Здесь мы представляем собой протокол для подготовки заполнены агарозы легкое человека точности надреза кусочки от резекции тканей пациента которые подходят для создания 3D легких тканевых культур для модели человека легочных заболеваний в биологических и биомедицинских исследований.
Перевод романа открытий для болезней человека ограничено наличием человека модели, основанные на ткани, заболевания. Точность cut легких ломтиками (PCLS) используется как 3D легких культур тканей (3D-LTCs) представляют собой элегантное и биологически высокоактуально 3D ячеечная модель культуры, весьма напоминающие на месте ткани из-за их сложности, биомеханика и молекулярной композиция. Нарезка ткани широко применяется в различных моделях животных. 3D-LTCs производным от человека PCLS может использоваться для анализа ответов на роман наркотиков, которые далее могут помочь лучше понять механизмы и функциональных последствий употребления наркотиков в тканях человека. Подготовка PCLS от образцов ткани хирургической резекции легких пациентов, которые испытали Лобэктомия легких, повышает доступность больными и перитуморальной ткани. Здесь мы описываем подробный протокол для поколения человека PCLS от хирургической резекции мягкий эластичный больного легочной ткани. Агарозы была введена в бронхоальвеолярной пространство resectates, таким образом сохраняя структуру легких и увеличение жесткости ткани, которая имеет решающее значение для последующей нарезки. из блока ткани с vibratome были подготовлены 500 мкм толщиной ломтиками. Биопсия пуансонов, взяты из PCLS обеспечить сопоставимые ткани, размер выборки и дальнейшее увеличение количества образцов ткани. Сгенерированный легких культур тканей может применяться в различных исследований в биологии человека легких, включая патофизиологии и механизмов различных заболеваний, таких как фиброзных процессов на ее лучших на (суб-) клеточном уровнях. Наибольшую выгоду 3D-LTC ex vivo модели является ее закрыть представительство на местах человеческих легких архитектуры 3D ткани, клетки типа разнообразия и Анатомия легких, а также потенциал для оценки ткани от отдельных пациентов, которые имеет отношение к дальнейшей разработки новых стратегий для точности медицины.
Хронические и острые легочные заболевания являются одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире1. Для пациентов с хроническими заболеваниями легких как обструктивная болезнь легких (ХОБЛ)2, тяжелой формой астмы3, рак легких4 и Паренхиматозный легких диффузных заболеваний5лечебной терапии в настоящее время не доступны. Хотя исследования на животных моделях для легочных заболеваний углубили понимание болезни Патомеханизмы6 и привели к выявлению потенциальных роман терапевтических целей7,8,9, Эти модели демонстрируют соответствующие биологические и физиологические различия по сравнению с10людьми. Чтобы преодолеть эти расхождения между мышиных и человеческой биологии, а также анатомии человека ex vivo 3D легких тканевой культуры (3D-LTC) системы используются в различных областях биомедицинских исследований. Эти 3D-LTC культуры системы основаны на легких точности cut ломтики (PCLS). Поколение PCLS ex vivo позволяет анализа третьего пространственных размерности, которая позволяет для расследования пространственная и функциональная отношений клеток в весь альвеолы и airways11, а также интерстиция, сосудистую и мезотелия. В частности PCLS ex vivo модели многоклеточных, означает, что они содержат большинство функциональных клеток на месте легких, таким образом, тесно, представляющие клетки родной биологической среды и таким образом, преодоление ограниченных ячеек и ячеек матрицы взаимодействия в большинстве 2D клеточные культуры подходов. До теперь, ex vivo мышиных PCLS были использованы для моделирования легочных заболеваний, как ХОБЛ12, фиброз легких13, рак легких14, вирусные инфекции15,16, бронхолегочной дисплазии17, и астма18. Однако, значительная часть романа лекарственной терапии в человека легочных заболеваний, которые были расследованы в клинических испытаниях не переводят в клинику из-за их отсутствия эффективность или безопасность, повидимому из-за еще значительные различия между человеком и мышиных биологии и болезни19,,2021.
В течение нескольких лет человеческого PCLS основном были использованы для оценки легких токсичность химических веществ и наркотиков. Лишь недавно человека легочной ткани был использован от пациентов с ХОБЛ22,23, астма24и фиброза легких25, чтобы преследовать патофизиологические и фармакологические исследования. С помощью материала резецированный больного органа и генерации PCLS, один можно резюмировать основные болезни клейма в сложных 3D ткани среды22 представляющих и поддержание большинство родной сотовой разнообразия органа. Кроме того больные ткани, применяемых в различных экспериментальных установок было показано для имитации болезни как изменения в печени, кишечника и почек26,27,,2829.
Однако обработка легочной ткани остается сложным по нескольким причинам. В отличие от твердых тканей паренхимы легких родной стремится свернуть без вентиляции и экспонаты ниже жесткость ткани. Эти свойства препятствуют нарезки ткани. Таким образом заполнение airways и альвеолярного пространства с легкоплавких точки агарозы сохраняет структуру собственных легких и обеспечивает жесткость, необходимые для точности надреза нарезки из мышиных и человеческих легких30. Resectates легкое человека, пожертвовал для исследовательских целей являются по своей природе анатомически, генетически и физиологически весьма разнообразны, представляя таким образом часто высокая изменчивость между пациента при выполнении экспериментов25. В отличие от всей доли или всей легких эксплантов, легких образцы резецируется посредством торакальной хирургии не обязательно следовать анатомические сегментов и, таким образом, требуют специальной подготовки. В этой статье мы предоставляем подробную и оптимизированный протокол для поколения человека PCLS от резекции легочной ткани и их последующего выращивания и экспериментального использования в модели легочных заболеваний.
Протокол, описанный в этой рукописи охватывает поколения PCLS из resectates ткани легких человека, заполнив его с жидким агарозы и последующего vibratome нарезка. Поколение кусочков ткани был продемонстрирован перед несколько органов, как печень и мозг, тогда как присущие жесткость этих органов допускается прямое нарезка без каких-либо изменений ткани. Следует отметить первоначальный надлежащей подготовки легочной ткани является наиболее важным шагом в создании PCLS. Агарозы наполнение легких является методом выбора для стабилизации ее мягкой и эластичной характер и для обеспечения однородной и воспроизводимые PCLS поколения. Большие airways резецированный легочной ткани являются канюлированной предоставлять доступ мелких дыхательных путей, а также паренхимы легких нетронутыми. Отсутствие нетронутыми плевры, что делает практически невозможным агарозы наполнения, является одной из основных причин, почему легочной ткани главным образом не пригоден для нарезки легких. Проспективно синтетические плевры, первоначально предназначенные для выполнения функциональных эксперименты на decellularized леса потенциально могут применяться для достижения успешного агарозы заполнения эксплантов, которым недостает нетронутыми плевры31. Резекция приводит в кусок ткани легкое человека с нетронутыми плевры имеют важное значение для создания блоков ткани для нарезки. Резекции тканей из-за свободных опухолевых тканей от резекции рака более доступными, чем полностью нетронутыми лопастями или эксплантов целом легких пациентов, перенесших трансплантации легких.
Обычно, для производства PCLS используются две системы: Krumdieck ткани среза15 и вибрационный Микротомы (vibratomes). Срезы тканей генерировать фрагменты, передав блока ткани через металлический сосуд, который режет PCLS на 90° в конце этого судна. Vibratomes генерировать PCLS, перемещая вибрирующих нож горизонтально над якорь блока ткани, который погружен в ванне охлаждения среднего, который по сравнению с Тесак Krumdieck оказывает меньше силы сдвига на ткани. Это приводит к менее жестокого обращения ткани до выращивания. С другой стороны vibratome резки это больше времени и много работы. В наших руках vibratome, нарезка включено производство максимум 100 PCLS или 500 PCLS ударов в один день, достаточно для самых экспериментальных исследований. PCLS может быть культивировали различными способами: (а) придает транс Уэллс, создавая таким образом воздух жидкий интерфейс системы (Али), (b) как динамический органной культуры (DOC), или (c) погруженной в среде культуры клеток в условиях культуры стандартной ячейки. Культивирование в деталях PCLS был ранее описанных22,,2325; Однако до сих пор отсутствует общий стандарт условий выращивания между их использования в различных лабораториях во всем мире. В частности, время культуры может быть критическим: как в мышиных PCLS, потеря SFTPC позитивные альвеолярного 2 типа клеток наблюдается после 144 ч, но не после 120 h22. Кроме того метаболической активности, как представляется, остаются стабильными в мышиных22 и человека PCLS25 для 120 h.
Существует несколько технических ограничений для генерации PCLS: количество и размер resectates меняется с течением времени; эффективность агарозы заполнения, который зависит от наличия нетронутыми плевры в пределах полученных ткани, определяет конечный успех PCLS поколения; и разрушение тканей, вызванных патологических изменений в рамках полученных (больной) легочной ткани могут помешать подготовке PCLS. Дыхательные пути препятствия и фиброзных тканей, не хватает нетронутыми альвеолярного пространства препятствуют с агарозы наполнения и таким образом сделать Фрагментирование фиброзных тканей сложной задачей. Emphysematous тканей как по направлению заболеваний таких как ХОБЛ или дефицита альфа-1-анти трипсин может не выдержать давление наполнения агарозы и приведет к разрыву альвеолы и архитектурных памятников. В этих случаях использование агарозы низкой концентрации, например, 1% (w/v), может быть полезным для снижения давления и скорости во время наполнения агарозы. В целом болезненное состояние тканей может резко ограничить использование ткани для PCLS поколения. Все эти параметры определяют количество PCLS, которые могут быть сгенерированы из легочной ткани, а также количество времени, необходимое для производства PCLS. Дальнейшие ограничения PCLS являются несоответствия между различными легких ломтики в отношении размера или ткань содержание, которое требует дальнейшего шаги нормализации для экспериментов. Чтобы преодолеть это, могут создаваться биопсии пробойники подобных регионов же фрагмента. Эта процедура уместна снизить изменчивость ткани и, как дополнительное преимущество, увеличить количество PCLS проб, которые могут быть использованы для экспериментов.
В заключение, культур тканей человека 3D легких от агарозы заполнены PCLS представляют собой комплекс человека модель для изучения физиологии легких и болезни. Протокол содержит подробное описание подготовки PCLS от резекции легочной ткани и их выращивания и Кроме того рассматриваются проблемы заполнения агарозы резекций легких человека и как их преодолеть.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарны Marisa Неймана для экспертной технической помощи. Все легочной ткани были любезно представил на КПК-М био-Архив. Эта работа была поддержана Немецкий центр исследования легких (DZL), Гельмгольца и КПК Исследовательская школа грантов.
Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | – | |
Hyrax CU 65 | Zeiss | – | |
Vasofix Braunüle 18G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
30mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | – | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |