Summary
Hier presenteren we een protocol voor de bereiding van menselijke precisie-cut-Long agarose gevulde segmenten van patiënten weefsel gereseceerd die geschikt zijn voor het genereren van 3D Long weefselcultures naar model menselijke longziekten in de biologische en biomedische studies.
Abstract
Vertaling van de nieuwe ontdekkingen aan ziekten bij de mens wordt beperkt door de beschikbaarheid van menselijke weefsels-gebaseerde modellen van ziekte. Precisie-cut Long segmenten (Thuiskopieerheffingen) gebruikt als 3D Long weefselcultures (3D-LTCs) een elegante vormen en biologisch zeer relevant 3D cel cultuur model, die sterk lijken op in situ weefsel vanwege hun complexiteit, biomechanica en moleculaire samenstelling. Snijden van weefsel is op grote schaal toegepast in verschillende diermodellen. 3D-LTCs afgeleid van menselijke Thuiskopieerheffingen kunnen worden gebruikt voor het analyseren van de reacties op nieuwe medicijnen, die verder helpen misschien om de mechanismen en functionele gevolgen van drugs in menselijk weefsel beter te begrijpen. De voorbereiding van Thuiskopieerheffingen van chirurgisch gereseceerd Long weefselmonsters van patiënten, die Long Lobectomie ervaren, verhoogt de bereikbaarheid van zieke en peritumoral weefsel. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het genereren van menselijke Thuiskopieerheffingen van chirurgisch gereseceerd soft-elastisch patiënt longweefsel. Agarose werd geïntroduceerd in de ruimte van de bronchoalveolar van de resectates, dus behoud van de structuur van de longen en verhogen van de stijfheid van het weefsel, die is van cruciaal belang voor het latere snijden. 500 µm dikke sneden waren bereid uit het weefsel blok met een vibratome. Stoten van de biopsie genomen van Thuiskopieerheffingen zorgen voor vergelijkbare weefsel steekproefgrootten en verdere verhoging van het bedrag van weefselmonsters. De gegenereerde Long weefsel culturen kan worden toegepast in een aantal studies in de menselijke longen biologie, met inbegrip van de pathofysiologie en de mechanismen van de verschillende ziekten, zoals fibrotische processen op het beste bij (sub-) cellulair niveau. Het hoogste voordeel van het 3D-LTC ex vivo model is haar nauwe vertegenwoordiging van de in situ menselijke longen ten aanzien van 3D weefsel architectuur, cel type diversiteit en longkanker anatomie evenals het potentieel voor beoordeling van weefsel van individuele patiënten, die is relevant voor de verdere ontwikkeling van nieuwe strategieën voor precisie geneeskunde.
Introduction
Chronische en acute longziekten zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd1. Voor patiënten met chronische longziekten zoals obstructief longlijden (COPD)2, ernstige astma3, long kanker4 en diffuse parenchymal Long ziekten5zijn genezende therapieën momenteel niet beschikbaar. Hoewel studies in diermodellen voor longziekten hebben verdiept het inzicht in de ziekte pathomechanisms6 en hebben geleid tot de identificatie van potentiële nieuwe therapeutische doelen7,8,9, Deze modellen vertonen relevante biologische en fysiologische verschillen in vergelijking met mensen10. Om te overwinnen van deze verschillen tussen lymfkliertest en menselijke biologie, evenals Anatomie, menselijke ex vivo 3D Long weefselkweek worden (3D-LTC) systemen gebruikt in verschillende gebieden van het biomedisch onderzoek. Deze 3D-LTC cultuur systemen zijn gebaseerd op precisie-cut Long segmenten (Thuiskopieerheffingen). De generatie van Thuiskopieerheffingen ex vivo kunt analyse van een derde ruimtelijke dimensionaliteit, die het mogelijk voor het onderzoek van de ruimtelijke en functionele relaties tussen de cellen in de hele longblaasjes en airways11, evenals het interstitium, therapieën maakt en mesothelium. Met name zijn Thuiskopieerheffingen ex vivo modellen meercellig, wat betekent dat ze de meest functionele cellen van in situ longen bevatten, dus nauw het vertegenwoordigen van biologische oorsprong van de cellen en dus overwinnen van de beperkte cel-cel en cel-matrix interactie in meeste 2D de benaderingen van de cultuur van de cel. Tot nu toe ex vivo lymfkliertest Thuiskopieerheffingen werden gebruikt om het model van longziekten, zoals COPD12, lung fibrosis13, long kanker14, virale infectie15,16, broncho dysplasie17, en astma18. Echter een aanzienlijk deel van de roman drug therapieën in menselijke longziekten die werden onderzocht in klinische proeven niet vertalen naar de kliniek als gevolg van hun gebrek aan werkzaamheid of veiligheid, assumingly moet nog aanzienlijke verschillen tussen mens en lymfkliertest biologie en ziekte19,20,21.
Gedurende een aantal jaren hebben menselijke Thuiskopieerheffingen grotendeels zijn gebruikt ter beoordeling van de Long giftigheid van chemische stoffen en drugs. Pas onlangs, menselijke longweefsel is gebruikt van patiënten met COPD22,23, astma24en lung fibrosis25, voort te zetten van de pathofysiologische en farmacologische studies. Door met behulp van gereseceerd patiënt orgaanweefsel en het genereren van Thuiskopieerheffingen daarvan, een grote ziekte kenmerken in een complexe 3D weefsel milieu22 vertegenwoordigen en het onderhoud van de meeste van de inheemse cellulaire diversiteit van het orgel kunt herhalen. Bovendien bleek de zieke weefsel toegepast in een verscheidenheid van experimentele opstellingen om na te bootsen ziekte-achtige wijzigingen in lever-, darm- en nier26,27,28,29.
Verwerking van longweefsel blijft echter uitdagend om verschillende redenen. In tegenstelling tot stevige weefsel, native Long parenchym neiging om samenvouwen zonder ventilatie en lagere weefsel stijfheid vertoont. Deze eigenschappen belemmeren het snijden van het weefsel. Zo vullen van airways en de alveolaire ruimte met lage-melting point agarose de native Long structuur behoudt en biedt de stijfheid die nodig zijn voor precisie-cut snijden van lymfkliertest en menselijke longen30. Menselijke longen resectates gedoneerd voor onderzoeksdoeleinden zijn door hun aard anatomisch, genetisch en fysiologisch zeer divers, dus een hoge variabiliteit van Inter patiënten vaak presenteren bij het uitvoeren van experimenten25. In tegenstelling tot de hele lobe of hele Long explantaten, Long monsters gereseceerd door middel van cardio-pulmonale chirurgie niet noodzakelijkerwijs volg de anatomische segmenten en, daarom vereisen speciale voorbereiding. In dit artikel geven wij een gedetailleerde en geoptimaliseerd protocol voor het genereren van menselijke Thuiskopieerheffingen van gereseceerd longweefsel en hun latere teelt en experimenteel gebruik tot model longaandoeningen.
Protocol
Het gebruik van menselijk weefsel werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Ludwig-Maximillian Universiteit [München, Duitsland (projectnummer 455-12)]. Tumor-vrije menselijke Long resections werden verstrekt door de Asklepios Biobank voor longziekten (Gauting (Duitsland), projectnummer 333-10).
Opmerking: Alle procedures voor menselijke Thuiskopieerheffingen productie (Figuur 1) zijn gedaan onder de motorkap van een steriele laminaire flow.
1. voorbereiding van instrumenten en materialen
-
Het bereiden van alle materialen voor de inflatie van longweefsel met agarose zoals hieronder beschreven.
- Bereiden van het medium teelt: Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) F-12 aangevuld met L-Glutamine, HEPES, 10.000 IE penicilline, 10.000 IE streptomycine en foetale runderserum 0,1% (v/v).
Opmerking: Voedingsbodem wordt gebruikt bij 37 ° C. - Een steriele metalen lade bedekt met papieren zakdoekje voor te bereiden. Plaats een steriele 15 cm schotel voor de cultuur van de cel in de lade legt.
- Vul de cel cultuur schotel met de 15 mL van teelt medium.
- Bereid een 3% (m/v) agarose oplossing door ontbinding van de juiste hoeveelheid laag-melting point agarose in een minimum van 30 mL teelt voedingsbodem.
- Verwarm de oplossing in een magnetron tot koken. Koel de oplossing agarose tot 42 ° C in een waterbad. Bewaar de oplossing van de vloeibare agarose opgeslagen in het waterbad.
- Meerdere 50 mL conische buizen gevuld met de vloeibare agarose voor te bereiden.
- Bereiden van het medium teelt: Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) F-12 aangevuld met L-Glutamine, HEPES, 10.000 IE penicilline, 10.000 IE streptomycine en foetale runderserum 0,1% (v/v).
2. gereseceerd longweefsel
- Winkel verse tumor gratis longweefsel van Lobectomie resectates onmiddellijk na resectie in DMEM F-12 medium bij 4 ° C tot stap 3.
- Koude ischemie tijd van 4-8 uur vóór verwerking niet overschrijden.
3. de inspectie en de selectie van gereseceerd weefsel vóór Agarose vulling
- Til het weefsel van het medium met een pincet. Om te voorkomen dat schade aan het weefsel, vooral aan het borstvlies, omgaan met het weefsel met een pincet in de luchtwegen alleen.
- Score van de kwaliteit van het weefsel voldoen aan de criteria van de Long Agarose vullen Score omschreven in tabel 1.
- Ga verder met stap 4 als de kwaliteit van het weefsel is georkestreerd boven of gelijk aan 72. Als de kwaliteit van het weefsel gescoord wordt onder 60, ga niet verder met agarose vullen verder.
Opmerking: Als de weefsel score tussen 60 en 68, de agarose-vulling en weefsel snijden kunnen nog redelijke resultaten opleveren en een definitieve beslissing voor de verlenging van het experiment moet geval voor geval worden gemaakt. Echter longweefsel die niet voldeed aan de bovengenoemde eisen, meestal in gebreke blijft agarose vullen.
4. Long weefsel inflatie door het Agarose invullen
- Opheffing van het weefsel van het opslagmedium en afvoer van overtollige media uit het weefsel. Breng het longweefsel in de 15 cm cultuur schotel bereid in 1.1.2.
- Vul een 30 mL spuit met de lage-melting point agarose van 1.1.3.
- Bereiden van een perifere veneuze katheter door het obturator verwijderen en deze koppelen aan een 30 mL spuit
- Identificeren van een bronchiën (0.5-3 mm in diameter) in het weefsel dat een intacte gedeelte van het weefsel is ventileren (Zie Figuur 2).
- De canule invoegen in de geselecteerde bronchiën (0.5-3 mm doorsnede).
- Duw voorzichtig de canule voorzichtig naar voren zoveel mogelijk.
- Het zegel van de bronchiën rond de canule door te comprimeren de bronchiale muur rond de canule met een tang, idealiter een aangrenzende longslagader klemmen op hetzelfde moment.
- Occlude andere extra airways met een chirurgische klem om te voorkomen dat agarose lekken via deze airways.
- Til het weefsel met de Tang van de cultuur-schotel.
- Handmatig giet de agarose niet sneller dan 0.3 mL/s met de spuit. De snelheid van agarose vullen kan variëren tussen ongeveer 0,05 en 0.3 mL/s als gevolg van de heterogene weerstand van de luchtwegen en/of atelectase.
-
Indien hoge weerstand tijdens het vullen of agarose lekken van het weefsel wordt waargenomen, opnieuw de hele procedure met een verschillende bronchiën uit stap 4.4. Oplossen zoals hieronder beschreven.
Opmerking: De mate van agarose vullen is sterk afhankelijk van de positie van de katheter in het weefsel en diepe penetratie van de resultaten van de katheter op agarose vullen van kleine kegel als regio's (*) van het longweefsel (figuur 2C).- In het geval van hoge weerstand, probeer positionering van de katheter leidt tot goede vulling van de meeste regio's van het weefsel (#) (figuur 2D).
- Als de stekkers van de vroege gestolde agarose in de proximale bronchiën of andere obstakels (pijl) tot een onvolledig invullen van het weefsel (2E figuur leiden kunnen) airway, forceer niet agarose vullen als dit tot defecten in het gevulde gebied, maar niet in een vulling van leiden kan de belemmerd weefsel delen.
- Als de luchtwegen boom afgeleid van de gecanuleerde bronchiën is beschadigd tijdens de resectie en de agarose vullen resulteert in een constante lekken van de vloeibare agarose (pijl in figuur 2F), plaatst u de katheter in een meer perifere deel van de luchtweg systeem Vul ten minste een klein deel van het weefsel (*) (Figuur 2 g). Bovendien, zegel het beschadigde perifere airway met een chirurgische klem (pijl) (Figuur 2 H).
- Agarose worden toegepast totdat het longweefsel volledig is gevuld. Niet teveel blazen het weefsel omdat dit leiden onomkeerbare schade aan de structuur van de weefsels en cellen tot kan.
- Klem de bronchiën die werd gebruikt voor het vullen direct. Verwijder de canule voorafgaand aan klemmen.
- Incubeer het weefsel in het kweekmedium bij 4 ° C gedurende 30 minuten om agarose stollen.
- Als het resected weefsel meerdere bronchiale vermeldingen heeft, herhaalt u stap 4.2 tot en met 4.13 totdat alle delen van weefsel zijn gevuld met agar.
- Winkel de agarose gevuld Long weefselsecties in 4 ° C koud medium tot snijden.
5. precisie-cut Lung snijden
-
Regio's in het longweefsel, die stevig zijn gevuld met de agarose identificeren. Stevig gevulde gebieden zal niet instorten als ze voorzichtig met een pincet tegen de onderkant van de cel cultuur schotel worden ingedrukt.
- Accijnzen een blok3 1-1,5 cm van regio's die worden beschreven in punt 5.1, overwegende dat de ene kant nog steeds moet worden bedekt met borstvlies.
- Bevestig elk individuele weefsel blok met de pleurale kant contact opnemen met de houder van de vibratome met behulp van een Cyanoacrylaat lijm.
Opmerking: Het borstvlies is licht elastisch en daarom belemmert het stekje met het blad van de vibratome. Geplaatst op de houder van het weefsel, de pleura zal niet interfereren met het snijden en, nog belangrijker is, vormt een natuurlijke barrière tussen de Cyanoacrylaat lijm en van het weefsel parenchym waardoor minimale diffusie van de lijm. - Snijd het longweefsel met de vibratome met de volgende instellingen: dikte: 500 µm, frequentie: 100 Hz, amplitude van het mes: 1.2 mm, voorwaartse snelheid van het blad van 3-12 µm/s, die afhangt van de stijfheid van het weefsel. Verlaag het uitsteeksel-snelheid van het blad als het segment niet goed wordt gesneden, of als het weefsel blok zelf begint te trillen.
- Zachtjes overdracht van het segment door het opheffen van het met een tang uit de lade van de vibratome in een putje van een 12-well plaat gevuld met teelt medium. Ten slotte, Incubeer de Long segmenten in een incubator onder de kweekomstandigheden standaard cel.
- Stop snijden wanneer 2-3 mm van het weefsel blok zitten ongesneden aangezien de Cyanoacrylaat lijm kan hebben gecompromitteerd de weefsel integriteit van deze regio.
6. generatie van Thuiskopieerheffingen stoten
- Overbrengen in de Long-segmenten uit een enkele bron een lege 10 cm schotel.
- Plaats een 4 mm biopsie perforatie orthogonaal aan de bovenkant van een Thuiskopieerheffingen en beginnen te bewegen de perforatie in rechtsom en linksom rotaties.
- Kweekmedium cel doorvoeren in de wells van een 96-wells-plaat. Til de stoten van het weefsel met een tang en breng de stoten in de wells van een 96-wells-plaat. Ten slotte, Incubeer de stoten van de Long ondergedompeld in het medium bereid in 1.1.1. in een cel cultuur incubator onder standaardomstandigheden (21% (v/v) zuurstof, 5% (v/v) kooldioxide en 95% vochtigheid, bij 37 ° C).
7. weefselkweek en monster oogsten
- Cultuur de Thuiskopieerheffingen en stoten overnachting in een incubator onder de kweekomstandigheden standaard cel.
- Cultuur Thuiskopieerheffingen en stoten onder overzicht voorwaarde voor een maximum van 120 uren na hun generatie cellulaire levensvatbaarheid en functie te waarborgen.
- Voor het oogsten van proteïne evenals RNA, Thuiskopieerheffingen en stoten driemaal in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) wassen, ze vervolgens overbrengen naar cryovials en module-freeze in vloeibare stikstof.
-
Voorbeeld middelgrote supernatant van gekweekte Thuiskopieerheffingen stoten voor de analyse van secreted eiwitten.
- Voor histologisch analyses, wassen van de Thuiskopieerheffingen en stoten driemaal met PBS en corrigeren met 4% paraformaldehyde door incubatie gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Tot slot slaan de Thuiskopieerheffingen in PBS bij 4 ° C voor verder stroomafwaarts kleuring.
Representative Results
Thuiskopieerheffingen generatie
De generatie van Thuiskopieerheffingen kan worden onderverdeeld in vier essentiële stappen: chirurgische Long weefsel resectie, agarose vulling vibratome gebaseerde Thuiskopieerheffingen generatie en cultuur van Thuiskopieerheffingen. De gereseceerd longweefsel is gevuld met lage-smelten punt agarose, die de vereiste stijfheid voegt aan het longweefsel voor het snijden en behoudt de native Long structuur en architectuur. Van de nota, Thuiskopieerheffingen generatie is zeer tijdrovend, dus vaak 's nachts opslag van de gevulde longweefsel in DMEM F-12 medium kan worden opgenomen als een extra stap en Thuiskopieerheffingen generatie is gestart op de volgende dag. Afhankelijk van de volgende experimentele opzet, kan gegenereerde Thuiskopieerheffingen 's nachts worden geïncubeerd in standaard cel kweekmedium dat van de foetale runderserum 0,1% (g/v), voordat de experimentele omstandigheden worden toegepast. 3D-LTCs waren levensvatbare en cellulaire functionaliteit (zoals de secretie van de eiwitten van de oppervlakteactieve stof) tentoongesteld voor maximaal 120 h22 in de kweekomstandigheden in dit protocol (Figuur 1 uiteengezet) en kan worden geoptimaliseerd op verdere verbetering daarvan.
Agarose vulling
Voor agarose invulling van het weefsel, was een canule van een perifere veneuze katheter met een diameter van de 1.3 mm aangesloten op de agarose gevulde spuit een bronchiën aan het oppervlak van het gesneden weefsel (figuur 2A) ingevoegd. Bronchiën zijn vaak gelokaliseerd in de buurt van een longslagader. Terwijl de slagaders dunner muren hebben en de neiging om samen te vouwen, tentoongesteld bronchiën een goed zichtbare lumen. Afhankelijk van het weefsel van de integriteit, kan de katheter worden bevorderd door meerdere generaties van de respiratoire boom in de periferie van de longen. De gepenetreerd bronchiën was verzegeld rond de canule met behulp van pincet (figuur 2B). De longslagader kan worden geklemd met de pincet op hetzelfde moment. Daarna het weefsel is opgetild en vloeibare agarose is zachtjes ingeprent in de luchtwegen.
Afhankelijk van de positie van de katheter, kan een meerderheid van het weefsel worden gevuld met vloeibare agarose (figuur 2D). Optioneel, misschien kegel zoals delen van het longweefsel, die van de Long parenchym geventileerd door de gepenetreerd bronchiën weerspiegelen, krijgen gevuld met de agarose (figuur 2C). In beide scenario's, een karakteristiek patroon van stevig gevulde weefsel regio's kan worden waargenomen: ten eerste een groot deel van het weefsel in wiggen (figuur 2D) is gevuld, of in de tweede, kleinere uitsteekt ronde gebieden van grondig gevulde weefsel gebieden weergegeven ( Figuur 2C). Als delen van de luchtwegen als gevolg van agarose stolsels of andere oorzaken, verhindert kunnen delen van het weefsel niet worden goed gevuld met agarose. Dus, slechts een deel van het weefsel kunnen gelden voor het snijden. In geval van lekkage tijdens de agarose vullen procedure, delen van de gevulde respiratoire tree kunnen krijgen geperforeerd en vullen van het longweefsel krijgt echter bijna onmogelijk, mogelijke oplossingen omvatten het vullen via een meer perifere bronchiën, een diepere penetratie van de canule in de distale luchtwegen (Figuur 2 g), of potentiële klemmen van de lekkage ruimte (Figuur 2 H).
Precisie-cut Long snijden
Weefsel blokken op een lengte en breedte van 1-1,5 cm werden weggesneden uit weefsel regio's, die waren helemaal gevuld met gestold agarose ()figuur 3A-3B). Hierna waren de individuele weefsel blokken gelijmd op de houder van het weefsel van de vibratome (Figuur 3 c). 500 µm dik Thuiskopieerheffingen werden gegenereerd, overwegende dat het weefsel blok op de vibratome was bevordering van vooruit met snelheden tussen 3-12 µm/s. (figuur 3D-3F). Ten slotte waren de Thuiskopieerheffingen ondergedompeld in cel kweekmedium dat 0,1% (g/v) foetale runderserum en gekweekt op standaard cel kweekomstandigheden, als overzicht stap 7.
Experimentele uitlezingen van menselijke 3D-LTC na 48u van kweken
Een representatieve immunofluorescentie kleuring, zoals eerder beschreven door Alsafadi et al.25, wordt weergegeven in figuur 4A-4 C. Immunolabeling van fibronectine (rood) en celkernen (DAPI, blauw), toegestaan voor beeldvorming van de bewaarde alveolaire structuur in de menselijke 3D-LTC ex vivo. Behandeling van de mens Thuiskopieerheffingen stoten met een profibrotic cytokine cocktail (met inbegrip van transformerende groeifactor bèta 1, bloedplaatjes afgeleid groeifactor AB, lipophosphatidyl zuur en tumornecrosefactor alfa) voor 48u geleid tot fibrose-achtige veranderingen in de mens 3D-LTCs. Door qPCR, werd een belangrijke inductie van de fibrose-relevante extracellulaire matrix onderdelen collageen type 1 en fibronectine genen in 3D-LTC stoten waargenomen op een behandeling met de profibrotic cocktail (Figuur 4 d). Bovendien eiwitniveaus voor de mesenchymale marker vimentin bleken upregulated in 3 van de 4 patiënten na behandeling van 3D-LTC stoten (figuur 4E).
Figuur 1: Workflow van Thuiskopieerheffingen generatie. Tumor-vrije gebieden van Long resections worden grondig geïnspecteerd als gevolg van hun integriteit van weefsel. Als het weefsel is gescoord is geschikt voor verder gebruik (scoren is uitvoerig besproken in de sectie materiaal en methoden), het volgende is gevuld met vloeibare agarose. Weefsel blokken gevuld met gestold agarose worden vervolgens gesneden met een vibratome. Ondergedompeld in cel kweekmedium, worden 3D-LTC gekweekt tot 120 h na hun generatie. Stroomafwaarts analyses van de 3D-LTCs betrekken - of RNA-eiwituitdrukking, live-weefsel fluorescentie imaging, evenals immunofluorescentie kleuring na fixatie van het weefsel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: het longweefsel vullen met lage-melting point agarose. Het longweefsel is gecanuleerd met een perifere veneuze katheter die is ingevoegd in een bronchiën grenzend aan de longslagader (figuur 2A). Pincet zijn gebruikt de canule oplossen in de bronchiën en klem de longslagader Voorkom lekken van de vloeibare agarose. Vloeibare agarose bij 42 ° C wordt gegoten in het longweefsel met een 30 mL spuit (figuur 2B). Een distale positionering van de canule tijdens het vullen zal resulteren in kleine gebieden van gevulde weefsel (figuur 2C), terwijl het proximale positionering zorgt voor het vullen van een groter volume van weefsel (figuur 2D). Eventuele obstakels voor de luchtwegen zal verminderen het bedrag van weefsel volume die kan worden gevuld (figuur 2E). In het geval van het agarose lekken, een distale canule positionering en/of klemmen van de kant van de lekkage kan goede agarose vullen van het longweefsel ()figuur 2F-2 H). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: precisie-cut Long snijden. Een succesvol op agarose gevulde longweefsel wordt gebruikt een stuk van een weefsel blok accijnzen (1 x 1,5 cm x 1 cm) met een scalpel (figuur 3A). Naast het verwijderde weefsel blok is gelijmd aan de houder van het weefsel, schaal balk geeft aan 1 cm (figuur 3B). Het weefsel is bij voorkeur gelijmd met zijn pleurale oppervlakte op het oppervlak van de houder van het weefsel zoals aangegeven in Figuur 3 c. 500 µm dikke plakjes worden gesneden door de vibratome met een sapphire mes in een hoek van 10° - 15° ten opzichte van het weefsel (figuur 3D en 3E). Het snijden procedure resulteert in 2-3 cm3 grote intact Long segmenten, schaal bar = 5 mm (figuur 3F). Bovendien, met behulp van een biopsie perforatie, kunnen kleine reproduceerbare stoten met een diameter van 4 mm worden gegenereerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: experimentele uitlezingen van menselijke 3D-LTCs na 48u van cultuur. Een menselijke 3D-LTC punch diameter van 4 mm immunostained voor fibronectine (in rood) en de DAPI (in blauw) was ()figuur 4A-4C). Schaal bars = 1.000 µm. figuur 4C shows de samengevoegde afbeelding. RNA analyse van Thuiskopieerheffingen door kwantitatieve RT-PCR blijkt significante toenames van de genexpressie van COL1A1 en FN1 door de profibrotic cocktail25. Figuur 4E toont een immunoblot van hele eiwit lysates van Thuiskopieerheffingen, die werden behandeld met een fibrotische cocktail25. Indringende voor Vimentin en β-actine aangetoond een verhoogd eiwit expressie van de mesenchymale markering (vimentin) na behandeling met profibrotic in patiënt monsters 1, 3 en 4 factoren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Criterium | Punten |
| Het weefsel monster heeft intact pleurale oppervlakte. | 20 |
| Het weefsel monster lijkt macroscopisch intact, ontbreekt insnijdingen, pletten, scheuren en vervormingen. | 20 |
| Het weefsel monster bevat ten minste één bronchiën met een diameter > 1mm. | 20 |
| Het weefsel monster bevat geen of slechts weinig bedraagt van bloed. | 4 |
| Het monster weefsel volledig was opgeslagen in medium en vertoont geen voor de hand liggende atelectase. | 4 |
| Het weefsel monster was gereseceerd binnen de laatste vier uur. | 4 |
| Het weefsel monster is groter dan de grootste diameter van 5cm. | 4 |
| Score in de som: |
Tabel 1: Lung Agarose vullen Score. De Long Agarose vullen Score (LAFS) correleert met de succes-tarief te vullen de resectie van een weefsel met agarose voor zijn volgende vibratome gebaseerde Thuiskopieerheffingen productie. De score vat alle punten van de criteria voldaan door het weefsel. Een LAFS gelijk zijn aan of boven 72 voorspelt goed agarose vullen eigenschappen, een score lager dan 60 voorspelt een zeer waarschijnlijk gebrek agarose vullen van het weefsel.
Discussion
Het protocol beschreven in dit manuscript heeft betrekking op de generatie van Thuiskopieerheffingen van menselijke Long weefsel resectates door het te vullen met vloeibare agarose en latere vibratome snijden. Generatie van weefsel segmenten werd aangetoond voor voor een paar organen, zoals lever en hersenen, overwegende dat de inherente stijfheid van deze organen toegestaan direct snijden zonder enige wijziging van het weefsel. Van de nota is de eerste goede voorbereiding van het longweefsel de meest cruciale stap bij het genereren van Thuiskopieerheffingen. Agarose vullen van de longen is de methode van keuze te stabiliseren van het zachte en elastische karakter, en om een homogene en reproduceerbare Thuiskopieerheffingen generatie. Grote luchtwegen van de gereseceerd longweefsel zijn gecanuleerd om toegang tot de kleine luchtwegen, alsmede tot de parenchym intact longkanker. Het ontbreken van een intact borstvlies, waardoor agarose vullen bijna onmogelijk is, is een belangrijke reden waarom longweefsel meestal niet bruikbaar voor het snijden van de longen is. Prospectief, kon een synthetische borstvlies oorspronkelijk ontworpen voor het uitvoeren van functionele experimenten op decellularized steigers potentieel worden toegepast om succesvol agarose vullen van explantaten dat het gebrek aan een intact borstvlies31. Resections wat resulteert in een stuk weefsel menselijke longen met intact borstvlies zijn essentieel voor het genereren van weefsel blokken voor het snijden. Gereseceerd weefsel is meer beschikbaar is vanwege een tumor-vrije weefsel van kanker resections dan volledig intact lobben of geheel-lung explantaten van patiënten die longtransplantatie onderging.
Algemeen, twee systemen worden gebruikt voor de productie van Thuiskopieerheffingen: de Krumdieck weefsel slicer15 en vibrerende microtomes (vibratomes). Plakjes weefsel slicers genereren door een blok van weefsel door een metalen schip, dat de Thuiskopieerheffingen op 90° aan het einde van dit schip snijdt. Vibratomes genereren Thuiskopieerheffingen door het bewegen van een trillende mes horizontaal over een verankerde blok van weefsel dat is ondergedompeld in een gekoelde middellange bad, die ten opzichte van de Krumdieck-slicer oefent minder schuintrekken kracht op het weefsel. Dit resulteert in minder harde behandeling van het weefsel voor teelt. Aan de andere kant, is de vibratome snijden meer tijd en werk consumeren. In onze handen stoten vibratome de productie van een maximum van 100 Thuiskopieerheffingen of 500 Thuiskopieerheffingen ingeschakelde snijden in één dag, voldoende voor meest experimentele studies. Thuiskopieerheffingen kunnen worden gekweekt op verschillende manieren: (a) verbonden aan Trans-putjes, dus het genereren van een vloeibare air-interface (ALI) systeem, (b) als dynamische orgel cultuur (DOC), of (c) ondergedompeld in een cel kweekvloeistof bij standaard cel cultuuromstandigheden. De in-detail teelt van Thuiskopieerheffingen was eerder beschreven22,23,25; een gemeenschappelijke norm voor teelt voorwaarden tussen hun gebruik in verschillende laboratoria over de hele wereld ontbreekt echter nog. In het bijzonder de cultuur tijd misschien wel kritisch: zoals in lymfkliertest Thuiskopieerheffingen, een verlies van SFTPC positieve alveolaire type 2 cellen wordt waargenomen na 144 uur, doch uiterlijk tot 120 h22. Bovendien lijkt de metabole activiteit te blijven stabiel in lymfkliertest22 en menselijke Thuiskopieerheffingen25 voor 120 h.
Er zijn een paar technische beperkingen voor de generatie van Thuiskopieerheffingen: het aantal en de grootte van de resectates schommelt na verloop van tijd; de efficiëntie van het agarose vullen, die afhangt van de aanwezigheid van intact borstvlies binnen het verkregen weefsel, bepaalt het uiteindelijke succes van de generatie van Thuiskopieerheffingen; en weefselvernietiging veroorzaakt door pathologische veranderingen binnen de (zieke) verkregen longweefsel kan interfereren met de voorbereiding van Thuiskopieerheffingen. Airway obstakels en fibrotische weefsel ontbreekt intact alveolaire ruimte met agarose vullen en belemmeren waardoor het snijden van het fibrotische weefsel een veeleisende taak. Emphysematous weefsels als gevonden in ziekten, zoals COPD of alpha-1-anti-trypsine deficiëntie kan niet weerstaan de druk van agarose vullen, en in breuk van de longblaasjes en architecturale artefacten resulteren zal. In deze gevallen het gebruik van lage agarose concentratie, bijvoorbeeld, 1% (m/v), kan het zinvol om te verminderen van de druk en snelheid tijdens het agarose vullen. Over het geheel genomen kunt de toestand van de ziekte van het weefsel drastisch beperken het gebruik van het weefsel voor Thuiskopieerheffingen generatie. Al deze parameters bepalen de hoeveelheid Thuiskopieerheffingen die kan worden gegenereerd vanuit longweefsel, en ook de hoeveelheid tijd die het duurt om te produceren de Thuiskopieerheffingen. Verdere zijn beperkingen van Thuiskopieerheffingen tegenstrijdigheden tussen verschillende Long segmenten met betrekking tot grootte of weefsel inhoud, waarvoor verdere normalisatie stappen voor experimenten. Om dit te verhelpen, kunnen biopsie stoten van vergelijkbare regio's in hetzelfde segment worden gegenereerd. Deze procedure is geschikt om de variabiliteit van het weefsel en, als een bijkomend voordeel, verhoging van het aantal Thuiskopieerheffingen monsters die kunnen worden gebruikt voor experimenten.
Kortom, menselijke 3D Long weefselcultures van agarose gevuld Thuiskopieerheffingen bieden een complexe menselijke model voor het bestuderen van de Fysiologie van de longen en ziekten. Het protocol bevat een gedetailleerde beschrijving van de voorbereiding van Thuiskopieerheffingen uit gereseceerd longweefsel en hun teelt, en bovendien adressen uitdagingen in agarose vullen van menselijke Long resections en hoe om ze te overwinnen.
Disclosures
Alle auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs zijn Marisa Neumann dankbaar voor deskundige technische bijstand. Alle weefsels van de longen werden vriendelijk geleverd door het CPC-M Bio-archief. Dit werk werd ondersteund door het Duitse centrum van longkanker onderzoek (DZL), de Helmholtz associatie- en CPC-Onderzoekschool subsidies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | - | |
| Hyrax CU 65 | Zeiss | - | |
| Vasofix Braunüle 18 G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
| 30 mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
| Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
| Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
| Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | - | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
| Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
| Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
- Rosenberg, S. R., Kalhan, R., Mannino, D. M. Epidemiology of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Prevalence, Morbidity, Mortality, and Risk Factors. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine Med. 36 (4), 457-469 (2015).
- Hekking, P. P., et al. The prevalence of severe refractory asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (4), 896-902 (2015).
- Woodard, G. A., Jones, K. D., Jablons, D. M. Lung Cancer Staging and Prognosis. Cancer Treatment and Research. 170, 47-75 (2016).
- Ley, B., Collard, H. R., King, T. E. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 183 (4), 431-440 (2011).
- Burgstaller, G., et al. The instructive extracellular matrix of the lung: basic composition and alterations in chronic lung disease. European Respiratory Journal. 50 (1), (2017).
- Degryse, A. L., Lawson, W. E. Progress toward improving animal models for idiopathic pulmonary fibrosis. The American Journal of the Medical Sciences. 341 (6), 444-449 (2011).
- Fricker, M., Deane, A., Hansbro, P. M. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 9 (6), 629-645 (2014).
- Sagar, S., Akbarshahi, H., Uller, L. Translational value of animal models of asthma: Challenges and promises. European Journal of Pharmacology. 759, 272-277 (2015).
- Williamson, J. D., Sadofsky, L. R., Hart, S. P. The pathogenesis of bleomycin-induced lung injury in animals and its applicability to human idiopathic pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 41 (2), 57-73 (2015).
- Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of beta2-adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
- Skronska-Wasek, W., et al. Reduced Frizzled Receptor 4 Expression Prevents WNT/beta-Catenin-driven Alveolar Lung Repair in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 196 (2), 172-185 (2017).
- Lehmann, M., et al. Senolytic drugs target alveolar epithelial cell function and attenuate experimental lung fibrosis ex vivo. European Respiratory Journal. 50 (2), (2017).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Ebsen, M., et al. Infection of murine precision cut lung slices (PCLS) with respiratory syncytial virus (RSV) and chlamydophila pneumoniae using the Krumdieck technique. Pathology - Research and Practice. 198 (11), 747-753 (2002).
- Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
- Royce, S. G., et al. Airway Remodeling and Hyperreactivity in a Model of Bronchopulmonary Dysplasia and Their Modulation by IL-1 Receptor Antagonist. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (6), 858-868 (2016).
- Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 309 (10), L1219-L1228 (2015).
- Zscheppang, K., et al. Human Pulmonary 3D Models For Translational Research. Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).
- Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Human & Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
- Wang, L., et al. Differences between Mice and Humans in Regulation and the Molecular Network of Collagen, Type III, Alpha-1 at the Gene Expression Level: Obstacles that Translational Research Must Overcome. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 15031-15056 (2015).
- Uhl, F. E., et al. Preclinical validation and imaging of Wnt-induced repair in human 3D lung tissue cultures. European Respiratory Journal. 46 (4), 1150-1166 (2015).
- Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicology and Applied Pharmacology. 246 (3), 107-115 (2010).
- Banerjee, A., et al. Trichostatin A abrogates airway constriction, but not inflammation, in murine and human asthma models. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 132-138 (2012).
- Alsafadi, H. N., et al. An ex vivo model to induce early fibrosis-like changes in human precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), L896-L902 (2017).
- Westra, I. M., Oosterhuis, D., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut liver slices as a model for the early onset of liver fibrosis to test antifibrotic drugs. Toxicology and Applied Pharmacology. 274 (2), 328-338 (2014).
- Vatakuti, S., Schoonen, W. G., Elferink, M. L., Groothuis, G. M., Olinga, P. Acute toxicity of CCl4 but not of paracetamol induces a transcriptomic signature of fibrosis in precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 29 (5), 1012-1020 (2015).
- Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Disease Models & Mechanisms. 8 (10), 1227-1236 (2015).
- Li, M., de Graaf, I. A., Groothuis, G. M. Precision-cut intestinal slices: alternative model for drug transport, metabolism, and toxicology research. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (2), 175-190 (2016).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Wagner, D. E., et al. Design and Synthesis of an Artificial Pulmonary Pleura for High Throughput Studies in Acellular Human Lungs. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 184-195 (2014).
