Этот протокол обеспечивает эффективный и недорогой способ обнаружить вирус Зика или контролировать цели в образцах мочи и сыворотки или комаров, обратная транскрипция цикла опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа). Этот метод не требует РНК изоляции и может быть сделано в течение 30 мин.
Заражение вирусом Зика (ZIKV) может быть бессимптомным у взрослых, однако, инфекции во время беременности может привести к выкидышу и тяжелых неврологических врожденных дефектов. Цель настоящего Протокола заключается в быстро обнаружить ZIKV в образцах человека и комаров. Текущий золотой стандарт для обнаружения ZIKV является количественная обратная транскрипция ПЦР (qRT ПЦР); Обратная транскрипция цикла опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа) может позволить для более эффективных и недорогостоящих тестирования без необходимости дорогостоящего оборудования. В этом исследовании RT-лампа используется для обнаружения ZIKV в различных биологических образцов в течение 30 мин, без первой изолировать РНК из образца. Этот метод показан с помощью ZIKV инфицированных пациентов мочи и сыворотки и инфицированных комаров образцы. 18s рибосомных рибонуклеиновой кислоты и актина используются в качестве элементов в образцах человека и комаров, соответственно.
В 2015 году Зика вирус (ZIKV) получил видные глобального внимания как инфекционное заболевание озабоченность, поскольку инфекции во время беременности был связан с выкидыш, мертворождение, тяжелые неврологические врожденных дефектов, включая микроцефалия, а также другие врожденные врожденные дефекты1. В редких случаях ZIKV был связан с синдром Гийена-Барре. ZIKV преимущественно передается комарами Aedes ; Однако он также может распространяться через половой контакт1. Учитывая, что инфекции с ZIKV протекает бессимптомно у большинства людей или подарки с мягким гриппоподобные симптомы, которые совпадают с симптомами инфекции других arborviruses1, существует необходимость совершенствования методов для быстрого и экономически обнаружения ZIKV на экран как людей, так и местных комаров населения.
Количественная обратная транскрипция ПЦР (qRT ПЦР) является надежным методом для обнаружения ZIKV; Однако этот метод требует дорогостоящее специализированное оборудование, квалифицированного персонала и изоляции РНК из образца интерес. Обратная транскрипция цикла опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа) является одношаговый метод амплификации нуклеиновых кислот, основанный на технологии PCR, которая требует только одной температуры инкубации за счет использовании теплолюбивых ДНК-полимеразы с нити Перемещение свойств. Это обходит необходимость Термоциклер и уменьшает продолжительность времени, необходимого для завершения анализа. Дополнительные преимущества RT-Лампа высокая специфичность и чувствительность, надежность в диапазоне рН и температуры и сопротивление многих ПЦР ингибиторы2. Он имеет сравнительно низкую стоимость и реагенты стабильны при комнатной температуре. Учитывая эти характеристики, RT-лампа может быть развернут в лаборатории или в поле. Таким образом лампа реакции были разработаны для обнаружить широкий спектр патогенов и других видов инфекции3,4,5. Цель протокола RT-лампа, описанных в данном документе является обнаружить ZIKV без изоляции РНК в человеческой сыворотки и мочи образцов, а также как единый инфицированных комаров в течение 30 мин через RT-лампа. Этот метод может использоваться для замены qRT-PCR как это чувствительной, быстрое диагностический инструмент, который работает быстро и в настройках вне лаборатории.
Пробирная ZIKV RT-лампа, описанные в этой бумаге работ с использованием как человека, так и комаров образцы6. Предел обнаружения был примерно 1 генома эквивалент6, которое должно быть достаточно, поскольку типичная вирусная нагрузка симптоматическим ZIKV инфицирова…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Морин и Рональд Хирш семейный благотворительный вклад и области нейронаук институт, Святой Марии штата Мичиган. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи. Мы также благодарим д-р Бернадетт Zwaans и Илия Уорд за их критического обзора рукописи.
Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |