Summary
نقدم هنا، على بروتوكول لإعداد شرائح مملوءة [اغروس] البشرية دقة قطع الرئة من أنسجة المريض مستأصل مناسبة لتوليد الثقافات أنسجة الرئة 3D لأمراض الرئة البشرية النموذجية في الدراسات البيولوجية والطبية الحيوية.
Abstract
ترجمة اكتشافات جديدة للأمراض التي تصيب البشر محدود بتوافر النماذج المستندة إلى الأنسجة البشرية للمرض. الرئة دقة قطع شرائح (بكلس) يستخدم كثقافات أنسجة الرئة 3D (3D-الصلب) تمثل أنيقة ونموذج الثقافة الخلية 3D بيولوجيا وثيق الصلة، التي تشبه جداً الأنسجة في الموقع بسبب تعقيدها، الميكانيكا الحيوية والجزيئية تكوين. تشريح الأنسجة يتم تطبيقها على نطاق واسع في مختلف النماذج الحيوانية. يمكن استخدام 3D-الصلب المستمدة من بكلس البشرية لتحليل الردود على أدوية جديدة، مما قد يساعد أيضا فهم أفضل للآليات والآثار الفنية للمخدرات في الأنسجة البشرية. إعداد بكلس من عينات أنسجة الرئة مستأصل جراحيا المرضى، الذين عانوا من الرئة lobectomy، يزيد من إمكانية الوصول للمريضة والأنسجة بيريتومورال. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلاً لتوليد بكلس البشرية من أنسجة الرئة المريض لينة مطاطا مستأصل جراحيا. [اغروس] قدم في الفضاء للفيسيولوجيا من ريسيكتاتيس، ومن ثم الحفاظ على بنية الرئة وزيادة صلابة للأنسجة، هو أمر حاسم لتقطيع اللاحقة. 500 ميكرومتر سميكة شرائح أعدت من كتلة الأنسجة مع فيبرتوم. اللكمات خزعة مأخوذة من بكلس ضمان أحجام عينات الأنسجة قابلة للمقارنة وكذلك زيادة كمية عينات الأنسجة. ويمكن تطبيق ثقافات أنسجة الرئة الذي تم إنشاؤه في مجموعة متنوعة من الدراسات في علم الأحياء الرئة البشرية، بما في ذلك الفيزيولوجيا المرضية والآليات من أمراض مختلفة، مثل عمليات تليفية في المستويات الخلوية أفضل في (sub-). فائدة أعلى 3D--LTC السابقين فيفو نموذج هو تمثيلها الوثيق في الرئة البشرية في الموقع فيما يتعلق بهندسة الأنسجة 3D وتنوع نوع الخلية وتشريح الرئة، فضلا عن إمكانية تقييم للأنسجة من المرضى الفردية، التي هو ذات الصلة لمواصلة تطوير استراتيجيات جديدة للطب الدقة.
Introduction
أمراض الرئة المزمنة والحادة سبب رئيسي للاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم1. للمرضى الذين يعانون من أمراض الرئة المزمنة مثل مرض الانسداد الرئوي (COPD)2والربو الشديد3، وسرطان الرئة4 و أمراض الرئة متني منتشر5، العلاجات العلاجية حاليا غير متوفرة. على الرغم من أن الدراسات في النماذج الحيوانية لأمراض الرئة أدت إلى تعميق فهم المرض باثوميتشانيسمس6 وأدت إلى تحديد المحتملة الأهداف العلاجية رواية7،،من89، يحمل هذه النماذج ذات الصلة الاختلافات البيولوجية والفسيولوجية بالمقارنة مع10من البشر. للتغلب على هذه التناقضات بين البيولوجيا مورين والبشرية فضلا عن علم التشريح، البشرية السابقين فيفو زراعة أنسجة الرئة 3D تستخدم أنظمة (3D--LTC) في مختلف مجالات البحوث الطبية الحيوية. وتستند هذه النظم الثقافة 3D--LTC الرئة دقة قطع شرائح (بكلس). جيل بكلس السابقين فيفو يسمح تحليل أبعاد المكانية الثالث، الذي يسمح لتحقيق العلاقات المكانية والوظيفية للخلايا في كامل الحويصلات الهوائية والخطوط الجوية11، فضلا عن إينتيرستيتيوم، والمفرج و mesothelium. جدير بالذكر أن يتم بكلس السابقين فيفو نماذج متعددة الخلايا، مما يعني أنها تحتوي على خلايا وظيفية أكثر من الرئتين في الموقع وهكذا وثيقة تمثل البيئة البيولوجية الأصلية للخلايا وبالتالي التغلب على محدودية خلية خلية والخلية-مصفوفة التفاعل في 2D معظم خلية ثقافة النهج. وحتى الآن، السابقين فيفو مورين بكلس واستخدمت نموذج الأمراض الرئوية، ومثل هذا المرض12، تليف الرئة13، وسرطان الرئة14، والعدوى الفيروسية15،16، وخلل التنسج القصبي الرئوي17، و 18من الربو. غير أن نسبة كبيرة من العلاجات المخدرات الرواية في أمراض الرئة البشرية التي جرى التحقيق في التجارب السريرية لا تترجم إلى العيادة بسبب افتقارها إلى الفعالية أو السلامة، assumingly نظراً لبعد خلافات كبيرة بين الإنسان و مورين البيولوجيا والمرض19،،من2021.
على مدى السنوات العديدة الماضية، استخدمت بكلس البشرية إلى حد كبير لتقييم الرئة السمية للمواد الكيميائية والمخدرات. إلا في الآونة الأخيرة، وقد استخدم أنسجة الرئة البشرية من المرضى الذين يعانون من هذا المرض22،23،24من الربو، و تليف الرئة25، متابعة الدراسات الفيزيولوجية المرضية والدوائية. استخدام مادة مستأصل الجهاز المريض وتوليد بكلس منه، واحد يمكن أن الخص بصمات الأمراض الرئيسية أنسجة ثلاثية الأبعاد معقدة بيئة22 يمثلون وصيانة معظم التنوع الخلوية أصلية للجهاز. وعلاوة على ذلك، أبدى الأنسجة المريضة تطبيقها في مجموعة متنوعة من الأجهزة التجريبية لمحاكاة التغييرات مثل مرض في الكبد والأمعاء والكلى26،27،،من2829.
ومع ذلك، معالجة أنسجة الرئة لا تزال صعبة لعدة أسباب. خلافا للأنسجة الصلبة، يميل إلى الانهيار دون تهوية الرئة الأصلية حمة ومعارض أقل صلابة الأنسجة. هذه الخصائص تعوق تشريح الأنسجة. وهكذا، بملء الخطوط الجوية والفضاء السنخية مع [اغروس] نقطة انصهار منخفضة يحافظ على بنية الرئة الأصلية ويوفر صلابة اللازمة لدقة قطع تشريح الرئتين مورين والبشرية30. ريسيكتاتيس الرئة البشرية التي تبرعت بها لأغراض البحث بطبيعتها تشريحيا ووراثيا وفسيولوجيا عاليا المتنوعة، وبالتالي كثيرا ما عرض تقلب بين مريض عالية عند إجراء تجارب25. على النقيض من الفص كله أو explants الرئة كلها، عينات الرئة مستأصل عن طريق جراحة الصدر ليس بالضرورة اتبع الأجزاء التشريحية و، ولذلك تتطلب أعدادا خاصا. في هذه المقالة، نحن نقدم بروتوكول مفصل والأمثل لتوليد بكلس البشرية من أنسجة الرئة مستأصل وزراعة اللاحقة والاستخدام التجريبي لأمراض الرئة النموذجية.
Protocol
وأقر استعمال الأنسجة البشرية لجنة الأخلاقيات التابعة لجامعة لودفيغ ماكسيميليان [ميونيخ، ألمانيا (المشروع رقم 455-12)]. وقدمت ريسيكشنز الرئة خالية من الأورام البشرية المصرف البيولوجي أسكليبيوس "أمراض الرئة" (Gauting، ألمانيا، المشروع رقم 333-10).
ملاحظة: وتتم جميع إجراءات الإنتاج بكلس البشري (الشكل 1) تحت غطاء الاندفاق الصفحي عقيمة.
1-إعداد الأدوات والمواد
-
تحضير جميع المواد لتضخم أنسجة الرئة مع [اغروس] كما هو موضح أدناه.
- إعداد متوسطة زراعة: تعديل النسر المتوسطة (دميم) F-12 دولبيكو تستكمل مع لام الجلوتامين و 10,000 IE البنسلين، 10,000 أي ستربتوميسين وحبيس المصل البقري الجنين 0.1% (v/v).
ملاحظة: ويستخدم المتوسط عند 37 درجة مئوية. - إعداد علبة معدنية معقمة مغطاة بالمناديل الورقية. ضع طبق ثقافة خلية عقيمة 15 سم على صينية.
- ملء الطبق ثقافة الخلية مع 15 مل من زراعة المتوسطة.
- تحضير حلاً [اغروس] 3% (w/v) بتذويب المقدار المناسب من [اغروس] نقطة انصهار منخفضة بحد أدنى 30 مل من زراعة المتوسطة.
- الحرارة الحل في فرن ميكروويف حتى الغليان. بارد الحل [اغروس] إلى 42 درجة مئوية في حمام مائي. يبقى الحل [اغروس] السائلة المخزنة في حوض ماء.
- إعداد عدة أنابيب مخروطية 50 مل مليئة سائل [اغروس].
- إعداد متوسطة زراعة: تعديل النسر المتوسطة (دميم) F-12 دولبيكو تستكمل مع لام الجلوتامين و 10,000 IE البنسلين، 10,000 أي ستربتوميسين وحبيس المصل البقري الجنين 0.1% (v/v).
2-أنسجة الرئة مستأصل
- مخزن الطازجة الورم أنسجة الرئة مجاناً من ريسيكتاتيس لوبيكتومي مباشرة بعد بتر في المتوسطة و دميم-12 في 4 درجات مئوية حتى الخطوة 3.
- لا يتجاوز الوقت الاسكيمية الباردة من ح 4-8 قبل تجهيزها.
3-التفتيش والاختيار من نسيج مستأصل قبل الملء [اغروس]
- رفع الأنسجة من المتوسط بالملقط. تفاديا لأي ضرر للأنسجة، وبخاصة إلى الجنب، التعامل مع الأنسجة بملاقط في الخطوط الجوية فقط.
- نقاط نوعية الأنسجة بمعايير "الرئة [اغروس] ملء نقاط" محددة في الجدول 1.
- انتقل إلى الخطوة 4 إذا هو سجل الجودة الأنسجة أعلى أو تساوي 72. لا تستمر إذا هو سجل الجودة الأنسجة أقل من 60, مع [اغروس] سد.
ملاحظة: إذا كانت النتيجة الأنسجة بين 60 و 68، ملء [اغروس] وتشريح الأنسجة لا يزال قد تسفر عن نتائج معقولة، وقرارا نهائياً لإطالة أمد التجربة يجب أن يكون حالة بحالة. ومع ذلك، فشل أنسجة الرئة التي لا تفي بالمتطلبات المذكورة أعلاه، معظمها في [اغروس] ملء.
4-الرئة الأنسجة التضخم بملء [اغروس]
- رفع الأنسجة من وسائط التخزين واستنزاف الإعلامية الزائدة من الأنسجة. نقل أنسجة الرئة إلى الطبق 15 سم الثقافة أعدت في 1.1.2.
- ملء المحاقن 30 مل مع [اغروس] نقطة انصهار منخفضة من 1-1-3.
- إعداد قسطرة وريدية المحيطية عن طريق إزالة سدادي وإرفاقه بحقنه 30 مل
- التعرف القصبات الهوائية (0.5-3 مم في القطر) في الأنسجة التي يتم التهوية قسما سليمة من الأنسجة (انظر الشكل 2).
- إدراج القنية في القصبات الهوائية المحددة (0.5-3 مم).
- ادفع برفق قنية بلطف إلى الأمام قدر الإمكان.
- ختم القصبات حول القنية بواسطة ضغط جدار الشعب الهوائية حول القنية بالملقط، من الناحية المثالية لقط أي الشريان الرئوي متجاورة في نفس الوقت.
- أوككلودي الخطوط الجوية الإضافية الأخرى مع المشبك جراحي لمنع تسرب من خلال هذه الخطوط الجوية [اغروس].
- رفع الأنسجة بالملقط من طبق الثقافة.
- يدوياً من أجل [اغروس] مع المحاقن لا أسرع من 0.3 مل/s. قد تختلف السرعة [اغروس] ملء ما يتراوح بين 0.05 و 0.3 مل/ثانية بسبب المقاومة غير متجانسة من الخطوط الجوية و/أو انخماص.
-
إذا لوحظ مقاومة عالية أثناء التعبئة أو [اغروس] تسرب من الأنسجة، إعادة محاولة الإجراء بأكمله مع القصبات الهوائية مختلفة من الخطوة 4، 4. القيام باستكشاف الأخطاء وإصلاحها كما هو موضح أدناه.
ملاحظة: درجة ملء [اغروس] يعتمد اعتماداً كبيرا على وضع القسطرة في الأنسجة والاختراق العميق لنتائج القسطرة في ملء [اغروس] مخروط صغير مثل مناطق (*) لانسجة الرئة (الشكل 2).- في حالة المقاومة العالية، في محاولة لتحديد المواقع يؤدي قسطرة لشغل مناسب لمعظم المناطق من الأنسجة (#) (الشكل 2D).
- المقابس من [اغروس] طدت المبكر في القصبات الدانية أو مجرى الهواء الأخرى العراقيل (السهم) يمكن أن يؤدي إلى شغل غير مكتملة للأنسجة (الشكل 2E)، لا قوة [اغروس] شغل كهذا قد يؤدي إلى عيوب في منطقة مليئة ولكن ليس في ملء من أجزاء الأنسجة إعاقة.
- إذا كانت الشجرة التنفسية المستمدة من القصبات الهوائية مقني معطوب أثناء بتر و [اغروس] تعبئة النتائج في تسرب مستمر للسائل [اغروس] (السهم في الشكل 2 واو)، إدراج القسطرة في جزء أكثر هامشية من نظام النقل الجوي إلى شغل على الأقل جزء بسيط من الأنسجة (*) (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك، ختم مجرى الهواء الطرفية التالفة مع المشبك جراحي (السهم) (الشكل 2 ح).
- تطبيق [اغروس] حتى يتم تعبئة أنسجة الرئة تماما. عدم الإفراط تضخم الأنسجة كهذا قد يسبب ضررا لا يمكن إصلاحه ببنية الأنسجة والخلايا بها.
- المشبك القصبات الهوائية التي تم استخدامها للملء فورا. إزالة القنية قبل لقط.
- احتضان الأنسجة في الأجلين المتوسط والثقافة عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لضمان ترسيخ [اغروس].
- إذا كان النسيج ريسيكتيد على عدة إدخالات الشعب الهوائية، كرر الخطوة 4.2 إلى 4.13 حتى يتم ملء جميع أجزاء من الأنسجة مع [اغروس].
- تخزين المقاطع أنسجة الرئة [اغروس] شغل في المتوسط الباردة 4 درجات مئوية حتى التقطيع.
5-دقة قطع الرئة تقطيع
-
تحديد مناطق في أنسجة الرئة التي تمتلئ قوة [اغروس]. سوف تنهار المناطق المملوءة متين لا عند الضغط على أنهم بلطف مع ملاقط ضد الجزء السفلي من الطبق ثقافة الخلية.
- كتلة المكوس 1-1.5 سم3 من المناطق الموصوفة في 5-1، في حين جانب واحد لا يزال ينبغي أن تغطي بغشاء الجنب.
- إرفاق كل كتلة الأنسجة الفردية مع الجانب الجنبي الاتصال حائز فيبرتوم باستخدام غراء cyanoacrylate.
ملاحظة: غشاء الجنب مطاطا قليلاً وذلك يعوق القطع مع بليد فيبرتوم. وضعت على حامل مناديل، الجنب لن تتداخل مع القطع، والأهم من ذلك، يشكل حاجزاً طبيعيا بين الغراء cyanoacrylate ولحمة النسيج السماح بنشر الحد الأدنى من الغراء. - شريحة أنسجة الرئة مع فيبرتوم مع الإعدادات التالية: سمك: 500 ميكرومتر، وتردد: 100 هرتز، السعة السكين: 1.2 مم، وسرعة إلى الأمام لشفرة 3-12 ميكرومتر/s، والذي يعتمد على صلابة الأنسجة. الحد من بروز-سرعة النصل إذا لم يتم قص الشريحة بشكل صحيح، أو إذا كان يبدأ كتلة الأنسجة نفسها ليهتز.
- بلطف نقل الشريحة برفعه بالملقط من علبة فيبرتوم في بئر صفيحة 12-بئر مليئة بزراعة المتوسطة. وأخيراً، احتضان الشرائح الرئة في حاضنة الثقافة في ظروف الخلية القياسية.
- تشريح التوقف عند ترك 2-3 مم كتلة الأنسجة أونسليسيد حيث قد يكون الغراء cyanoacrylate للخطر سلامة الأنسجة من هذه المنطقة.
6-جيل اللكمات بكلس
- نقل الشرائح الرئة من بئر واحدة طبق فارغ 10 سم.
- مكان تثقيب خزعة 4 مم أورثوجونالي على السطح العلوي بكلس وتبدأ في التحرك التثقيب في التناوب في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة.
- تعبئة خلية الثقافة المتوسطة في آبار صفيحة 96-جيدا. رفع اللكمات الأنسجة بالملقط ونقل اللكمات في آبار صفيحة 96-جيدا. وأخيراً، احتضان اللكمات الرئة مغمورة في الأجل المتوسط على استعداد في 1.1.1. في خلية حاضنة ثقافة تحت الظروف القياسية (الأكسجين 21% (v/v)، ورطوبة 95% وثاني أكسيد الكربون 5% (v/v)، عند 37 درجة مئوية).
7-زراعة الأنسجة وحصاد عينة
- الثقافة بكلس واللكمات بين عشية وضحاها في حاضنة الثقافة في ظروف الخلية القياسية.
- وثقافة بكلس واللكمات تحت شرط المبينة لمدة أقصاها 120 ساعة بعد جيلهم لضمان استمرارية الخلوية والدالة.
- لحصاد البروتين وكذلك الجيش الملكي النيبالي، غسل بكلس واللكمات ثلاث مرات في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وتحويلها إلى كريوفيالس والمفاجئة-التجميد في النيتروجين السائل.
-
المادة طافية المتوسطة العينة من بكلس مثقف اللكمات لتحليل البروتينات يفرزها.
- لإجراء تحاليل نسيجية، غسل بكلس واللكمات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وإصلاحها مع بارافورمالدهيد 4% بحضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وأخيراً، تخزين في بكلس في برنامج تلفزيوني عند 4 درجة مئوية لزيادة تلطيخ المتلقين للمعلومات.
Representative Results
جيل بكلس
يمكن فصل توليد بكلس في أربع خطوات أساسية: استئصال أنسجة الرئة الجراحي وشغل [اغروس]، على أساس فيبرتوم جيل بكلس وثقافة بكلس. أنسجة الرئة مستأصل مليئة بذوبان منخفضة نقطة [اغروس]، الذي يضيف صلابة المطلوبة لانسجة الرئة لتقطيع ويحافظ على هيكل الرئة الأصلية والهندسة المعمارية. من المذكرة، جيل بكلس تستغرق وقتاً طويلاً جداً، وبالتالي كثيرا ما التخزين بين عشية وضحاها من أنسجة الرئة شغلها في المتوسطة و دميم-12 يمكن إدراجها كخطوة إضافية وهو بدأ جيل بكلس في اليوم التالي. اعتماداً على إعداد التجريبية التالية، يمكن المحتضنة بكلس الذي تم إنشاؤه بين عشية وضحاها في مستنبت الخلية القياسية المحتوية على مصل بقرى الجنين 0.1% (w/v)، قبل أن يتم تطبيق الشروط التجريبية. 3D--الصلب كانت قابلة للتطبيق ومعارضها وظيفة الخلوية (مثل إفراز بروتين السطح) لتصل إلى 120 ح22 في ظروف الثقافة المبينة في هذا البروتوكول (الشكل 1)، وقد يكون الأمثل إلى مزيد من التحسين منها.
شغل [اغروس]
[اغروس] بملء الأنسجة، أدرج قنية قسطرة الوريدية الطرفية يبلغ قطرها 1.3 مم يعلق على حقنه مليئة [اغروس] في القصبات الهوائية على السطح من قطع الأنسجة (الشكل 2A). وكثيراً ما تكون مترجمة القصبات الهوائية قريبة شريان الرئوي. بينما أرق جدران الشرايين وتميل إلى الانهيار، عرضت القصبات الهوائية تجويف مرئية جيدة. اعتماداً على النزاهة في الأنسجة، يمكن النهوض القسطرة عبر عدة أجيال من شجرة الجهاز التنفسي في محيط الرئة. كانت مختومة القصبات اخترق حول القنية باستخدام الملقط (الشكل 2). يمكن فرضت الشريان الرئوي مع الملاقط في نفس الوقت. بعد ذلك، يتم رفع الأنسجة وهو غرس السائل [اغروس] بلطف إلى أن شركة الخطوط الجوية.
اعتماداً على موضع القسطرة، أغلبية من الأنسجة يمكن أن تملأ بسائل [اغروس] (الشكل 2D). بشكل اختياري، قد الحصول على مخروط مثل أجزاء من أنسجة الرئة، مما يعكس حمة الرئة والتهوية بالقصبات الهوائية اخترق، مليئة [اغروس] (الشكل 2). في كلتا الحالتين، يمكن ملاحظة نمط مميزة لمناطق الأنسجة قوة شغلها: أولاً، يتم تعبئة جزء كبير من الأنسجة في الأوتاد (الشكل 2D) أو ثانيا، أصغر بارزة جولة مجالات شاملة مناطق الأنسجة شغلها تظهر ( الشكل 2). إذا كانت أجزاء من الخطوط الجوية تعرقل بسبب جلطات [اغروس] أو غيرها من الأسباب، أجزاء من الأنسجة قد لا يكون بشكل صحيح مليئة [اغروس]. وهكذا، يمكن تطبيقها لتقطيع أجزاء فقط من الأنسجة. في حالة حدوث تسربات أثناء [اغروس] ملء الداخلي، قد تحصل على مثقب أجزاء الشجرة التنفسية شغلها وشغل أنسجة الرئة يحصل يكاد يكون من المستحيل إلا، الحلول الممكنة وتشمل التعبئة عن طريق القصبات الهوائية أكثر هامشية، أعمق دخول القنية إلى الخطوط الجوية البعيدة (الشكل 2)، أو لقط المحتملة من منطقة التسرب (الشكل 2 ح).
تشريح الرئة دقة قطع
وقد اقتطعت كتل الأنسجة في الطول والعرض من 1-1.5 سم من مناطق الأنسجة، التي امتلأت تماما طدت [اغروس] (الشكل 3 ألف-3B). وبعد ذلك، تم لصقها كتل الأنسجة الفردية على حامل الأنسجة فيبرتوم (الشكل 3). 500 ميكرومتر سميكة بكلس تم إنشاؤها، بينما تتقدم كتلة الأنسجة في فيبرتوم إلى الأمام بسرعة بين 3-12 ميكرومتر/س. (3D الرقم-3F). أخيرا، بكلس غارقة في مستنبت الخلية المحتوية على مصل بقرى الجنين 0.1% (w/v) ومثقف في ظروف ثقافة الخلية القياسية، كما أوجز الخطوة 7.
قراءات تجريبية من LTC 3D البشرية بعد 48 ساعة من استزراع
ويبين الشكل 4A-4 جتلطيخ الفلورة الممثل، كما تم وصفه سابقا قبل25من السافادي et al.. إيمونولابيلينج فيبرونيكتين (أحمر) وخلية نوى (DAPI، الأزرق)، سمح لتصوير هيكل السنخية المحفوظة في 3D--LTC البشرية السابقين فيفو. معاملة الإنسان بكلس اللكمات مع سيتوكين بروفيبروتيك كوكتيل (بما في ذلك تحويل عامل النمو بيتا 1 وعامل النمو الصفيحات تستمد أساسها وحمض ليبوفوسفاتيديل، وعامل نخر الورم ألفا) مقابل 48 ح نتج التليف مثل تغيرات في الإنسان 3D--الصلب. قبل qPCR، لوحظ تحريض كبير المصفوفة خارج الخلية ذات الصلة بالتليف مكونات الكولاجين النوع 1 وفيبرونيكتين الجينات في 3D--LTC اللكمات على المعاملة مع بروفيبروتيك كوكتيل (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك، عثر على مستويات البروتين فيمنتين ماركر mesenchymal upregulated في 3 من أصل 4 المرضى بعد علاج اللكمات 3D--LTC (4E الشكل).
رقم 1: سير عمل جيل بكلس. المناطق الخالية من الورم من الرئة ريسيكشنز يتم تفتيشها بدقة نظراً لسلامتهم الأنسجة. إذا هو سجل الأنسجة مناسبة لمواصلة استخدام (التهديف هو مبين بالتفصيل في قسم المواد والأساليب)، أنه مليء بسائل [اغروس] التالية. هي شرائح كتل الأنسجة مليئة طدت [اغروس] فيما بعد مع فيبرتوم. غارقة في خلية الثقافة المتوسطة، 3D--LTC تستزرع ما يصل إلى 120 ساعة بعد جيلهم. تحليلات المصب من 3D-الصلب تنطوي على تعبير البروتين أو الجيش الملكي النيبالي، والأسفار يعيش الأنسجة التصوير، فضلا عن الفلورة تلطيخ بعد تثبيت الأنسجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: ملء أنسجة الرئة مع [اغروس] نقطة انصهار منخفضة. هو مقني أنسجة الرئة قسطرة وريدية طرفية التي يتم إدراجها في القصبات الهوائية المتاخمة للشريان الرئوي (الشكل 2A). يتم استخدام الملقط لإصلاح القنية في القصبات الهوائية والمشبك الشريان الرئوي لتجنب تسرب السائل [اغروس]. يسكب السائل [اغروس] في 42 درجة مئوية في أنسجة الرئة مع حقنه 30 مل (الشكل 2). سيؤدي تحديد المواقع البعيدة من القنية أثناء الملء في مناطق صغيرة من الأنسجة معبأ (الشكل 2)، بينما المواقع الدانية سيكفل ملء حجم الأنسجة أكبر (الشكل 2D). أي عوائق للخطوط الجوية سوف يقلل من الكمية الأنسجة شغل وحدة التخزين التي يمكن أن تكون (الشكل 2E). في حالة تسرب [اغروس]، تمكن قنية القاصي المواقع و/أو لقط الجانب التسرب ملء السليم [اغروس] لانسجة الرئة (الشكل 2 واوح-2). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: دقة قطع تشريح الرئة. يستخدم نسيج رئة مليئة بنجاح [اغروس] للمكوس قطعة من كتلة الأنسجة (1 سم × 1.5 سم × 1 سم) مع مشرط (الشكل 3A). التالي التصاق كتلة الأنسجة قصت حامل مناديل، ويشير شريط مقياس 1 سم (الشكل 3B). يفضل أن يكون ذلك، التصاق الأنسجة مع سطحه الجنبي إلى سطح حامل مناديل كما هو مبين في الشكل 3. يتم قطع فيبرتوم 500 ميكرومتر سميكة شرائح بسكين ياقوت في زاوية 10-15° بالنسبة للأنسجة (3D الشكل و 3E). نتائج الإجراء القطع 2-3 سم3 شرائح كبيرة الرئة سليمة، مقياس بار = 5 ملم (الشكل 3F). بالإضافة إلى ذلك، باستخدام تثقيب خزعة، يمكن أن تتولد اللكمات استنساخه الصغيرة التي يبلغ قطرها 4 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: قراءات تجريبية من الصلب 3D البشرية بعد 48 ساعة ثقافة- كان لكمه بشرية 3D--LTC قطرها 4 مم إيمونوستينيد فيبرونيكتين (باللون الأحمر) و DAPI (باللون الأزرق) (الشكل 4A-4C). تغيير حجم أشرطة = 1,000 ميكرومتر. يظهر الشكل 4 الصورة المدمجة. ويبين تحليل الحمض النووي الريبي بكلس بالكمية RT-PCR زيادات كبيرة للتعبير الجيني COL1A1 و FN1 كوكتيل بروفيبروتيك25. يعرض 4E الرقم إيمونوبلوت ليساتيس بروتين كامل من بكلس، التي كانت تعامل مع كوكتيل تليفية25. التدقيق في فيمنتين و β-أكتين أظهر تعبير بروتين زيادة علامة الوسيطة (فيمنتين) بعد العلاج مع بروفيبروتيك العوامل في عينات المرضى 1 و 3 و 4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المعيار | النقاط |
| وقد عينة الأنسجة السطحية الجنبي سليمة. | 20 |
| ويبدو عينة الأنسجة سليمة الميكروسكوب، تفتقر إلى شقوق، السحق، تصدعات والتشوهات. | 20 |
| عينة الأنسجة يحتوي على واحد على الأقل من القصبات الهوائية التي يبلغ قطرها > 1 مم. | 20 |
| عينة أنسجة تحتوي على لا أو المبالغ إلا القليل من الدم. | 4 |
| تم تخزين تماما في المتوسط عينة الأنسجة ويظهر أي علامة واضحة من انخماص. | 4 |
| وكان مستأصل عينة الأنسجة خلال الساعات الأربع الأخيرة. | 4 |
| عينة الأنسجة أكبر من 5 سم في أكبر قطر لها. | 4 |
| نقاط في المجموع: |
الجدول 1: [اغروس] الرئة ملء نقاط. درجة ملء [اغروس] الرئة (لافس) يرتبط بمعدل النجاح لملء استئصال أنسجة مع [اغروس] لإنتاج بكلس اللاحقة المستندة إلى فيبرتوم. النقاط تلخص النقاط جميع معايير التقى بالانسجة. لافس متساوية أو أعلاه 72 يتنبأ جيدة [اغروس] ملء خصائص، على درجة أقل من 60 تتنبأ فشل محتمل جداً لملء [اغروس] من الأنسجة.
Discussion
ويغطي البروتوكول، المذكورة في هذه المخطوطة جيل بكلس من ريسيكتاتيس أنسجة الرئة البشرية بتعبئته بسائل [اغروس] وتقطيع فيبرتوم اللاحقة. جيل شرائح الأنسجة تجلى قبل لاثنين من الأجهزة، مثل الكبد والدماغ، بينما يسمح تصلب الملازمة لهذه الأجهزة مباشرة تقطيع دون أي تعديل للأنسجة. من المذكرة، هو إعداد المناسبة الأولى لانسجة الرئة والخطوة الأكثر أهمية في توليد بكلس. [اغروس] ملء الرئة هو الأسلوب المفضل لتحقيق الاستقرار في طبيعته لينة ومرنة، وضمان جيل بكلس متجانسة واستنساخه. هي مقني الخطوط الجوية الكبيرة من أنسجة الرئة مستأصل لتوفير الوصول إلى الخطوط الجوية الصغيرة، فضلا عن حمة الرئة سليمة. عدم غشاء الجنب سليمة، مما يجعل من المستحيل تقريبا [اغروس] ملء، هو سبب رئيسي لماذا أنسجة الرئة ليس معظمها قابلة للاستخدام لتقطيع الرئة. مستقبلي، يمكن تطبيقها الجنب اصطناعية المصممة أصلاً لإجراء التجارب الفنية على السقالات ديسيلولاريزيد يحتمل أن تكون لتحقيق نجاح [اغروس] بملء explants التي تفتقر الجنب سليمة31. ريسيكشنز أدى إلى قطعة أنسجة الرئة بشرية مع الجنب سليمة ضرورية لتوليد كتل الأنسجة للتقطيع. نسيج مستأصل يتوفر أكثر بسبب خالية من ورم الأنسجة من سرطان ريسيكشنز من الفصوص سليمة تماما أو explants الرئة كل من المرضى الذين خضعوا زرع الرئة.
عادة، تستخدم نظامين لإنتاج بكلس: كرومديك الأنسجة مقسم طريقة العرض15 والاهتزاز ميكروتوميس (فيبراتوميس). توليد الأنسجة تقطيع شرائح بتمرير كتلة أنسجة من خلال سفينة معدنية، والتخفيضات بكلس على 90 درجة في نهاية هذه السفينة. إنشاء فيبراتوميس بكلس عن طريق تحريك تهتز سكين أفقياً عبر كتلة رأسية للأنسجة التي هي غارقة في حمام متوسط المبردة، مقارنة بتقطيع كرومديك يمارس أقل قوة القص في الأنسجة. ينتج عن هذا أقل معاملة قاسية من قبل زراعة الأنسجة. من ناحية أخرى، يتم قطع فيبرتوم المزيد من الوقت والعمل المستهلكة. في أيدينا، اللكمات فيبرتوم تشريح مكن إنتاج 100 بكلس أو بكلس 500 كحد أقصى في اليوم الواحد، يكفي للدراسات التجريبية الأكثر. يمكن أن يكون مثقف بكلس بطرق مختلفة: (أ) تعلق على ترانس-الآبار، وبالتالي توليد هواء سائل واجهة النظام (على)، (ب) كهيئة دينامية الثقافة (DOC)، أو (ج) غارقة في خلية ثقافة المتوسطة في ظروف ثقافة الخلية القياسية. زراعة بكلس في التفصيل تم وصفه سابقا22،،من2325؛ ومع ذلك، معيار مشترك لظروف زراعة بين استخداماتها في مختبرات مختلفة حول العالم مازال مفقوداً. على وجه الخصوص، قد يكون الوقت الثقافة الحيوية: كما هو الحال في بكلس مورين، لوحظ فقدان خلايا نوع السنخية الإيجابية 2 سفتبك بعد ح 144، ولكن ليس بعد 120 ح22. وباﻹضافة إلى ذلك، يبدو النشاط الأيضي تبقى مستقرة في مورين22 والبشرية بكلس25 لح 120.
وهناك زوجين من القيود التقنية لتوليد بكلس: عدد وحجم ريسيكتاتيس يتقلب على مر الزمن؛ كفاءة [اغروس] ملء، الذي يعتمد على وجود غشاء الجنب سليمة داخل الأنسجة التي تم الحصول عليها، ويحدد النجاح النهائي لتوليد بكلس؛ وتدمير الأنسجة الناجمة عن التغيرات المرضية في أنسجة الرئة (المريضة) التي تم الحصول عليها قد تتداخل مع إعداد بكلس. عوائق مجرى الهواء وأنسجة تليفية تفتقر إلى الفضاء السنخية سليمة تعوق مع [اغروس] شغل وبالتالي جعل تشريح أنسجة تليفية مهمة شاقة. الأنسجة امفيسيماتوس كما وجدت في أمراض مثل هذا المرض أو عوز ألفا-1-مكافحة-التربسين قد لا تصمد أمام الضغط [اغروس] شغل، وسيؤدي إلى تمزق الحويصلات الهوائية والتحف المعمارية. وفي هذه الحالات، قد يكون من المفيد تقليل الضغط والسرعة أثناء الملء [اغروس] استخدام تركيزات منخفضة [اغروس]، مثل، 1% (w/v)،. إجمالاً، حالة المرض الأنسجة يمكن كبير الحد من استخدام الأنسجة لجيل بكلس. كل هذه المعايير بتحديد قيمة بكلس التي يمكن أن تتولد من أنسجة الرئة وأيضا مقدار الوقت المستغرق في إنتاج بكلس. زيادة القيود المفروضة على بكلس هي التناقضات بين شرائح مختلفة من الرئة فيما يتعلق بحجم أو الأنسجة المحتوى، الأمر الذي يتطلب المزيد من خطوات التطبيع للتجارب. للتغلب على هذا، يمكن أن تتولد اللكمات خزعة من مناطق مماثلة من نفس الشريحة. هذا الإجراء ملائمة للحد من تقلب الأنسجة، وكما ميزة إضافية، زيادة عدد العينات بكلس التي يمكن استخدامها لإجراء التجارب.
وفي الختام، شغل زرع الأنسجة البشرية الرئة 3D من [اغروس] بكلس تقديم نموذج بشرية معقدة لدراسة فسيولوجيا الرئة وأمراض. البروتوكول يوفر وصفاً مفصلاً لإعداد بكلس من أنسجة الرئة مستأصل وزراعتها، وعلاوة على ذلك ويتناول التحديات في ملء [اغروس] ريسيكشنز الرئة البشرية وكيفية التغلب عليها.
Disclosures
أن تعلن جميع المؤلفين لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
الكتاب ممتنون لنيومان ماريسا لخبراء المساعدة التقنية. وكانت جميع أنسجة الرئة يرجى المقدمة من الحزب الشيوعي الصيني-م بيو-الأرشيف. وأيد هذا العمل المركز الألماني للمنح البحثية الرئة (دزل)، ورابطة هلمهولتز ومدرسة الحزب الشيوعي الصيني للبحث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | - | |
| Hyrax CU 65 | Zeiss | - | |
| Vasofix Braunüle 18 G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
| 30 mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
| Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
| Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
| Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | - | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
| Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
| Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
- Rosenberg, S. R., Kalhan, R., Mannino, D. M. Epidemiology of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Prevalence, Morbidity, Mortality, and Risk Factors. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine Med. 36 (4), 457-469 (2015).
- Hekking, P. P., et al. The prevalence of severe refractory asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (4), 896-902 (2015).
- Woodard, G. A., Jones, K. D., Jablons, D. M. Lung Cancer Staging and Prognosis. Cancer Treatment and Research. 170, 47-75 (2016).
- Ley, B., Collard, H. R., King, T. E. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 183 (4), 431-440 (2011).
- Burgstaller, G., et al. The instructive extracellular matrix of the lung: basic composition and alterations in chronic lung disease. European Respiratory Journal. 50 (1), (2017).
- Degryse, A. L., Lawson, W. E. Progress toward improving animal models for idiopathic pulmonary fibrosis. The American Journal of the Medical Sciences. 341 (6), 444-449 (2011).
- Fricker, M., Deane, A., Hansbro, P. M. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 9 (6), 629-645 (2014).
- Sagar, S., Akbarshahi, H., Uller, L. Translational value of animal models of asthma: Challenges and promises. European Journal of Pharmacology. 759, 272-277 (2015).
- Williamson, J. D., Sadofsky, L. R., Hart, S. P. The pathogenesis of bleomycin-induced lung injury in animals and its applicability to human idiopathic pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 41 (2), 57-73 (2015).
- Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of beta2-adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
- Skronska-Wasek, W., et al. Reduced Frizzled Receptor 4 Expression Prevents WNT/beta-Catenin-driven Alveolar Lung Repair in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 196 (2), 172-185 (2017).
- Lehmann, M., et al. Senolytic drugs target alveolar epithelial cell function and attenuate experimental lung fibrosis ex vivo. European Respiratory Journal. 50 (2), (2017).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Ebsen, M., et al. Infection of murine precision cut lung slices (PCLS) with respiratory syncytial virus (RSV) and chlamydophila pneumoniae using the Krumdieck technique. Pathology - Research and Practice. 198 (11), 747-753 (2002).
- Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
- Royce, S. G., et al. Airway Remodeling and Hyperreactivity in a Model of Bronchopulmonary Dysplasia and Their Modulation by IL-1 Receptor Antagonist. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (6), 858-868 (2016).
- Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 309 (10), L1219-L1228 (2015).
- Zscheppang, K., et al. Human Pulmonary 3D Models For Translational Research. Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).
- Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Human & Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
- Wang, L., et al. Differences between Mice and Humans in Regulation and the Molecular Network of Collagen, Type III, Alpha-1 at the Gene Expression Level: Obstacles that Translational Research Must Overcome. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 15031-15056 (2015).
- Uhl, F. E., et al. Preclinical validation and imaging of Wnt-induced repair in human 3D lung tissue cultures. European Respiratory Journal. 46 (4), 1150-1166 (2015).
- Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicology and Applied Pharmacology. 246 (3), 107-115 (2010).
- Banerjee, A., et al. Trichostatin A abrogates airway constriction, but not inflammation, in murine and human asthma models. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 132-138 (2012).
- Alsafadi, H. N., et al. An ex vivo model to induce early fibrosis-like changes in human precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), L896-L902 (2017).
- Westra, I. M., Oosterhuis, D., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut liver slices as a model for the early onset of liver fibrosis to test antifibrotic drugs. Toxicology and Applied Pharmacology. 274 (2), 328-338 (2014).
- Vatakuti, S., Schoonen, W. G., Elferink, M. L., Groothuis, G. M., Olinga, P. Acute toxicity of CCl4 but not of paracetamol induces a transcriptomic signature of fibrosis in precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 29 (5), 1012-1020 (2015).
- Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Disease Models & Mechanisms. 8 (10), 1227-1236 (2015).
- Li, M., de Graaf, I. A., Groothuis, G. M. Precision-cut intestinal slices: alternative model for drug transport, metabolism, and toxicology research. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (2), 175-190 (2016).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Wagner, D. E., et al. Design and Synthesis of an Artificial Pulmonary Pleura for High Throughput Studies in Acellular Human Lungs. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 184-195 (2014).
