Summary
Här presenterar vi ett protokoll för beredning av agaros-fyllda mänsklig precision-cut lung skivor från opererande patientens vävnad som är lämpliga för att generera 3D lung vävnadskulturer till modell mänskliga lungsjukdomar i biologisk och biomedicinsk studier.
Abstract
Översättningen av romanen upptäckter till mänskliga sjukdomar är begränsat av tillgången på mänskliga vävnad-baserade modeller av sjukdom. Precision-cut lung skivor (avgiften) används eftersom 3D lung vävnadskulturer (3D-LTCs) utgör en elegant och biologiskt mycket relevanta 3D cell kultur modell, som mycket likna jordbaserad vävnad på grund av sin komplexitet, biomekanik och molekylär sammansättning. Vävnaden skivning används allmänt i olika djurmodeller. 3D-LTCs härrör från mänskliga avgiften kan användas för att analysera Svaren till nya läkemedel, vilket ytterligare kan bidra till att bättre förstå mekanismerna och funktionella effekter av droger i mänsklig vävnad. Beredning av avgiften från kirurgiskt avlägsnande lung vävnadsprover på patienter, som upplevt lung lobektomi, ökar tillgängligheten till sjuka och peritumoral vävnad. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för generering av mänskliga avgiften från kirurgiskt avlägsnande soft-elastisk patienten lungvävnad. Agaros infördes i bronkoalveolär utrymmet av resectates, således bevara lung struktur och öka vävnads stelhet, vilket är avgörande för efterföljande skivning. 500 µm tjocka skivor var beredda från vävnad blocket med en vibratome. Biopsi slag tas från avgiften säkerställa jämförbara vävnad urvalsstorlekar och ytterligare öka mängden av vävnadsprover. De genererade lung vävnadskulturer kan användas i en mängd studier i mänsklig lung biologi, inklusive patofysiologi och mekanismer av olika sjukdomar, såsom fibrotiska processer på dess bäst på (sub-) cellulära nivåer. Den högsta nyttan av 3D-LTC ex vivo modell är dess nära representation av jordbaserad mänskliga lungan avseende 3D vävnad arkitektur, cell typ mångfald och lung anatomi samt potentialen för bedömning av vävnad från enskilda patienter, som är relevant att ytterligare utveckla nya strategier för precision medicin.
Introduction
Kroniska och akuta lungsjukdomar är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet i hela världen1. För patienter med kroniska lungsjukdomar som obstruktiv lungsjukdom (kol)2, svår astma3, lung cancer4 och diffusa parenkymal lung sjukdomar5för läkande terapier närvarande inte tillgängliga. Även om studier i djurmodeller för lungsjukdomar har fördjupat förståelsen av sjukdomen patomekanism6 och har lett till identifiering av potentiella nya terapeutiska mål7,8,9, dessa modeller uppvisar relevanta biologiska och fysiologiska skillnader jämfört med människor10. För att övervinna dessa skillnader mellan murina och människans biologi samt anatomi, mänskliga ex vivo 3D lung vävnadsodling används (3D-LTC) system på olika områden inom biomedicinsk forskning. Dessa 3D-LTC kultur system bygger på precision-cut lung skivor (avgiften). Generering av avgiften ex vivo tillåter analys av en tredje rumsliga dimensionerna, som gör det möjligt för utredning av de rumsliga och funktionella relationerna av celler i hela alveolerna och airways11, samt interstitium, kärlsystemet och mesothelium. Noterbart är är avgiften ex vivo modeller flercelliga, vilket innebär att de innehåller mest funktionella celler av jordbaserad lungor, således nära svarar cellernas biologiska miljön och därmed övervinna den begränsade cell-cell och cell-matrix växelverkan i de flesta 2D cellkultur strategier. Fram till nu, ex vivo murina avgiften användes för att modellera lungsjukdomar, som kol12, lung fibros13, lung cancer14, virusinfektion15,16, bronkopulmonell dysplasi17, och astma18. Dock en avsevärd del av romanen läkemedelsbehandlingar i mänskliga lungsjukdomar som undersöktes i kliniska prövningar översätter inte till kliniken på grund av deras bristande effekt eller säkerhet, assumingly på grund men ändå betydande skillnader mellan människa och murina biologi och sjukdomar19,20,21.
