premendo Elimina sulla tastiera.
   7. Salvare la scena tra cui modello maschile e femmina facendo File >> salvare scena come "Male_A_with_Female_1S.scene" (Figura 3).
   8. Ripetere i passaggi da 1.4.6 a 1.4.7 per creare tre scene aggiuntive per: (1) Male_A con Female_1NS (Vedi Figura 3D), (2) Male_B con Female_1S e (3) Male_B con Female_1NS.

2. animazione di pesce virtuale stimoli

Nota: Ogni tipo di animazione necessari per l'esperimento deve essere preparato utilizzando solo una volta un esemplare maschio e un'osservazione esemplare scena (maschio e femmina animato insieme). Durante il processo di animazione, un percorso di nuoto per ogni pesce è creato che può essere rivisto in seguito da qualsiasi pesce, purché il nome è identico (Vedi punto 1.3.4).

1. Animazioni virtuali maschile per presentazione durante le prove di mate-scelta
   Nota: Preparare due animazioni di un uomo virtuale: (1) un percorso di nuoto con una durata di 7,5 min e (2) un percorso di nuoto con una durata di 5 min.
   1. Collegare il controller di gioco (ad es., Sony Play Station 3) alla porta USB del computer operativo.
   2. Aprire FishSim e fare clic su File >> carico scena per caricare la scena di un maschio dalla cartella scene, ad esempio, "Male_A_alone.scene". Avviare FishSteering cliccando sull'icona di FishSteering .
   3. Configurare le impostazioni del controller in una finestra separata.
      Nota: FishSim e FishSteering eseguire contemporaneamente e pesce può essere diretto durante la visione, come mostrato durante gli esperimenti, o in modalità di modifica premendo F1.
   4. Per animare il pesce (maschio), selezionarlo dal menu a discesa del pannello di sterzo . Nomi di modello qui corrispondono al nome dato nella Casella degli strumenti di modifica (Vedi punto 1.3.4).
   5. Fare clic su iniziare a posizionare e utilizzare il controller per mettere il pesce in qualsiasi posizione di partenza nel serbatoio virtuale. Fare clic su Stop immissione.
   6. Iniziare a registrare il percorso di nuoto del pesce facendo iniziare la registrazione. Utilizzare il controller per spostare il pesce intorno alla scena.
      Nota: La durata della registrazione è indicata in basso a destra del pannello dello sterzo.
   7. Scegliere di interrompere la registrazionedi. Fare clic su Salva per salvare il percorso di nuoto come un file di .bag (un "record") sull'unità (ad es. sul desktop). Scegliere il nome del file per rappresentare la durata del record, ad esempio, "7_30_min_male_alone.bag".
      Nota: Una volta che la registrazione viene interrotta, non è possibile modificare la durata totale del nuovo.
   8. Modificare la registrazione per aggiungere movimento della pinna dorsale del maschio di imitare il comportamento di corteggiamento maschile durante le prove di mate-scelta. La pinna dorsale di selezionare dal menu a discesa nella funzionalità di modifica (solo una funzione possa essere modificata in un momento).
   9. Selezionare Start editing e il percorso di nuoto completo verranno riprodotti. Premere il tasto L1 sul controller per sollevare la pinna dorsale in punti specifici nel tempo. Fare clic su Salva per salvare la versione modificata del percorso nuoto come un nuovo . Borsa-file.
   10. Ripetere i passaggi 2.1.8 e 2.1.9 ma selezionare il gonopodio per aggiungere il suo movimento. Salvare la versione finale per un uso successivo in FishPlayer. Vicino FishSteering.
       Nota: Si consiglia di salvare i file di borsa per ogni passaggio di modifica sotto un nome univoco. In questo modo, è sempre possibile tornare a una versione precedente dell'animazione se qualcosa nel processo di editing va storto.
2. Animazione virtuale di femmina maschio e modello per presentazione durante il periodo di osservazione
   Nota: Preparare un'animazione con un virtuale maschio e la femmina di modello virtuale nel corteggiamento, così sessualmente che interagiscono con a vicenda, con una durata complessiva di 10 min.
   1. Aperto FishSim. Premere F1 per accedere alla modalità di modifica e fare clic su File >> carico scena per caricare una scena con maschio e femmina, ad esempio, "Male_A_with_Female_1S.scene". Avviare FishSteering.
   2. Selezionare alternativamente maschio e femmina per metterli (facendo clic su Start/Stop immissione) nel serbatoio virtuale.
   3. Per la registrazione, selezionare prima il pesce femmina dal menu a discesa del pannello di sterzo e creare un percorso di nuoto con durata di 10 min come segue 2.1.5 a 2.1.6.
      Nota: Il percorso di nuoto del pesce solo una alla volta può essere registrato. Dopo l'animazione il primo pesce, il percorso di nuoto del pesce secondo può essere incluso usando la funzione Edit , mentre il pesce precedentemente diretto verranno riprodotti a fianco per tutta la durata dell'animazione.
   4. Scegliere di interrompere la registrazione e salvare il percorso di nuoto sul disco, per esempio, come "10_00_min_male_with_female.bag". Poi successivamente modificare il maschio percorso di nuoto, pinna dorsale movimento e movimento gonopodio come descritto nei passaggi 2.1.8 per 2.1.10. Salvare la versione finale per un uso successivo in FishPlayer.

3. preparazione animazione playlist per l'esperimento MCC

Nota: Utilizzare FishPlayer per presentare animazioni su due monitor per vivere focale femmine. Organizzare le playlist per ogni monitor separatamente simulare la procedura dell'esperimento MCC (Figura 1). Lo strumento è costituito da una finestra principale, mostrando la playlist record per ogni monitor (Figura 4) e una finestra di animazione separata per ogni monitor di presentazione.

1. Funzionalità generali e la disposizione delle scene e record
   1. Chiudere tutte le finestre e aprire FishPlayer facendo clic sull'icona corrispondente. Configurare l'impostazione per l'uso con due monitor per presentazione (sinistra e destra) e fare clic su avvio.
      Nota: La scena di default creata nel passaggio 1.2.4 (salvata in scenes/default_scene.scene) verrà sempre caricata e visualizzata su entrambi i monitor come la scena iniziale e durante un comando pause.
   2. Aggiungere voci alla playlist per ogni monitor separatamente. Fare clic su Aggiungi carico scena per aggiungere la scena di per esempio, A maschio, dalla cartella scene nella directory FishSim . Fare clic su Aggiungi giocare record per aggiungere un record dall'unità, ad esempio, il record di 7,5 min per un uomo da solo.
      Nota: La scena e il seguente record verrà quindi collegate per il software e l'uomo virtuale raffigurato nella scena sarà animato come definito nel record corrispondente.
   3. Fare clic su Aggiungi pausa per aggiungere un comando pause di una durata specifica (minuti/secondi) che mostra la scena di default senza pesce come una pausa per pesce movimentazione tra i record.
      Nota: Durata della pausa deve generalmente dipendere il tempo necessario per la manipolazione di pesce. Fare clic su una voce e trascinare per modificarne l'ordine nell'elenco. Le voci selezionate sono evidenziate in rosso. Eliminare una voce dall'elenco di riproduzione selezionando la voce e facendo clic Elimina selezione.
   4. Fare clic su Play/Stop per avviare e interrompere una presentazione. Interrompere sempre si concluderà la playlist completa, ad esempio, non c' non è alcun modo per mettere in pausa a metà di una playlist una volta in esecuzione.
      Nota: Playlist sarà sempre iniziare dal primo ingresso ed eseguito dall'alto verso il basso. Pertanto, l'ordine corretto di tutte le voci deve essere impostata prima dell'esperimento e non può essere modificato in seguito senza interrompere la presentazione. Un timer nella parte inferiore della finestra Mostra la durata e il tempo effettivo della playlist corrente.
2. Arrangiamento di playlist per i due trattamenti e il controllo dell'esperimento MCC
   Nota: In termini di disposizione la voce, l'esperimento MCC è diviso in due parti: (1) la prova di mate di primo-scelta e (2) il periodo di osservazione seguita dal test secondo compagno-scelta. Pertanto, per ogni trattamento e il controllo, playlist devono essere organizzati in due ordini diversi.
   1. Quando si esegue l'esperimento, in primo luogo, preparare una playlist per il test di primo mate-scelta.
   2. In secondo luogo, nel corso dell'esperimento in esecuzione, è possibile modificare la disposizione della playlist per il successivo periodo di osservazione e la seconda prova di mate-scelta secondo cui uomo virtuale è stato preferito dalla femmina focale nel test primo mate-scelta.
3. Disposizione di playlist specifiche per il trattamento di "spot"
   1. Per la prova di mate di primo-scelta in trattamento 1, ordina la playlist esattamente come rappresentato in Figura
   2. Dopo la prova di mate di primo-scelta, fare pausa per calcolare quale uomo virtuale era comodo (Vedi punto 5.9 qui sotto). Quindi è possibile ridisporre le playlist per il periodo di osservazione, in cui informazione pubblica è previsto per la femmina focale mostrando il maschio non preferite precedente insieme con la donna modello.
   3. Organizzare la playlist per l'osservazione e la seconda prova di mate-scelta seguente secondo Figura 5.
   4. Per il periodo di osservazione, è possibile collegare il record di 10 min (modello e maschio femmina insieme) con una scena che mostra il Priore preferito maschio da solo.
      Nota: In questo caso, sarà visualizzato solo il percorso di nuoto del maschio e, poiché è presente nella scena, la femmina di modello virtuale sarà assente.
   5. Per la playlist con il maschio non preferite, collegare il record di 10 min alla scena tra cui il maschio non preferite precedente insieme con la femmina di modello. Scegliere le scene tra cui una donna di modello con una gravid spot (S) per questo trattamento.
      Nota: A differenza di 3.3.2, qui, sono riprodotti il record identico ma ora la donna modello è visibile.

Figura 4: schermata che mostra le playlist di FishPlayer per i monitor di sinistro e destro nella prima parte (cioè, il primo mate-scelta test) dell'esperimento MCC. Voci di playlist sono ordinate come necessario per i test di primo mate-scelta di trattamento 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: schermata che mostra le playlist di FishPlayer per i monitor sinistro e destro nella seconda parte dell'esperimento MCC (periodo di osservazione e seconda prova di mate-scelta). Voci di playlist sono ordinate secondo necessità per il periodo di osservazione e la seconda prova di mate-scelta nel trattamento 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Disposizione di playlist specifiche per il trattamento di "nessun posto"
   1. Per trattamento 2, ordinare le playlist come descritto per il trattamento 1 (figure 4 e 5), ma invece usare la scena tra cui la femmina di modello virtuale senza macchia gravid (NS) durante l'osservazione.
5. Disposizione di playlist specifiche per il controllo di coerenza di scelta
   Nota: Nel controllo di coerenza di scelta, voci di elenco di riproduzione per il test di mate-scelta sono identiche ai trattamenti 1 e 2 (Figura 4). Durante il periodo di osservazione, tuttavia, alle femmine focale viene fornita alcuna informazione pubblica e, quindi, nessuna donna modello è visibile.
   1. Ordinare le playlist come illustrato nella Figura 5 ma combinare le scene per ogni uomo da solo con il record di 10 min.
      Nota: In questo caso, sarà visualizzato solo il percorso di nuoto del pesce maschio e, poiché è presente nella scena, la donna modello sarà assente su entrambi i lati.

4. organizzazione sperimentale

1. Posto due computer schermi ciascuno alle estremità opposte di un serbatoio di prova. Regolare gli schermi per coprire la maggior parte delle pareti di vetro della vasca prova e per avere 1,5 cm di spazio tra le schermate e le pareti del serbatoio. Forniscono un'illuminazione al serbatoio dall'alto.
2. Coprire il fondo del serbatoio con un sottile strato di ghiaia e riempirlo con acqua adatto per pesci vivi all'altezza degli schermi. Contrassegnare una zona scelta con una linea verticale alla profondità di 20 cm da ogni estremità all'esterno del serbatoio. Avere a portata di mano un cilindro di vetro acrilico e due cronometri.
3. Collegare il monitor all'alimentatore e al computer operativo, posizionato ad almeno 1 m dal serbatoio di prova, ad esempio, su un tavolino (Figura 6).

Figura 6: messa a punto sperimentale per l'esperimento MCC con la computer animation. Il funzionamento computer si connette a due monitor di presentazione (Monitor 1 e 2) che riprodurre animazioni per vivere le femmine focale all'interno del serbatoio di prova. Per l'illustrazione, entrambi i monitor LCD sono angolati per mostrare una scena animata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. esecuzione dell'esperimento MCC

Nota: Seguire la procedura di seguito per eseguire una prova di controllo esperimento MCC utilizzando una femmina focale dal vivo, trattamento 2 o 1 trattamento sperimentale (Vedi Figura 1).

1. Aprire FishPlayer nel computer in uso e organizzare le playlist per la prova di mate di primo-scelta come ad es., descritto per trattamento 1 (Figura 4). Controllare che il monitor per la presentazione sono in esecuzione e che stanno mostrando la scena di default vuota.
2. Posto una femmina focale dal vivo all'interno del serbatoio di prova. Lasciala nuotare liberamente e raggiunga il serbatoio e la presentazione delle cisterne vuote su entrambi i monitor per un periodo di 20 min.
3. Dopo acclimatazione, posizionare la femmina focale in un cilindro trasparente acrilico nel mezzo del serbatoio di prova per assicurare una distanza uguale per entrambi i monitor ed eseguire le playlist su entrambi i monitor contemporaneamente facendo clic su Play, a partire con il primo mate-scelta prova.
   Nota: La femmina focale è permesso di guardare entrambi maschi su stimolo virtuale all'interno del cilindro per circa 2,5 min.
4. Prima che il timer arriva a 02:30 min, andare lentamente al serbatoio sperimentale e rilasciare la femmina focale dal cilindro sollevandola delicatamente dritto fuori dall'acqua, per esempio, alle 02:15 min.
   Nota: Qui, la tempistica esatta dipende dalla distanza dal computer operativo al serbatoio di prova e deve essere determinato durante le esecuzioni dei test precedenti. È fondamentale agire lentamente e delicatamente per evitare sottolineando il pesce. Poiché pesce può agire molto rapidamente, è consigliabile avere già una cronometro a portata di mano mentre si rilascia la femmina per avviare direttamente la misura del tempo di associazione (vedere punto 6.1).
5. Tornare al computer operativo. Osservare la femmina focale e hanno due cronometri a portata di mano per misurare il tempo di associazione con ogni uomo di stimolo virtuale (vedere punto 6.1).
   Nota: La femmina focale è consentita nuotare liberamente e scegliere tra entrambi i maschi per 5 min.
6. Interrompere la misurazione del tempo di associazione quando il timer arriva a 07:30 min. La voce di pausa poi verrà eseguito per un minimo di 1,5 uso la pausa come tempo di trattamento, ancora una volta, posizionare la femmina focale all'interno del cilindro e annotare il tempo per ogni uomo virtuale in un foglio dati.
   Nota: Dopo la pausa, la seconda 07:30 ingresso minuti inizierà e la femmina focale può guardare entrambi i maschi per 02:30 minuti. Posizione maschio ora viene commutato tra sinistra e destra per controllo per un bias di lato possibile nelle femmine focale (Vedi punto 6.3).
7. Prima che il timer arriva a 11:30 min, rilasciare la femmina focale dal cilindro. Misurare il tempo associazione per il prossimo 5 min.
8. Interrompere la misurazione del tempo di associazione quando il timer raggiunge 16:30 min. La voce di pausa verrà eseguito per un minimo di 1 uso questo tempo di movimentazione per posizionare la femmina focale all'interno del cilindro.
9. Annotare volte associazione per la seconda misurazione. Per ogni uomo, riassumere volte associazione di entrambe le metà del test primo mate-scelta (prima e dopo i maschi sono stati commutati). Calcolare se la femmina focale ha una polarizzazione di lato e il cui maschio è stato preferito dalla femmina focale (vedere procedura 6.1 a 6.3).
   Nota: Non è un problema se la pausa è finita prima che il calcolo è fatto, poiché la playlist per raggiungere il suo fine e fermare ha bisogno di procedere al passaggio successivo.
10. Ridisporre le playlist (fare non chiudere FishPlayer!) come mostrato nella Figura 5 (a seconda del trattamento corrente) in modo che il Priore preferito uomo sarà animato da solo durante il periodo di osservazione e il maschio non preferite preventivo sarà animato insieme al modello virtuale femmina.
    Nota: Le modifiche apportate alle playlist non sono visibili alla femmina focale.
11. Fare clic su Play per continuare che la seconda parte dell'esperimento e le voci verrà riprodotti da cima a fondo a partire dal periodo di osservazione di 10 min.
    Nota: Durante il periodo di osservazione, la femmina focale rimane all'interno del cilindro, ma è in grado di guardare entrambe le presentazioni.
12. Dopo il periodo di osservazione, una pausa di 0,5 min inizia. Prima che il timer arriva a 10:30 min, rilasciare la femmina focale dal cilindro e iniziare il seconda compagno-scelta di prova con il record di 5 min per ogni uomo. Misurare i tempi di associazione per il prossimo 5 min.
13. Interrompere la misurazione del tempo di associazione quando il timer arriva a 15:30 min. La voce di pausa sarà quindi eseguire per un minimo di 1,5 posto la femmina focale all'interno del cilindro e annotare il tempo misurato per ogni uomo virtuale.
    Nota: Dopo la pausa, il successivo 07:30 min voce verrà avviato e la femmina focale può guardare entrambi i maschi (cui posizione ha nuovamente commutata tra destra e sinistra) per 2,5 min.
14. Prima che il timer arriva a 19:30 min, rilasciare la femmina focale dal cilindro e misurare il tempo di associazione per gli ultimi 5 minuti.
15. Interrompere la misurazione del tempo di associazione quando il timer raggiunge 24:30 min e terminare l'esperimento. Scrivere le volte associazione per entrambi i maschi virtuali e procedere con l'analisi.

6. dei dati di misura

1. Misurare il tempo di associazione durante la prima e la seconda parte (prima di e dopo stimoli sono commutato) di ogni test di mate-scelta, quando la femmina focale è consentita di scegliere tra i due maschi.
   Nota: Avviare la misurazione quando la femmina attraversa la linea di confinare la zona scelta con la testa e l'opercolo. Interrompere la misurazione quando la testa e l'opercolo sono all'esterno della zona scelta.
2. Riassumere associazione tempo misurato per ogni uomo nella prima e seconda parte di un compagno-scelta test e determinare quale maschio era comodo.
   Nota: Il maschio preferito è determinato come quello che la femmina focale speso più del 50% del tempo totale che ha trascorso in entrambe le zone di scelta all'interno di un test di mate-scelta. Per l'analisi, tempo di associazione è spesso tradotta in punteggi di preferenza (valore relativo compagno-scelta), che è definito come il tempo trascorso di una femmina di focale con un uomo in divisa per il tempo che ha trascorso con entrambi i maschi nelle zone mate-scelta.
3. Calcolare se focale femmine mostrano una polarizzazione di lato durante la prova di mate di primo-scelta e prevenute femmine di escludere dall'analisi finale.
   Nota: Focale femmine sono considerate essere polarizzato a lato se hanno speso più del 90% del tempo totale (entrambe le metà del test primo mate-scelta) nella stessa zona scelta, anche dopo la posizione di maschio è stata commutata. Sua scelta per un uomo è quindi considerato come lato prevenuto e la versione di prova è terminato.
4. Misurare la lunghezza standard di ogni femmina focale (SL).
   Nota: Per evitare pesce viene stressato durante gli esperimenti, misurazioni sempre dopo la cessazione di una prova sperimentale.

Representative Results

In seguito il protocollo, abbiamo usato FishSim per creare animazioni al computer di virtuale sailfin molly maschi e femmine. Abbiamo usato ulteriormente la toolchain per presentare animazioni per vivere le femmine focale in una situazione di scelta binaria per eseguire un esperimento MCC secondo la procedura sperimentale descritta in Figura 1 e 5 del protocollo.

Al fine di determinare se le femmine focale copiato la scelta della femmina modello virtuale, abbiamo misurato il tempo di associazione di una femmina focale per ogni maschio all'interno del test di mate-scelta di primo e secondo durante gli esperimenti. Diversi parametri in genere vengono analizzati utilizzando l'associazione ora ottenuto nel primo e il secondo compagno-scelta test per ogni trattamento e il controllo di coerenza di scelta. Come i dati vengono analizzati non è associato a uno specifico test statistici ma può essere fatto in vari modi (ad es., parametrici non parametrici test, misure ripetute ANOVA, modelli statistici) e può dipendere la struttura finale dei dati. Per la nostra analisi di dati, abbiamo usato R 3.2.2⁶². Abbiamo caricato i dati grezzi che abbiamo ottenuto nel nostro esperimento, nonché il R-codice abbiamo usato per la nostra analisi di Figshare (doi: 10.6084/m9.figshare.6792347).

Nello studio corrente, abbiamo creato 15 femmine di diverso modello virtuale con una macchia gravid per trattamento 1 e identico modello 15 femmine senza macchia per trattamento 2. Tutte le femmine di modello avevano una lunghezza standard virtuale (SL) di 50 mm. La relativa zona spot gravid era 4,7% della superficie corporea totale (escluse pinne; come misurato con v1.51j8 ImageJ) per tutte le donne in trattamento 1. Inoltre, abbiamo creato 30 maschi virtuale diverso stimolo presentati durante le prove di mate-scelta, permettendo ad abbinamenti unici stimoli maschio 15. Stimolo i maschi hanno avuti un SL virtuale tra 41-45 mm. Abbiamo effettuato 15 prove per ogni trattamento e il controllo di coerenza di scelta. Abbiamo testato un numero totale di discendente di 55 femmine focale dal vivo da mollies sailfin selvatici catturati su Mustang Island vicino a Corpus Christi, TX, Stati Uniti d'America nel 2014. Tutte le femmine focale erano adulti maturi e sono state testate solo una volta. Due femmine dovevano essere escluse a causa di problemi tecnici durante i test. Una femmina è stato escluso dovuto lo sforzo dato che lei non ha fatto acclimatare alla situazione di prova ed era troppo paura di entrare in una zona scelta. Il controllo per il bias di lato in pesce focale (passo di protocollo 6.3) necessaria che escludiamo ulteriori sette femmine dall'analisi finale dovuto i loro pregiudizi di lato nel test primo mate-scelta. Complessivamente, abbiamo analizzato un totale di n = focale 15 femmine per ogni trattamento e il controllo. Focale femmine hanno avuti una media SL di 32 ± 5 mm in trattamento 1, 33 ± 5 mm in trattamento 2 e 33 ± 3 mm nel controllo di coerenza di scelta. Abbiamo confrontato la lunghezza standard (SL) di focale femmine attraverso trattamenti e il controllo utilizzando un test di somma di Kruskal Wallis per rivelare dati indipendenti che SL non hanno differito fra trattamenti e il controllo (prova di somma rigogliosa di Kruskal Wallis: n = 45, df = 2, χ² = 0.329, p = 0.848).

Il più importante parametro misurato in un esperimento MCC è tempo di associazione della femmina focale per ogni maschio (passo 6.1 del protocollo). Tempo di associazione è una misura indiretta di preferenza compagno femminile nel pesce^63,64,65,66 e una misura ben consolidata per determinare la scelta del compagno in sailfin mollies quando nessun contatto diretto è fornito di^{12,48,61,67,68}. Per ogni trattamento e il controllo, abbiamo usato prima associazione tempo per analizzare se la motivazione scelta ha differito da fra le prove di mate-scelta. Scegliendo la motivazione è definito come il tempo totale trascorso una femmina di focale in entrambe le zone di scelta all'interno di un test di mate-scelta. Tuttavia, un cambiamento nella scelta di motivazione non riflette necessariamente un cambiamento nella preferenza per ogni uomo. Se la motivazione di scelta è significativamente differente tra le due prove di mate-scelta è obbligatorio utilizzare punteggi di preferenza invece di tempo assoluto associazione, per un'ulteriore analisi garantire la comparabilità all'interno e fra i trattamenti (Vedi protocollo punto 6.2 ). Nel nostro studio, scegliendo la motivazione di focale femmine prima e dopo l'osservazione di una femmina di modello virtuale interagire sessualmente con un uomo non ha differito in trattamento 1 (firmato di Wilcoxon prova rigogliosa: n = 15, V = 44, p = 0.379) e nel controllo per scelta coerenza ( Firmato di Wilcoxon prova rigogliosa: n = 15, V = 42, p = 0,33). Tuttavia, scegliendo la motivazione era significativamente più alto dopo l'osservazione di una femmina di modello virtuale senza macchia gravid interagire sessualmente con un uomo in trattamento 2 (firmato di Wilcoxon prova rigogliosa: n = 15, V = 22, p = 0,03).

Il determinante più importante del verificarsi o meno di MCC è un aumento significativo nei punteggi di tempo trascorso/preferenza per il maschio non preferite preventivo dal primo alla seconda mate-scelta di prova²². Trasferito in una situazione naturale, un aumento del tempo trascorso con il maschio non preferite preventivo, di conseguenza aumenta la probabilità che una donna si accoppierà con quel uomo. Di conseguenza, l'analisi principale confrontato i tempi assoluti o i punteggi di preferenza per il maschio non preferite precedente tra le due prove di mate-scelta. Questa analisi deve essere fatto separatamente per ogni trattamento e il controllo. Poiché nel nostro studio, scegliendo motivazione differiva nel trattamento 2, abbiamo usato gol di preferenza per il maschio di stimolo inizialmente non preferite, invece di tempo assoluto associazione, per determinare se questi punteggi modificati tra il prima e il seconda compagno-scelta verificare quando è stati forniti informazioni pubbliche, rispetto al trattamento di controllo in cui le informazioni pubbliche erano assente.

Per questo, montiamo un modello lineare effetto misto (LME) con la funzione di lme dal pacchetto 'nlme'⁶⁹ con punteggio di preferenza per il maschio non preferite preventivo (pref_NP) come la variabile dipendente. Abbiamo incluso la prova di mate-scelta (Mtest: M1, M2) e trattamento (trattamento: non spot, nessun punto, controllo) come fattori fissi, così come la lunghezza standard della femmina focale (SL) come covariata. Per tenere conto per la progettazione di misure ripetute, identità femminile focale (ID) è stato incluso come un fattore casuale. Ci interessava soprattutto se l'effetto del compagno-scelta test era diverso tra trattamenti; di conseguenza, abbiamo incluso un'interazione tra la prova di mate-scelta e il trattamento nel nostro modello. Abbiamo condotto due confronti ortogonali per "trattamento" usando la funzione contrasti⁷⁰. Abbiamo impostato i contrasti del modello (1) per confrontare il controllo contro la media di tutti i trattamenti nel quale qualsiasi modello virtuale femmina è stato presentato durante l'osservazione [controllo >> (posto, nessun punto)] e (2) per confrontare il trattamento mostrando un modello virtuale femminile con spot contro quello senza macchia (spot >> nessun punto). Un plot dei residui standardizzati di un fattore contro i valori di misura ha rivelato Eteroschedasticità delle varianze residue per "Mtest". Di conseguenza, abbiamo incluso una funzione di pesi utilizzando la classe varIdent della funzione lme per consentire per varianze diverse per ogni livello di "Mtest"^71,72. Abbiamo usato il pacchetto R 'phia'⁷³ per un'analisi post hoc, con la correzione di Bonferroni Holm dei termini di interazione significativa. Abbiamo ispezionato ipotesi di modello (Q/Q-piazzole, residui, residui contro i valori di misura) per tutti i modelli visivamente⁷⁴. Abbiamo confrontato ulteriormente la distribuzione dei residui contro una distribuzione normale utilizzando il test di Shapiro-Wilk normalità. I p-valori specificati sono stati considerati significativi se p ≤ 0,05.

I risultati di questa analisi sono riportati in figura 7A e tabelle 1 e 2. Abbiamo trovato un'interazione significativa fra M2 e il contrasto "[controllo >> (posto, nessun punto)]" per i punteggi di preferenza del maschio non preferite preventivo (LME: df = 42, t =-2.74, p = 0,009). Tuttavia, gol di preferenza non sono stati colpiti da focale SL femminile. Ulteriore analisi post hoc del termine di interazione ha rivelato una differenza significativa dei punteggi di preferenza del maschio non preferite preventivo in M2 nel trattamento 1 (spot: df = 1, χ² = 30.986, p < 0,001) e trattamento 2 (nessun punto: df = 1, χ² = 19,957, p < 0,001), ma non per il controllo (χ²-prova: df = 1, χ² = 2,747, p = 0.097). Qui, i nostri risultati dimostrano che, come previsto per MCC, Spartiti di preferenza per il maschio virtuale non preferite preventivo aumentata significativamente da M1 a M2 dopo focale femmine erano state presentate con la scelta del compagno simulato di una femmina di modello virtuale. Abbiamo trovato questo effetto in entrambi i trattamenti, ma non sono sotto il controllo di coerenza di scelta. Invece, nel controllo dove nessuna donna modello era presente durante il periodo di osservazione, le femmine focale erano coerenti nella loro scelta di compagno per un uomo.

Fattori	Inferiore	Stima	Superiore	SE	DF	t-valore	valore di p
(Intercettazione)	0,046	0,339	0,632	0.145	42	2.336	0,024
M2	0.207	0.296	0,384	0.044	42	6.750	< 0,001
→ (spot, nessun punto) di controllo	-0.041	-0.012	0,017	0,014	41	-0.852	0.4
Non spot → nessun punto	-0.093	-0.043	0,008	0.025	41	-1,715	0.094
SL	-0.012	-0.003	0,006	0,004	41	-0.747	0,459
M2 x [controllo → (spot, nessun punto)]	-0.148	-0.085	-0.023	0,031	42	-2,743	0,009
M2 x (non spot → nessun posto)	-0.067	0,042	0.15	0,054	42	0,777	0,441

Tabella 1. LME stima per gli effetti sui punteggi di preferenza per il maschio di virtuale precedente non preferite. Punteggio di preferenza per lo stimolo maschio virtuale non preferite precedente era la variabile dipendente in tutto. Dato sono stime ± errore standard e intervalli di confidenza inferiore/superiore, gradi di libertà, valori di t e p-valori per ogni fattore fisso. Intercettare le stime rappresentano la grand media di tutti i trattamenti. I confronti ortogonali di trattamenti sono indicati. Se i trattamenti vengono abbinati tra parentesi, i valori medi di questi trattamenti sono utilizzati nei confronti. La categoria di riferimento di intercettazione per il fattore "M2" è "M1". P-valori significativi (p < 0,05) sono stampati in grassetto. M1 = primo mate-scelta test, M2 = seconda scelta-test, SL = lunghezza standard delle femmine focale. 90 osservazioni con n = 15 femmine focale per ogni trattamento.

Fattore casuale	Varianza	SD
ID ((intercetta))	1.464x10-10	1.21x10-5
Residuo	1.859x10-2	0.1364

Tabella 2. Componenti di varianza LME per focale ID femminile. Varianza e deviazione standard per l'effetto casuale "focale femmina ID" e i residui sono dati.

Figura 7: risultati di MCC virtuale sperimentare manipolazione qualità femminile del modello di visual assenza o in presenza di una macchia gravid. (A) punteggi di preferenza per il maschio (preventiva) stimolo virtuale non preferite in M1 e M2 per entrambi i trattamenti e il controllo. (B) cambiamento di preferenza da M1 a M2 (copia Punteggio) per il precedente non preferite virtuale maschio nei trattamenti e nel controllo. La linea tratteggiata non raffigura nessun cambiamento nella preferenza, valori positivi mostrano un aumento nella preferenza e valori negativi mostrano una diminuzione della preferenza. Punti grigi A e B raffigurano dati grezzi di ogni femmina di focale. (C) numero di inversioni di mate-scelta in M2 per ogni trattamento e il controllo. M1 = primo mate-scelta test, M2 = seconda prova di mate-scelta, ns = non significativo, * = p < 0,05, * * = p < 0.01, * * * = p < 0,001. N = 15 per entrambi i trattamenti e il controllo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per ottenere ulteriori informazioni su se un effetto copia potrebbe essere più o meno forte a seconda del rispettivo trattamento, è stato un confronto tra la copia di punteggi e il numero di inversioni di mate-scelta tra i diversi trattamenti e il controllo condotto. Di conseguenza, abbiamo analizzato ulteriormente se copiare Spartiti per il maschio non preferite precedente erano differenti attraverso trattamenti. Il Punteggio di copia per un uomo descrive il cambiamento nella preferenza femmina per un uomo dalla prima alla seconda prova di mate-scelta. Il Punteggio di copiatura è definito con il Punteggio di preferenza di un uomo nel test secondo compagno-scelta meno il Punteggio di quello stesso uomo nel test primo mate-scelta. Copia i punteggi compresi tra -1 e + 1 e possono essere valori positivi o negativi, in cui i valori negativi descrivono una diminuzione della preferenza e valori positivi un aumento nella preferenza per quel uomo. Qui, ci si adatta un LME con la copia di Punteggio ottenuto (copy_NP) come la variabile dipendente, trattamento come un fattore fisso, focale SL femminile come covariata e zona focale di donna come un fattore casuale. Qui, abbiamo condotto lo stessi due confronti ortogonali per "trattamento" come descritto sopra.

Come vi mostriamo in figura 7B , tabelle 3 e 4, abbiamo trovato un significativamente più alto punteggio per il maschio non preferite previo la copia nei trattamenti con una femmina di modello virtuale rispetto al controllo (LME: df = 20, t =-2.833, p = 0,01) ma non significativo differenza tra i trattamenti (LME: df = 20, t = 0,618, p = 0.544). Gol di copiatura non sono stati colpiti da focale SL femminile.

Fattori fissi	Inferiore	Stima	Superiore	SE	DF	t-valore	valore di p
(Intercettazione)	-0.889	-0.081	0,727	0,389	21	-0.208	0,837
→ (spot, nessun punto) di controllo	-0.153	-0.088	-0.023	0,031	20	-2.833	0,01
Non spot → nessun punto	-0.079	0,033	0,146	0,054	20	0,618	0,544
SL	-0.013	0,011	0,035	0,011	20	0.991	0,333

Tabella 3. LME stima per gli effetti sulla copiatura Spartiti per il precedente uomo virtuale non preferite. Copia punteggio per lo stimolo maschio virtuale non preferite precedente era la variabile dipendente in tutto. Dato sono stime ± errore standard e intervalli di confidenza inferiore/superiore, gradi di libertà, valori di t e p-valori per ogni fattore fisso. Intercettare le stime rappresentano la grand media di tutti i trattamenti. I confronti ortogonali di trattamenti sono indicati. Se i trattamenti vengono abbinati tra parentesi, i valori medi di questi trattamenti sono utilizzati nei confronti. P-valori significativi (p ≤ 0,05) sono stampati in grassetto. SL = lunghezza standard delle femmine focale. 45 osservazioni con n = 15 femmine focale per ogni trattamento.

Fattore casuale	Varianza	SD
spot_area ((intercetta))	0,028	0,166
Residuo	0,075	0,275

Tabella 4. Componenti di varianza LME per zona spot femmina focale. Varianza e deviazione standard per l'effetto casuale "spot_area" e i residui sono date.

Inoltre, abbiamo provato se il numero di femmine focale che ha invertito la loro preferenza di mate iniziale in M2 hanno differito da attraverso trattamenti. Mate-scelta inversione è definita come se c'è un cambiamento nella preferenza per un uomo (da meno del 50% a più del 50% del tempo in entrambe le zone scelta) dalla prima alla seconda prova di mate-scelta. Mate-scelta inversione viene conteggiato come un "Sì" (la preferenza per un uomo è stato modificato) o un "No" (la preferenza per un uomo non è cambiato). Qui, abbiamo effettuato un post hoc, pairwise G-test utilizzando la R 'RVAideMemoire'⁷⁵ con la correzione per le prove multiple del pacchetto. Come illustrato in Figura 7, undici su 15 femmine focale invertito loro scelta compagno nel trattamento 1 e dieci femmine invertito la loro scelta di compagno in trattamento 2. D'altra parte, sono stati osservati solo due inversioni nel controllo. Quindi, il numero di femmine focale che ha invertito la loro scelta di mate iniziale a favore il maschio non preferite preventivo in M2 era significativamente più grande in entrambi i trattamenti rispetto al controllo (post hoc G-test pairwise: Spot vs controllo, p = 0,002; nessun posto vs controllo, p = 0,003) ma non significativamente differenti fra i trattamenti 1 e 2 (Post-hoc G-test pairwise: non spot vs nessun punto, p = 0,69).

Discussion

Il posto gravid nelle femmine di molly Poecilia è stata precedentemente descritta per servire come mezzo di annuncio di fertilità verso maschi conspecifici^59,60. Se un luogo gravido può anche fornire informazioni alle femmine conspecifici nel contesto di scelta del compagno non era stato testato finora. Nel presente caso di studio, abbiamo studiato il ruolo potenziale di un posto di gravid come fonte di informazione pubblica per osservare femmine conspecifici nel contesto di MCC. Il nostro studio indica che il punto gravid sembra non essere un segno di qualità del modello femminile per le femmine focale dal vivo quando si decide di copiare la scelta del compagno di una donna di modello virtuale per un uomo virtuale. Le femmine focale copiato la scelta di una femmina di modello virtuale per un uomo virtuale non preferite preventiva indipendentemente dal fatto che la femmina modello aveva un posto gravid o non. Abbiamo non trovato alcuna differenza nella copiatura Spartiti né il numero di inversioni di mate-scelta tra i due trattamenti, che indica che l'effetto copia era altrettanto forte anche se la femmina modello aveva un posto gravido o non. Quando nel controllo (nessuna donna modello presente) è stata fornita alcuna informazione pubblica, focale femmine erano coerenti nella loro scelta di mate. Ciò sostiene che il cambiamento osservato di preferenza all'interno dei trattamenti può essere spiegato dalla presenza di modello virtuale sola femmina, fornire sufficienti informazioni pubbliche per copiare la scelta degli altri.

Anche se la presenza generale e l'entità dello spot gravid sono considerati essere legati al ciclo riproduttivo femmina, con il posto essendo più grande prima del parto e più piccolo o assente dopo parto⁶⁰, osservazioni sistematiche visual della sviluppo di macchie gravid nelle femmine individuali sono ancora dispersi. Inoltre, variazione nella dimensione dello spot gravid può essere alta tra singole femmine con macchie anche di essere completamente assente nelle femmine mature, gravid⁶⁰. Anche se sailfin molly le femmine sono più ricettivi breve dopo parto^59,76, sono in grado di immagazzinare lo sperma per diversi mesi⁵⁷. Di conseguenza, le femmine devono essere sempre esigente per il migliore compagno di qualità. Per quanto riguarda il nostro caso di studio su MCC e le ipotesi testate, concludiamo che un posto gravid non può essere un valido indicatore di qualità femminile del modello a osservare femmine conspecifici. Informazioni sullo stato riproduttivo di una femmina di modello che forse potrebbe ottenere una femmina di osservazione sembrano non essere importante nella decisione di copiare sua scelta o non, almeno tra sailfin mollies.

In particolare, il nostro studio dimostra una procedura altamente standardizzata per visual manipolazione dell'informazione pubblica fornite in MCC esperimenti utilizzando pesce di computer animata. In contrasto con un precedente studio di Benson⁷⁷, che ha iniettato pesci vivi con inchiostro del tatuaggio di manipolare gravid macchie, il nostro metodo fornisce un'alternativa completamente non invasiva per manipolazione visiva. Abbiamo descritto in dettaglio la procedura su come creare e animare mollies sailfin virtuale in FishSim. Abbiamo mostrato ulteriormente come animazione al computer può essere utilizzato per adottare la procedura sperimentale di un classico MCC sperimentare con pesci virtuali per la presentazione verso pesci prova dal vivo in una situazione di scelta binaria.

In seguito il protocollo, identifichiamo i diversi passaggi critici che necessitano di un'attenzione specifica per garantire la corretta gestione della nostra toolchain e il successo dell'esperimento. Poiché animazioni al computer vengono create e presentate utilizzando computer e dispositivi di visualizzazione come monitor di computer, le attrezzature tecniche sempre dovrebbero essere abbastanza buona per garantire un corretto espletamento del flusso di lavoro generale e, soprattutto, la riproduzione della animazione (passi 2, 3 e 5). Quando si utilizzano due o più monitor per la presentazione di stimoli, loro specifiche tecniche devono essere identici. Quando si utilizza il nostro software, la risoluzione del monitor impostata deve essere sempre che della presentazione monitor (v. punto 1.2.1). Impostazione della scena (punto 1.2.) così come il design (passi 1.3. e 1.4.) e animazione (passaggio 2) degli stimoli virtuali dovrebbe sempre essere fatto su un monitor più tardi utilizzato per la presentazione dello stimolo durante gli esperimenti per garantire le corrette dimensioni.

In questo protocollo, ci concentriamo sui passi necessari per creare un insieme di stimoli di pesce (passi 1.3. e 1.4.) per l'uso in una prova di un trattamento (passo 5). Qui, vorremmo sottolineare che è importante creare diversi stimoli diversi pesci e/o animazioni per tenere conto di pseudoreplication^15,78,79 che colpisce l'interpretazione dei dati ottenuti durante gli esperimenti. Con la nostra toolchain, è facile creare vari stimoli di pesce che offre la possibilità di utilizzare un unico insieme di stimoli per ogni prova sperimentale. Nel complesso il numero totale di stimoli necessari dipende la dimensione del campione previsto per ogni trattamento (vedere sezione "Risultati rappresentativi" per informazioni sul nostro studio di caso).

Con la nostra toolchain, abbiamo voluto fornire un processo veloce e facile da creare animazione utilizzando un controller per videogiochi (passaggio 2). In tal modo, il comportamento generale di nuoto del pesce virtuale viene generato automaticamente, basato su video di nuoto dal vivo sailfin mollies⁸⁰. Comportamento di nuoto (compreso il movimento delle pinne e gonopodio) è, pertanto, sintonizzato per l'uso con stimoli virtuali del sailfin mollies in particolare e live-cuscinetto pesce in generale. Oltre al pesce vivo-cuscinetto, un modello aggiuntivo per un Gasterosteus aculeatus fornisce funzioni aggiuntive per il movimento specie-specifico, quali l'innalzamento/abbassamento delle spine dorsali e ventrali.

Funzioni di animazione attualmente fornite dalla nostra toolchain potrebbero non essere sufficiente per ogni pattern comportamentali e specie di pesci. Questo, tuttavia, è compito dell'utente e dipende dalla domanda di ricerca testata. Inoltre, animazione con FishSteering (passaggio 2) ha bisogno di un po' di pratica in anticipo per abituarsi alle funzioni del controller di gioco. Di conseguenza, il processo di animazione è probabilmente il passo che richiede più tempo del protocollo. Un controller di una marca diversa può essere usato qui, ma la funzionalità potrebbe non essere cosi ' dolci e le funzioni dei pulsanti (come specificato nel manuale dell'utente) possono essere diverse o completamente assente. Durante il processo di animazione, solo una funzione di stimolo virtuale (ad esempio, posizione, pinne, gonopodio) possa essere animata in un momento. In primo luogo, il movimento nuoto (posizione) e in seguito ulteriori caratteristiche (ad es., pinne) possono essere aggiunti in modo indipendente. Ti consigliamo di salvare ogni passaggio separatamente. Questo offre il vantaggio che l'utente ha la possibilità di tornare a una versione precedente dell'animazione per modificare una funzionalità specifica, ad esempio mantenendo costante il percorso di nuoto ma cambiando il movimento di pinna dorsale rispetto a una versione precedente. Soprattutto quando si anima di più di un pesce (punto 2.2.), l'ordine in cui pesce stimoli sono animati è molto importante e deve essere determinata in anticipo. Qui, potrebbe essere utile fare riferimento alla biologia delle specie testate. Nel nostro caso di studio, abbiamo simulato il comportamento di corteggiamento del sailfin mollies in cui un uomo è generalmente seguendo una donna⁸¹. Quindi, abbiamo creato il percorso di nuoto della femmina virtuale e aggiunto il percorso per il maschio virtuale seguendo la femmina.

Quando si esegue la procedura sperimentale (passo 5) il tempismo è cruciale per il successo dell'esperimento. I tempi / ci di cui il protocollo (passo 5) derivato da studi con sailfin mollies durate. Sono da considerarsi come suggerimenti e non sono obbligati per il successo generale di sperimentale ma dovrebbero, tuttavia, essere strettamente seguiti durante la procedura. Tempo di acclimatazione può variare tra le specie di pesci e persino i singoli individui e generalmente dovrebbe essere lungo quanto il pesce focale ha bisogno di esplorare l'intera prova serbatoio e ambientarsi al suoi nuovo ambiente. Abbiamo determinato la lunghezza di durata pausa appropriato in discese di allenamento delle procedure sperimentali. La pausa deve essere lunga almeno quanto il tempo necessario per catturare il pesce con il cilindro, così come a piedi e dal serbatoio di prova e computer operativo per rilasciare il pesce dal cilindro. Qui, orari possibilmente variano a seconda della situazione sperimentale specifica in ogni laboratorio e le specie ittiche testati. In ogni caso, lo sperimentatore può modificare singolarmente volte / durate neanche impostando un tempo diverso in FishPlayer (Vedi punto 3.1. 3.) o mediante la creazione di sequenze di animazione con una diversa lunghezza (Vedi punto 2.1).

Lo sperimentatore può migliorare la misurazione del tempo di associazione per ogni test di mate-scelta di implementare un sistema di rilevamento automatizzato, anche se ha bisogno di essere in grado di tracking in tempo reale. Qui, vogliamo anche sottolineare che non c'è nessuna possibilità di avere un osservatore cieco e, quindi, ciechi analisi quando si segue la procedura per testare MCC. Poiché lo sperimentatore non può sapere quale virtuale maschio stimolo sarà il preferito dalla femmina focale prima della prova, lui o lei deve essere consapevole della scelta del pesce focale per riorganizzare l'ordine delle sequenze di animazione di conseguenza (vedere i passaggi 3.2 e 5.10).

Il protocollo che descriviamo qui è specifico di nostra progettazione di studio su MCC in sailfin mollies. Tuttavia, la toolchain utilizzabile anche in combinazione con altri disegni sperimentali con fino a quattro monitor, per la presentazione. In generale, strumenti di animazione computer offrono una vasta gamma di soluzioni per studiare varie domande sul comportamento dei pesci come compagno di scelta, shoaling decisioni o rilevazione di predatore-preda, utilizzando stimoli visivi artificiali. Considerazioni generali di tecniche e concettuale per l'uso di computer animation nella ricerca di comportamento animale dovrebbero essere valutati con attenzione prima di utilizzarlo in esperimenti^2,15. Più importanti per la decisione se computer animazione approcci possono essere implementati in ricerca riguarda le funzionalità visual di specie ittiche testati e se risponde naturalmente verso virtuali stimoli presentati su schermi di monitor. Soprattutto, quando si verifica l'effetto degli aspetti di colore, si noti che monitor schermi raffigurano solo colori come i valori RGB e che questo potrebbe ostacolare o limitare le possibilità di ricerca, anche se uscita di colore RGB può infatti essere regolata⁸². Per alcune specie di pesci, una limitazione potrebbe certamente essere che monitor non emettono lunghezze d'onda UV o che, d'altra parte, alcuni tipi di monitor sono altamente polarizzati che potrebbe essere una limitazione con pesce, sensibile a luce polarizzata per esempio in domande di compagno di scelta⁸³. Pertanto, una convalida per l'efficacia di stimoli presentati come animazioni al computer è necessaria prima di testare qualsiasi ipotesi^{2,12,15,84,85}.

In futuro, nuovi sviluppi nel riconoscimento di rilevamento e azione animale potrebbero rendere possibile creare stimoli virtuali interattivi che reagiscono in tempo reale verso i pesci vivi e simulare il comportamento corrispondente per aumentare massicciamente realismo per osservare pesci ⁸⁶. grazie alla modularità dei ROS sottostante, dispositivi esterni come fotocamere possono essere integrati nella toolchain, purché l'utente disponga di adeguate competenze di programmazione. Un primo tentativo di successo dimostrato che FishSim generalmente può essere usato per simulare stimoli pesce virtuale interattivo dall'estensione di un 3D in tempo reale di monitoraggio sistema^87,88,89. Durante l'evento di comunicazione della scienza "Molly sa meglio" (https://virtualfishproject.wixsite.com/em2016-fisch-orakel), siamo stati in grado di dimostrare che pesce virtuale può essere programmato per seguire dal vivo pesce focale sullo schermo ed eseguire comportamento di corteggiamento secondo un algoritmo predefinito. Inoltre, tali sistemi di monitoraggio in tempo reale potrebbero essere utilizzati per misurare il tempo di associazione automaticamente per migliorare la procedura sperimentale. Questa funzionalità non è ancora incluso nella versione corrente di FishSim ma è soggetto a sviluppo futuro.

In conclusione, l'uso di computer animation nella ricerca di comportamento animale è un promettente approccio quando i metodi convenzionali richiederebbe trattamento invasivo di animali vivi per manipolare l'espressione di un tratto visual o pattern comportamentali. Manipolazione delle animazioni al computer consente un elevato grado di controllo e standardizzazione rispetto all'utilizzo di pesce di prova dal vivo, soprattutto, poiché offre anche soluzioni per manipolare il comportamento che è molto limitati o addirittura impossibili in pesci vivi. Ulteriormente, in linea con il principio-3R e simili linee guida per l'uso di animali nella ricerca e nell'insegnamento di^90,91, questa tecnica ha il potenziale per 'ridurre la ' e 'sostituire' prova dal vivo animali pure quanto a 'perfezionare' sperimentale procedure di ricerca.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hardware
2x 19" Belinea LCD displays	Belinea GmbH, Germany	Model 1970 S1-P	1280 x 1024 pixels resolution
1x 24" Fujitsu LCD display	Fujitsu Technology Solutions GmbH, Germany	Model B24-8 TS Pro	1920 x 1080 pixels resolution
Computer			Intel Core 2 Quad CPU Q9400 @ 2.66GHz x 4, GeForce GTX 750 Ti/PCIe/SSE2, 7.8 GiB memory, 64-bit, 1TB; keyboard and mouse
SONY Playstation 3 Wireless Controller	Sony Computer Entertainment Inc., Japan	Model No. CECHZC2E	USB-cable for connection to computer
Glass aquarium			100 cm x 40 cm x 40 cm (L x H x W)
Plexiglass cylinder	custom-made		49.5 cm height, 0.5 cm thickness, 12 cm diameter; eight small holes (approx. 5 mm diameter) drillt close to the end of the cylinder lower the amount of water disturbance while releasing the fish
Gravel
2x OSRAM L58W/965	OSRAM GmbH, Germany		Illumination of the experimental setup
2x Stopwatches
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
ubuntu 16.04 LTS			Computer operating system; Download from: https://www.ubuntu.com/
FishSim Animation Toolchain v.0.9			Software download and user manual (PDF) from: https://bitbucket.org/EZLS/fish_animation_toolchain
GIMP Gnu Image Manipulation Program (version 2.8.22)			Download from: https://www.gimp.org/