Summary
여기, 우리는 생물 학적 및 생물 의학 연구에 모델 인간의 폐 질병에 3D 폐 조직 문화를 생성 하는 데 적합 한 절제 환자 조직에서 인간의 정밀 컷 폐 agarose 가득 조각의 준비에 대 한 프로토콜 제시.
Abstract
인간의 질병에 새로운 발견의 번역은 질병의 인간 조직 기반 모델의 가용성에 의해 제한 됩니다. 정밀 컷 폐 (웹) 사용 하는 3D 폐 조직 문화 (3D-Ltc) 대표는 우아한 조각과 관련성이 높은 생물학 3D 셀 문화 모델, 매우 닮는 그들의 복잡성, 역학 때문에 원래의 조직 및 분자 구성입니다. 조직을 자르는 널리 다양 한 동물 모델에 적용 됩니다. 3D-Ltc 인간의 웹에서 파생 된 더 메커니즘 및 인간의 조직에 약물의 기능 효과 더 잘 이해 하는 데 도움이 수도 있습니다 새로운 약물에 대 한 응답을 분석을 사용할 수 있습니다. 환자의 폐 lobectomy 경험, 수술 절제 폐 조직 샘플에서 웹의 준비 증가 질병의 접근 및 peritumoral 조직. 여기, 우리 인간의 웹 수술 절제 소프트 탄성 환자 폐 조직에서의 세대에 대 한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 따라서 폐 구조를 유지 하 고 후속 부 러 뜨 리는 중요 한 조직의 강성 증가 Agarose는 resectates의 bronchoalveolar 공간에 도입 되었다. 500 µ m 두께 슬라이스는 vibratome와 함께 조직 블록에서 준비 되었다. 웹에서 찍은 생 검 펀치 유사한 조직 샘플 크기 고 더 조직 샘플의 양을 증가. 생성 된 폐 조직 문화는 다양 한 이상과 그것의 최고의에서 (sub-) 세포 수준에서 거리 프로세스와 같은 다른 질병의 기계 장치를 포함 하 여 인간의 폐 생물학에서 연구에에서 적용할 수 있습니다. 3D-LTC 비보 전 모델의 최고 장점은 3D 조직 아키텍처, 셀 유형 다양성 및 폐 해부학 뿐만 아니라 개별 환자에서 조직 평가 대 한 가능성에 대 한 원래의 인간 폐의 그것의 가까운 표현입니다는 정밀 의학에 대 한 새로운 전략 개발 관련이 있다.
Introduction
만성 및 급성 폐 질환은 병 적 상태와 사망률 전세계1의 주요 원인이 다. 폐쇄성 폐 질환 (COPD)2, 심한 천식3, 폐 암4 확산 parenchymal 폐 질환5같은 만성 폐 질환 환자, 치료 요법 현재 사용할 수 있습니다. 폐 질환 동물 모델에서 연구 질병 pathomechanisms6 의 이해를 심화 하 고 잠재적인 새로운 치료 목표7,8,의9의 id에 지도 이 모델 관련 생물학과 생리 적인 차이 인간10에 비해 전시. Murine 인간과 생물학 뿐만 아니라 해부학, ex vivo 3D 폐 조직 문화 인간 사이의 이러한 차이 극복 하기 위해 (3 차원-LTC) 시스템 생물 의학 연구의 다양 한 분야에서 사용 됩니다. 이러한 3D LTC 문화 시스템 정밀 컷 폐 조각 (웹)을 기반으로 합니다. Ex vivo 웹의 세대 수 세 번째 공간 차원, 전체 폐 포 및 항공11, 뿐 아니라 interstitium, 맥 관 구조에 있는 셀의 공간 및 기능적 관계의 조사에 대 한 수의 분석 및 mesothelium입니다. 특히, ex vivo 모델 웹은 다세포, 그들은 현장에서 폐의 기능적인 세포 포함 의미, 따라서 밀접 하 게 대표 하는 셀의 원래 생물 환경 및 따라서 제한 된 셀 대부분 2D 상호 작용 세포-매트릭스를 극복 세포 배양에 접근 한다. 지금까지, ex vivo murine 웹 폐 질환, COPD12, 폐 섬유 증13, 폐 암14, 바이러스 성 감염15,16, bronchopulmonary 발육 이상17, 같은 모델에 사용 된 고 천식18. 그러나, 새로운 약물 요법 임상 시험에서 조사 되었다 인간 폐 질환에서의 상당한 비율 번역 하지 않습니다 효능 또는 안전의 그들의 부족으로 인해 병원에 가정 하 여로 인해 아직 인간 사이의 상당한 차이 murine 생물학 및 질병19,,2021.
몇 년 동안 인간의 웹 주로 화학 물질 및 약물의 폐 독성을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 최근, 인간의 폐 조직 병 태 생리 및 약리 연구를 추구 하 COPD22,23,24, 천식 폐 섬유 증25, 환자에서 사용 되었습니다. 으로 절제 환자 장기 소재를 사용 하 고 생성 하는 웹, 하나는 복잡 한 3 차원 조직 환경22 대표 및 장기의 원시 세포 다양성의 대부분을 유지 하는 주요 질병 특징 정리 수 있습니다. 또한, 실험 설정의 다양 한 적용 병에 걸리는 조직 간, 소장, 신장26,27,,2829질병 같은 변화를 모방 표시 했다.
그러나, 처리 폐 조직의 여러 가지 이유로 도전 남아 있습니다. 단단한 조직, 달리 네이티브 폐 실질 환기 없이 축소 하는 경향이 있다 그리고 전시 더 낮은 조직 강성. 이러한 속성은 조직의 슬라이스 방해. 따라서, 항공 및 낮은 녹는 포인트 agarose와 치조 공간 작성 네이티브 폐 구조를 유지 하 고 정밀 컷 murine 인간과 폐30의 조각화에 필요한 강성을 제공 합니다. 인간의 폐 resectates 연구 목적으로 기증 함으로써 그들의 본성 해부학, 유전자 및 생리 적으로 매우 다양 한, 따라서 종종 제시 높은 간 환자 변화 실험25를 수행할 때 있습니다. 전체 엽 또는 전체 폐 explants는 달리 흉부 수술을 통해 절제 하는 폐 샘플 반드시 해부학 세그먼트를 따라 고, 그러므로, 특별 한 준비가 필요. 이 문서에서는, 우리 모델 폐 질환 폐 절제 조직 및 후속 재배 실험 사용에서 인간의 웹의 세대에 대 한 상세 하 고 최적화 된 프로토콜을 제공합니다.
Protocol
인간의 조직 사용 루드비히 Maximillian 대학 [뮌헨, 독일 (프로젝트 번호 455-12)]의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 인간의 종양 무료 폐 절제술 Asklepios Biobank 폐 질병 (가 우 팅, 독일 프로젝트 번호 333-10)에 의해 제공 되었다.
참고: 인간의 웹 제작 (그림 1)의 모든 절차는 살 균 층 흐름 후드 수행 됩니다.
1입니다. 기기 및 재료의 준비
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아래 설명 된 대로 agarose와 폐 조직의 인플레이션에 대 한 모든 자료를 준비 합니다.
- 준비 하는 재배 매체: Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) F-12 L-글루타민, HEPES, 10000 IE 페니실린, 10000 IE 스 및 0.1% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청으로 보충.
참고: 37 ° c.에 사용 되는 매체 - 휴지로 덮여 살 균 금속 트레이 준비 합니다. 트레이에 살 균 15 cm 세포 문화 접시를 놓습니다.
- 재배 매체의 15 mL로 세포 배양 접시를 채우십시오.
- 적절 한 양의 재배 매체의 30 mL의 최소의 낮은 녹는 포인트 agarose를 용 해 하 여 3% (w/v) agarose 용액을 준비 합니다.
- 끓는 때까지 전자 레인지에 솔루션을 열. 차가운 물 욕조에 42 ° C에 agarose 솔루션. 물 목욕에 저장 된 액체 agarose 솔루션을 유지.
- 액체 agarose 가득 여러 50 mL 원뿔 튜브를 준비 합니다.
- 준비 하는 재배 매체: Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) F-12 L-글루타민, HEPES, 10000 IE 페니실린, 10000 IE 스 및 0.1% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청으로 보충.
2. 절제 폐 조직
- 스토어 lobectomy resectates 3 단계까지 4 ° C에서 DMEM F-12 매체에 절제 직후의 신선한 종양 무료 폐 조직.
- 처리 전에 4-8 h의 냉 허 혈 시간을 초과 하지 마십시오.
3. 검사 및 Agarose 작성 전에 절제 조직의 선택
- 핀셋으로 매체에서 티슈를 들어올립니다. 늑 막, 특히 조직에 어떤 손상을 방지 하기 위해 항공만 핀셋으로 조직을 처리 합니다.
- 폐 Agarose 작성 점수 표 1에 정의 된 기준에 의해 조직 품질 점수.
- 조직의 품질 이상 크거나 72 득점 하는 경우 4 단계로 진행 합니다. 조직의 품질 60 아래 득점 하는 경우 계속 하지 마십시오 agarose 작성으로 더.
참고: 조직 점수는 60 ~ 68, agarose 채우기 및 조직을 자르는 여전히 합리적인 결과 생산 수 있습니다 그리고 실험의 연장에 대 한 최종 결정 케이스에 케이스를 만들 수 있다. 그러나, 위에서 언급 한 요구 사항을 충족 하지 않은 폐 조직 대부분 agarose 작성에 실패 합니다.
4. 폐 조직 인플레이션 Agarose 작성
- 리프트는 저장 매체에서 조직 및 조직에서 초과 미디어 드레인. 1.1.2에 15 cm 문화 접시에 폐 조직을 전송 합니다.
- 1.1.3에서 낮은 용 해 점 agarose로 30 mL 주사기를 채우십시오.
- 주변 정 맥 카 테 터는 obturator를 제거 하 여 준비 하 고 30 mL 주사기에 부착
- 조직의 그대로 섹션 환기는 조직에서 기관지 (0.5-3 m m 직경)를 식별 ( 그림 2참조).
- 선택 된 기관지는 캐 뉼 러 삽입 (0.5-3 m m 직경).
- 가볍게 눌러 최대한 부드럽게 앞으로 정.
- 집게, 이상적으로 동시에 모든 인접 한 폐 동맥을 죄와 정 주위 기관지 벽을 압축 하 여 기관지는 정 주위를 봉인.
- 이 기도 통해 새 agarose를 방지 하기 위해 수술 클램프와 다른 추가 항공을 가리고.
- 조직 문화 접시에서 집게로 들어올립니다.
- 수동으로 부는 agarose는 주사기로 0.3 mL/s 보다 더 빨리. Agarose 작성의 속도 약 0.05와 0.3 mL/s 항공 atelectasis의 이기종 저항 때문 달라질 수 있습니다.
-
작성 또는 agarose는 조직에서 새 동안 높은 저항, 관찰 단계 4.4에서에서 다른 기관지와 모든 절차를 다시 시도 합니다. 아래에 설명 된 문제 해결을 수행 합니다.
참고: Agarose 작성의 정도 매우 조직에서 카 테 터의 위치와 폐 조직 (그림 2C)의 지역 (*)와 같은 작은 원추형의 agarose 충전 카 테 터의 깊은 침투에 의존 합니다.- 높은 저항 일 경우 대부분 지역 조직 (#) (2D 그림)의 적절 한 충전을 카 테 터 리드의 위치를 보십시오.
- 근 위 기관지 또는 장애물 (화살표) (그림 2E) 조직의 불완전 한 충전으로 이어질 수 있습니다 다른 기도에서 초기 응고 agarose의 플러그로 강요 하지 마십시오 agarose 작성으로이 결함의 작성에만 채워진된 영역의 이어질 수 있습니다 방해 조직 부분입니다.
- Cannulated 기관지에서 파생 된 호흡 나무 절제와 agarose 액체 agarose ( 그림 2F에 화살표)의 일정 한 유출에 결과 작성 하는 동안 손상 되 면 기도 시스템의 더 주변 부분으로 카 테 터를 삽입 조직 (*) (그림 2G)의 적어도 사소한 부분을 입력 합니다. 또한, 수술 용 클램프 (화살표) (그림 2 H)와 손상된 주변 기도 인감.
- 폐 조직에 완전히 채워집니다 때까지 agarose를 적용 합니다. 할 하지 지나치게 부 풀 려 조직이 조직 구조와 그것의 세포에 돌이킬 수 없는 손상을 발생할 수 있습니다.
- 작성에 사용 된 기관지 클램프 즉시. 정 죄 하기 전에 제거 합니다.
- Agarose 응고 되도록 30 분 동안 4 ° C에서 배양에서 조직 품 어.
- 절제 조직 여러 기관지 항목 경우, 반복 단계 4.2 4.13 조직의 모든 부분 agarose로 가득 차 있습니다.
- 슬 라이 싱까지 4 ° C 차가운 매체에 가득 agarose 폐 조직 단면도 저장 합니다.
5. 정밀 컷 폐 슬 라이 싱
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단단하게는 agarose 가득 폐 조직에 영역을 식별 합니다. 그들은 세포 배양 접시의 바닥에 대 한 족집게로 누르면 부드럽게 때 단단하게 채워진된 영역이 축소 되지 않습니다.
- 소비 1-1.5 c m3 블록 한쪽 아직도 늑 막으로 적용 되어야 하는 반면 5.1, 설명 하는 영역입니다.
- Cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여는 vibratome의 소유자에 게 연락 하는 흉 막 쪽으로 각 개별 조직 블록을 연결 합니다.
참고: 늑 막 약간 신축성 이며 따라서 vibratome 블레이드와 절단을 방해 한다. 에 조직 홀더, 늑 막 절단 방해 하지 않습니다 그리고 배치, 중요 한 것은, cyanoacrylate 접착제와 접착제의 최소한의 확산을 허용 하는 조직의 실질 사이 자연 장벽을 형성. - 다음 설정 사용 하 여 vibratome와 폐 조직 슬라이스: 두께: 500 µ m, 주파수: 100 Hz, 칼의 진폭: 1.2 m m, 3-12 µ m/s, 조직의 강성에 달려 있는 잎의 앞으로 속도. 조각을 제대로 절단 하지 또는 조직 블록 자체 진동 하기 시작 하는 경우 잎의 돌출 속도 줄일 수 있습니다.
- 부드럽게 재배 매체 가득 12-잘 접시의 우물에 vibratome 트레이 집게와 그것을 해제 하 여 슬라이스를 전송. 마지막으로, 표준 세포 배양 조건에서 인큐베이터에서 폐 슬라이스를 품 어.
- Cyanoacrylate 접착제가 지역의 조직 무결성을 손상 수 이후 unsliced 중지 슬라이스 조직 블록의 2-3 m m 남아 있습니다.
6입니다. 웹 펀치의 생성
- 한 우물에서 빈 10 cm 접시 폐 슬라이스를 전송.
- 웹의 상부 표면에 기가 4mm 생 주먹 놓고 시계 방향 및 시계 반대 방향으로 회전에는 주먹을 이동 하기 시작 합니다.
- 96 잘 접시의 우물에 세포 배양 매체를 입력 합니다. 집게와 조직 펀치를 들어올리고 96 잘 접시의 우물에는 펀치를 전송 합니다. 마지막으로, 1.1.1에 매체에 빠져들 폐 펀치를 품 어. (산소 21% (v/v), 37 ° C에서 5% (v/v) 이산화탄소와 95% 습도) 표준 조건 하에서 세포 문화 인큐베이터에서
7. 조직 문화 및 샘플 채취
- 문화는 웹 및 펀치는 표준 세포 배양 조건에서 인큐베이터에서 하룻밤.
- 웹 문화와 최대 120 시간 후 세포 생존 능력 및 기능을 보장 하기 위해 그들의 세대에 대 한 명시 된 조건 하에서 펀치.
- 단백질으로 RNA를 수확, 웹 및 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에서 3 번 펀치를 세척, cryovials에 그들을 전송 및 스냅-동결에 액체 질소.
-
예제 양식된 웹의 중간 상쾌한 분 비 단백질의 분석에 대 한 펀치.
- 조직학 분석에 대 한 웹 및 펀치 PBS로 3 회 세척 하 고 37 ° c.에 30 분 동안 배양 하 여 4 %paraformaldehyde 수정 마지막으로, 추가 다운스트림 얼룩 4 ° C에서 PBS에는 웹을 저장 합니다.
Representative Results
웹 생성
웹의 세대는 4 개의 필수 단계로 분리 될 수 있다: 외과 폐 조직 절제, agarose 작성, vibratome 기반 웹 생성 및 웹의 문화. 절제 폐 조직 낮은 녹는 포인트 agarose를 부 러 뜨 리 폐 조직에 필요한 강성을 추가 하 고 기본 폐 구조 및 아키텍처를 채워집니다. 노트, 웹 세대 매우 시간이 소모 되, 따라서 종종 DMEM F-12 매체에 채워진된 폐 조직의 하룻밤 저장 추가 단계 포함 될 수 있습니다 이며 웹 세대는 다음날에 시작 했다. 다음 실험 설정에 따라 생성 된 웹 표준 세포 배양 실험 조건 적용 전에 0.1% (w/v) 태아 둔감 한 혈 청에 포함 된에 하룻밤 incubated 수 수 있습니다. 3D-Ltc 했다 가능한 최대 120 h22 문화 조건에이 프로토콜 (그림 1)에서 설명 하 고 추가 개선 그에 따라 최적화 될 수 있습니다 세포 기능 (예: 계면 활성 제 단백질 분 비)를 전시.
Agarose 작성
Agarose 조직 작성, 위해 agarose 채워진 주사기에 부착 된 1.3 m m 직경을 가진 주변 정 맥 카 테 테 르의 정 컷된 조직 (그림 2A)의 표면에 기관지에 삽입 되었다. 기관지는 폐 동맥 가까이 종종 지역화 됩니다. 동안 동맥 얇은 벽 축소 하는 경향이, 기관지에 좋은 표시 루멘 전시. 조직의 무결성에 따라 테 폐의 주변으로 호흡 나무의 여러 세대를 통해 고급 수 있습니다. 관통된 기관지는 정 주위 핀셋 (그림 2B)를 사용 하 여 봉인 했다. 폐 동맥 동시에는 핀셋으로 고정 될 수 있습니다. 이후에, 조직 해제 하 고 액체 agarose는 기도로 얻은 부드럽게.
카 테 터의 위치에 따라 조직의 대부분 액체 agarose (그림 2D)으로 채울 수 있습니다. 필요에 따라 관통된 기관지에 의해 환기 폐의 실질을 반영, 폐 조직의 부분 처럼 콘 (그림 2C) agarose 가득 얻을 수 있습니다. 두 시나리오에서 단단하게 채워진된 조직 영역의 특성 패턴 관찰 될 수 있다: 첫째, 조직의 주요 부분 웨지 (그림 2D), 입력 또는 둘째로, 철저 하 게 지역 라운드 튀어나온 작은 채워진된 조직 영역 표시 ( 그림 2C). 기도의 부분 agarose 혈전 또는 다른 원인으로 인해 방해를 하는 경우 조직의 부품 수도 하지 제대로 채워질 agarose. 따라서, 조직의 부분에만 적용 부 러 뜨 리 수 있습니다. 그러나 프로시저를 작성 하는 agarose 중 누설, 경우 채워진된 호흡 나무의 부분 천공 얻을 수 및 폐 조직의 작성 거의 불가능 한, 가능한 해결 방법을 포함 깊은 더 주변 기관지를 통해 작성 침투 원심 항공 (그림 2G), 또는 누설 영역 (그림 2 H)의 잠재적인 클램핑 력은 정의
폐 정밀 컷 슬라이스
길이와 폭 1-1.5 cm의 조직 블록 완전히 응고 agarose (그림 3A로 가득 했다 조직 영역에서 excised 했다-3B). 다음, 개별 조직 블록 vibratome (그림 3C)의 조직 홀더에 붙어 있었다. 500 µ m 두께 웹 생성 된 반면는 vibratome에서 조직 블록 3-12 µ m/s. 사이 속도와 앞으로 전진 했다 (그림 3D-3 층). 마지막으로 웹 0.1% (w/v) 태아 둔감 한 혈 청을 포함 하는 셀 문화 매체에 빠져들 하 고 개요 단계 7로 표준 세포 배양 조건에서 배양 했다.
경작의 48 h 후 인간의 3D-LTC의 실험 정보
대표적인 면역 형광 염색, 앞에서 설명한 Alsafadi 외.25 그림 4A-4 C에 표시 됩니다. Fibronectin (빨간색)와 세포 핵 (DAPI, 블루), ex vivo 인간의 3D LTC에서 보존된 치경 구조의 이미징에 대 한 허용의 Immunolabeling. 48 h 결과 섬유 증 같은 인간의 변화에 대 한 치료는 인간의 웹 profibrotic cytokine 칵테일 (를 포함 하 여 변형 시키는 성장 인자 beta 1, 혈소판 파생 된 성장 인자 AB, lipophosphatidyl 산, 및 종양 괴 사 인자 알파)와 펀치 3D-Ltc입니다. 정량에 의해 섬유 증 관련 세포 외 매트릭스 구성 요소 콜라겐 타입 1과 fibronectin 유전자의 3D-LTC 펀치에 상당한 유도 칵테일 profibrotic (그림 4D) 치료 시 관찰 되었다. 또한, 엽 마커 vimentin 단백질 수준의 3D LTC 펀치 (그림 4E)의 치료 후 3/4의 환자에서 upregulated는 발견 됐다.
그림 1: 웹 세대의 워크플로. 폐 절제술의 종양 자유로운 지역 그들의 조직의 무결성 인해 철저 하 게 검열 된다. 조직 추가 사용 하기 위해 적합 한 득점 하는 경우 (득점은 자세히 설명 자료 및 방법 섹션에서), 그것은 다음 액체 agarose 채워집니다. 조직 블록 응고 agarose 가득 이후에 vibratome와 썬은. 세포 배양에 빠져들, 3D-LTC 교양 120 h까지 그들의 세대 후. 3D-Ltc의 다운스트림 분석 면역 형광 검사는 조직의 고정 후 얼룩 뿐만 아니라 단백질 또는 RNA 식, 라이브 조직 형광 이미징, 포함 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 낮은 녹는 포인트 agarose 폐 조직 작성. 폐 조직 기관지 폐 동맥 (그림 2A)에 인접 한에 삽입 되는 주변 정 맥 카 테 터와 cannulated입니다. 족집게는 기관지에는 정을 해결 하 고 액체 agarose의 누수를 방지 하려면 폐 동맥 클램프 하는 데 사용 됩니다. 42 ° C에 액체 agarose 30 mL 주사기 (그림 2B)와 폐 조직으로 부 어 있다. 작성 하는 동안은 정의 원심 위치 있지만 인접 위치는 더 큰 조직 볼륨 (그림 2D) 작성 채워진된 조직 (그림 2C)의 작은 영역에서 발생 합니다. 기도의 이물질 양을 줄일 것 이다 조직의 수 있는 볼륨 (그림 2E) 가득. Agarose 누수 경우 원심 정 위치 및/또는 누설의 죄 가능 폐 조직 (그림 2 층의 적절 한 agarose 작성-2 H). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 정밀 컷 폐 조각화. 성공적으로 agarose 가득 폐 조직 삭제할 조직 블록의 조각을 하는 데 사용 됩니다 (1 cm x 1.5 cm x 1 cm) 메스 (그림 3A)와 함께. 다음 삭제 조직 블록은에 붙습니다 조직 홀더, 눈금 막대 1 cm (그림 3B). 가급적, 조직 그것의 흉 막 표면 조직 홀더 그림 3C와 같이의 표면에 붙어은. 500 µ m 두께 슬라이스는 vibratome에 의해 조직 (그림 3D 와 3E) 기준으로 10 ° ~ 15 ° 각도에서 사파이어 칼으로 절단 됩니다. 2-3 cm3 큰 그대로 폐 조각, 규모에에서 절단 절차 결과 바 = 5 mm (그림 3 층). 또한, 생 주먹을 사용 하 여 직경 4mm의 작은 재현할 수 펀치 생성할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 문화의 48 h 후 인간의 3D-Ltc의 실험적인 판독. 4 mm 직경의 인간의 3D-LTC 펀치는 (빨간색)으로 fibronectin와 DAPI (파란색)에서 immunostained (그림 4A지역의). 스케일 바 = 1000 µ m. 그림 4C 쇼 병합 된 이미지. 양적 RT-PCR에 의해 웹의 RNA 분석 profibrotic 칵테일25FN1과 COL1A1 유전자 발현의 상당한 증가 보여줍니다. 그림 4E 거리 칵테일25로 치료 했다 웹의 전체 단백질 lysates의 immunoblot 표시 됩니다. Profibrotic 치료 환자 샘플 1, 3, 및 4에서에서 요인 후 엽 마커 (vimentin)의 증가 단백질 식 시연 Vimentin 및 β-걸에 대 한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 기준 | 포인트 |
| 조직 샘플 그대로 흉 막 표면이 있다. | 20 |
| 조직 샘플 거시적 그대로, 절 개, 부 수, 파열과 왜곡을 부족 한 것으로 보인다. | 20 |
| 직경을 가진 하나 이상의 기관지를 포함 하는 조직 샘플 > 1 m m. | 20 |
| 조직 샘플 포함 아니오 또는 약간 금액 혈액의. | 4 |
| 조직 샘플 매체에 완벽 하 게 저장 하 고 atelectasis의 명백한 흔적을 보여줍니다. | 4 |
| 조직 샘플은 지난 4 시간 내에 절제 했다. | 4 |
| 조직 샘플의 최대 직경에서 5cm 보다 큽니다. | 4 |
| 요컨대에서 점수: |
표 1: 점수를 채우는 폐 Agarose. 폐 Agarose 작성 점수 (LAFS) agarose의 후속 vibratome 기반 웹 생산에 대 한과 조직 절제에 맞게 성공 속도와 상관 한다. 점수는 조직에 의해 충족 기준의 모든 포인트를 요약 한. LAFS 동등 하거나 72 위의 속성을 작성 하는 좋은 agarose 예측, 60 아래 점수 예측 조직의 agarose 작성의 매우 가능성이 실패.
Discussion
이 원고에 설명 된 프로토콜 액체 agarose 및 후속 vibratome 슬라이스 작성 하 여 인간의 폐 조직 resectates에서 웹의 세대를 다루고 있습니다. 조직 조각의 세대 전에 뇌, 간 등 장기의 몇 이러한 장기의 고유 강성 조직의 수정 없이 슬라이스 직접 첨부 시연 했다. 메모의 폐 조직의 초기 적절 한 준비는 생성 하는 웹에서 가장 중요 한 단계 이다. 폐의 Agarose 작성은 부드럽고 탄력 있는 자연, 안정 하 고 균일 하 고 재현성 웹 생성 되도록 선택 방법입니다. 절제 폐 조직의 큰 항공은 그대로 폐 실질에 뿐만 아니라 작은 항공에 대 한 액세스를 제공 하기 위해 cannulated. 거의 불가능 하 게 작성 하는 agarose는 그대로 늑 막의 부족은 폐 조직 폐 부 러 뜨 리는 사용할 수 없는 대부분 이유는 주요 이유 이다. Prospectively, 원래 decellularized 건설 기계에 기능 실험을 수행 하도록 설계 된 합성 늑 그대로 늑31부족 explants의 성공적인 agarose 충전을 달성 하기 위해 적용할 수 잠재적으로. 그대로 늑 막으로 인간의 폐 조직에에서 발생 하는 절제 조직 블록 슬라이스를 생성 하기 위한 필수적입니다. 절제 조직 완전히 그대로 돌출부 또는 전체 폐 explants 폐 이식 수술 환자 보다 암 절제술에서 조직 종양 무료 인 더 제공 됩니다.
일반적으로, 두 시스템은 웹을 생산 하기 위해 사용 됩니다: Krumdieck 조직 슬라이서15 및 진동 microtomes (vibratomes). 조직 슬라이서가이 배 끝에 90 °에는 웹을 인하 하는 금속 그릇을 통해 조직 블록을 전달 하 여 분할 영역을 생성 합니다. Vibratomes는 진동 이동 하 여 웹 생성 Krumdieck 기계에 비해 냉각된 매체 욕조에 잠긴 조직 고정된 블록 위에 가로로 칼 적은 전단 힘 조직에 미치는. 재배 하기 전에 조직의 덜 가혹한 치료 결과. 다른 한편으로, vibratome 절단은 더 많은 시간을 소모 하는 작업입니다. 우리의 손에서 vibratome 100 웹 또는 500 웹 최대의 생산을 활성화 슬라이스 한 날, 가장 실험 연구에 대 한 충분 한 펀치. 웹 다양 한 방법으로 경작 될 수 있다: (a) (b)으로 동적 기관 문화 (DOC), (알리) 시스템, 트랜스-웰 스, 따라서 생성 하는 공기 액체 인터페이스에 연결 된 또는 (c) 표준 세포 배양 조건에서 세포 배양 매체에 빠져들. 웹의-세부 재배는 앞에서 설명한22,,2325; 그러나, 전 세계 다양 한 실험실에서 그들의 사용 사이 재배 조건의 일반적인 표준이 아직 없습니다. 특히, 문화 시간 중요 한 수 있습니다: murine 웹에서 SFTPC 긍정적인 치경 유형 2 셀의 손실을 관찰 후 144 h, 하지만 120 h22후. 또한, 신진 대사 활동 murine22 와 인간의 웹25 120 h에서 안정적으로 유지 것으로 보인다.
웹의 세대에 대 한 기술적 제한의 몇 가지 있다: 수와 크기는 resectates의 변동 동안; 얻은 조직 내에서 그대로 늑 막의 존재에 달려 있는, agarose의 효율성 결정 웹 세대;의 마지막 성공 그리고 획득된 (병) 폐 조직 내의 병 적인 변화에 의해 발생 하는 조직 파괴 웹 준비를 방해할 수 있습니다. 기도 장애물 및 거리 조직 그대로 치조 공간 부족 agarose 작성을 방해 고 따라서 까다로운 작업 거리 조직의 슬라이스. Emphysematous 조직으로 발견 질병에와 같은 COPD 또는 알파 1-안티 트립 신 결핍증, agarose의 압력을 저항 하지 수 건축 유물 및 폐 포의 파열 귀 착될 것 이다. 이러한 경우에, 낮은 agarose 농도, 예를 들어, 1% (w/v)의 사용 압력 감소 agarose 작성 하는 동안 속도를 유용할 수 있습니다. 전반적으로, 조직의 질병 상태 극적으로 웹 세대에 대 한 직물의 사용을 제한할 수 있습니다. 이러한 모든 매개이 변수는 폐 조직에서 생성 될 수 있는 웹의 금액을 결정 하 고는 웹 생산 소요 시간 또한. 또한 웹의 한계 실험에 대 한 정규화 단계를 더 요구 한다 크기 또는 조직 내용에 관하여 다른 폐 조각 사이 불일치가 있습니다. 이 극복 하기 위해 동일한 슬라이스의 비슷한 지역의 생 검 펀치를 생성할 수 있습니다. 이 절차는 조직 변화를 감소 하 고, 추가 혜택으로 실험에 사용할 수 있는 웹 샘플의 수를 증가 하는 경향이.
결론적으로, 인간의 3 차원 폐 조직 문화 agarose에서 가득 웹 폐 생리학을 연구 하 고 질병에 대 한 복잡 한 인간의 모델 제공. 프로토콜 절제 폐 조직 및 그들의 경작에서 웹의 준비에 대 한 자세한 설명을 제공 하 고 또한 인간의 폐 절제술 및 그들을 극복 하는 방법의 agarose 작성에 문제를 해결.
Disclosures
모든 저자는 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 전문가 기술 지원을 위한 마리사 노이만에 감사. 모든 폐 조직 했다 친절 하 게 CPC M 바이오-아카이브에 의해 제공. 이 작품은 폐 연구 (DZL), 헬름홀츠 협회와 CPC 연구 학교 보조금의 독일 센터에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | - | |
| Hyrax CU 65 | Zeiss | - | |
| Vasofix Braunüle 18 G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
| 30 mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
| Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
| Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
| Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | - | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
| Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
| Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |
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