Under flera år, har mänskliga avgiften i stor utsträckning använts för att bedöma lungtoxicitet av kemikalier och läkemedel. Mänsklig lungvävnad har nyligen använts från patienter med kol22,23, astma24och lung fibros25, att bedriva patofysiologiska och farmakologiska studier. Genom att använda opererande patienten organmaterial och generera avgiften därav, man kan sammanfatta stora sjukdom kännetecken i en komplex 3D vävnad miljö22 som representerar och underhålla de flesta av de infödda cellulära mångfalden av orgeln. Dessutom visades sjuk vävnad tillämpas i en mängd olika försöksuppställningar att efterlikna sjukdomen-liknande förändringar i lever, tarm och njurar26,27,28,29.
Bearbetning av lungvävnad förblir emellertid utmanande av flera skäl. Till skillnad från solid vävnad, infödda lungparenkym tenderar att kollapsa utan ventilation och uppvisar lägre vävnad stelhet. Dessa egenskaper hindra skivning av vävnad. Således, fyllning av luftvägarna och alveolära utrymmet med låg-smältande punkt agaros bevarar strukturen infödda lung och ger den stelhet som behövs för precision-cut skivning av murina och mänskliga lungor30. Människans lung resectates donerade för forskningsändamål är till sin natur anatomiskt och genetiskt fysiologiskt mycket mångskiftande, därigenom ofta medför en hög mellan patienter variabilitet när du utför experiment25. I motsats till den hela loben eller hela lungan bladsticklingar, lung prover resected med hjälp av thoraxkirurgi inte nödvändigtvis följa de anatomiska segment och kräver därför speciell beredning. I den här artikeln ger vi en detaljerad och optimerade protokoll för generering av mänskliga avgiften från opererande lungvävnad och deras efterföljande odling och experimentell användning till modell lungsjukdom.
Protocol
Användning av mänsklig vävnad godkändes av den etiska kommittén vid Ludwig-Maximillian universitetet [München, Tyskland (projektnummer 455-12)]. Tumör-fri mänsklig lunga resektioner tillhandahölls av Asklepios biobanken för lungsjukdomar (Gauting, Tyskland, projektnummer 333-10).
Obs: Alla förfaranden av mänskliga avgiften produktion (figur 1) görs under en steril LAF.
1. beredning av instrument och material
-
Förbered allt material för inflationen av lungvävnaden med agaros som beskrivs nedan.
- Förbereda odling medium: Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) F-12 kompletteras med L-glutamin, HEPES, 10.000 IE Penicillin, 10.000 IE Streptomycin och 0,1% (v/v) fetalt bovint serum.
Obs: Medium används vid 37 ° C. - Förbereda en steril metall bricka täckt med mjukpapper. Placera en steril 15 cm cell kultur maträtt på facket.
- Fyll cell kultur skålen med 15 mL av odling medium.
- Förbered en 3% (w/v) agaros lösning genom att lösa upp lämplig mängd låg-smältande punkt agaros i ett minimum av 30 mL odling medium.
- Värm lösningen i en mikrovågsugn till kokpunkten. Cool agaros lösningen på 42 ° C i ett vattenbad. Hålla flytande agaros lösningen lagras i vattenbadet.
- Förbereda flera 50 mL koniska rör fyllda med flytande Agarens.
- Förbereda odling medium: Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) F-12 kompletteras med L-glutamin, HEPES, 10.000 IE Penicillin, 10.000 IE Streptomycin och 0,1% (v/v) fetalt bovint serum.
2. opererande lungvävnad
- Store färsk tumör gratis lungvävnad av lobektomi resectates omedelbart efter resektion i DMEM F-12 medelstora vid 4 ° C fram till steg 3.
- Överskrid inte kall ischemitid på 4-8 h före bearbetning.
3. kontroll och urval av opererande vävnad innan agarosen fyllning
- Lyft vävnaden från medlet med pincett. För att undvika skador på vävnad, särskilt till lungsäcken, hantera vävnaden med pincett på luftvägarna endast.
- Poäng vävnad kvaliteten av kriterier av Lung agaros fyller poängen definieras i tabell 1.
- Fortsätt till steg 4 om vävnadens kvalitet görs över eller lika med 72. Om vävnadens kvalitet görs under 60, inte fortsätta ytterligare med agaros som fyllning.
Obs: Om vävnad Poäng är mellan 60 och 68, agaros-fyllning och vävnad skivning fortfarande kan ge rimliga resultat och ett slutligt beslut om förlängning av experimentet måste göras fall till fall. Lungvävnaden som inte uppfyller de ovannämnda kraven, misslyckas dock mestadels i agaros som fyllning.
4. lunga vävnad inflationen av agaros fyllning
- Lyft vävnaden från lagringsmediet och dränera överskottet media från vävnaden. Överföra lungvävnad till 15 cm kultur skålen beredd i 1.1.2.
- Fyll en 30 mL spruta med låg-smältande punkt Agarens från 1.1.3.
- Förbereda en perifer venkateter genom att ta bort obturatorn och koppla den till en 30 mL spruta
- Identifiera ett luftrör (0,5-3 mm i diameter) i vävnad som ventilerande en intakt del av vävnaden (se figur 2).
- Sätt in kanylen i den valda luftrör (0,5-3 mm i diameter).
- Skjut försiktigt in kanylen försiktigt framåt så långt som möjligt.
- Täta luftrör runt kanylen genom att komprimera bronkial väggen runt kanylen med pincett, idealiskt fastspänning någon angränsande lungartären samtidigt.
- Absorbera andra ytterligare luftvägarna med en kirurgisk klämma att förhindra agaros läcka igenom dessa airways.
- Lyfta vävnaden med hjälp av tången från kultur skålen.
- Manuellt Häll Agarens med sprutan inte snabbare än 0,3 mL/s. Hastigheten på agaros fyllning kan variera mellan cirka 0,05 och 0,3 mL/s på grund av heterogena motståndet i luftvägarna och/eller atelektas.
-
Om hög motståndskraft medan fyllningen eller agaros som läcker från vävnad observeras, försök igen hela förfarandet med en annan luftrör från steg 4,4. Utför felsökning som beskrivs nedan.
Obs: Graden av agaros fyllning är starkt beroende av placera av katetern i vävnaden och djup penetration av katetern resultaten i agaros fyllning av små kon som regioner (*) av lungvävnad (figur 2 c).- Vid högt motstånd, prova positionering av katetern leder till korrekt fyllning av de flesta regioner i vävnaden (#) (figur 2D).
- Som pluggar av tidig stelnat agaros i proximala luftrören eller andra luftvägarna hinder (pil) kan leda till en ofullständig fyllning av vävnad (figur 2E), tvinga inte agaros fylla eftersom detta kan leda till brister i området fyllda, men inte i en fyllning av de blockerade vävnad delarna.
- Om respiratorisk trädet härrör från den kanylerade luftrör är skadad under resektion och Agarens fylla resulterar i en konstant läckande flytande Agarens (pilen i figur 2F), infoga katetern i en mer perifer del av luftvägarna systemet till Fyll minst en mindre del av vävnaden (*) (figur 2 g). Dessutom täta skadade perifera luftvägarna med en kirurgisk klämma (pil) (figur 2 H).
- Tillämpa agaros tills lungorna fylls helt. Inte alltför blåsa upp vävnaden eftersom detta kan orsaka irreversibla skador på vävnad struktur och dess celler.
- Klämma de luftrör som användes för fyllning omedelbart. Ta bort kanylen innan fastspänning.
- Inkubera vävnaden i odlingsmediet vid 4 ° C i 30 min att säkerställa agaros stelning.
- Om opererande vävnaden har flera bronkial poster, upprepa steg 4,2 till 4.13 tills alla delar av vävnad är fyllda med agarosgelelektrofores.
- Store Agarens fylld lunga vävnadssnitt i 4 ° C kallt medium tills skivning.
5. precision-cut Lung skivning
-
Identifiera regioner i lungvävnaden som stabilt är fyllda med Agarens. Stabilt fyllda regioner kommer inte att kollapsa när de trycks försiktigt med pincett mot botten av cellen kultur skålen.
- Punktskatter 1-1,5 cm3 block av regioner beskrivs i 5.1, ena sidan fortfarande bör omfattas med lungsäcken.
- Fäst varje enskilda vävnad block med pleural sida att kontakta innehavaren av vibratome med hjälp av ett cyanoakrylat lim.
Obs: Lungsäcken är något elastiska och därför hindrar skärning med vibratome blad. Placeras på vävnad innehavaren, lungsäcken inte kommer att störa styckning och, ännu viktigare, bildar en naturlig barriär mellan cyanoakrylat lim och vävnadens parenkymet möjliggör minimal diffusion av limmet. - Skiva lungvävnaden med vibratome med följande inställningar: tjocklek: 500 µm, frekvens: 100 Hz, amplitud av kniv: 1,2 mm, hastighet framåt av bladet av 3-12 µm/s, vilket beror på vävnad stelhet. Minska utstick-hastigheten på bladet om skiva inte skärs korrekt, eller om vävnaden blocket själv börjar att vibrera.
- Försiktigt överför segmentet genom att lyfta den med pincett från vibratome fack i en bra 12-well platta fylld med odling medium. Slutligen, inkubera lung skivor i en inkubator på standard cell kultur villkor.
- Stoppa skivning när 2-3 mm av vävnad blocket lämnas osegmenterad eftersom cyanoakrylat lim kan ha nedsatt vävnad integriteten i denna region.
6. generering av avgiften slag
- Överföra lung skivor från en enda brunn till en tom 10 cm skålen.
- Placera en 4 mm biopsi hålslag vinkelrätt till den övre ytan av en avgiften och börja röra hålslag i medurs och moturs rotationer.
- Fyll cellodlingsmedium i brunnar av en plattan med 96 brunnar. Lyft de vävnad stämplingar med pincett och överföra stämplingar i brunnar av en plattan med 96 brunnar. Slutligen, inkubera i lungan stämplingar nedsänkt i det medium som förberett i 1.1.1. i en cell kultur inkubator under standart villkorar (21% (v/v) syre, 5% (v/v) koldioxid och 95% luftfuktighet, vid 37 ° C).
7. vävnadsodling och prov skörd
- Kultur avgiften och slag över natten i en inkubator på standard cell kultur villkor.
- Kultur avgiften och slag anges villkor för upp till 120 timmar efter deras generation att säkerställa cellulära hållbarhet och funktion.
- För skörd protein samt RNA, tvätta avgiften och slag tre gånger i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), överföra dem till cryovials och snapin-frysa i flytande kväve.
-
Prov medium supernatanten av odlade avgiften stansar för analys av utsöndrade proteiner.
- För histologiska analyser, tvätta avgiften och slag tre gånger med PBS och åtgärda dem med 4% PARAFORMALDEHYD genom inkubation under 30 minuter vid 37 ° C. Slutligen, lagra avgiften i PBS vid 4 ° C för ytterligare nedströms färgning.
Representative Results
AVGIFTEN generation
Generering av avgiften kan delas in i fyra grundläggande steg: kirurgiska lunga vävnad resektion, agaros fyllning, vibratome-baserade avgiften generation och kultur av avgiften. Opererande lungorna fylls med låg-smältande punkt agaros, som tillför nödvändiga styvheten till lungvävnad för skivning och bevarar den infödda lung struktur och arkitektur. Notera, avgiften generation är mycket tidskrävande, därför ofta övernattning lagring av fyllda lungorna i DMEM F-12 medium kan ingå som ett ytterligare steg och avgiften generation startas nästa dag. Beroende på inställningarna för följande experimentella, kan genererade avgiften inkuberas över natten i standard cellodlingsmedium som innehåller 0,1% (w/v) fetalt bovint serum, innan experimentella villkor tillämpas. 3D-LTCs var livskraftig och uppvisade cellulära funktioner (såsom tensid protein sekretion) för upp till 120 h22 i kultur förhållanden som beskrivs i detta protokoll (figur 1) och kan optimeras vid ytterligare förbättring av dessa.
Agaros fyllning
För agaros fyllning av vävnad infogades en kanyl av en perifer venkateter med en 1.3 mm diameter bifogas agaros-fyllda sprutan i ett luftrör på ytan av skära vävnaden (figur 2A). Bronkerna är ofta lokaliserade nära en lungartären. Medan artärerna har tunnare väggar och tenderar att kollapsa, uppvisade bronkerna en bra synlig lumen. Beroende på vävnadens integritet, kan katetern vara avancerad genom flera generationer av respiratoriska trädet i peripheryen av lungan. Den trängda igenom luftrör var förseglad runt kanylen med hjälp av pincett (figur 2B). Lungartären kan spännas med pincetten samtidigt. Efteråt, vävnaden lyfts upp och flytande agaros är försiktigt ingjutit i luftvägarna.
Beroende på positionen av katetern, kan en majoritet av vävnad fyllas med flytande agaros (figur 2D). Alternativt kan kon liksom delar av lungorna, vilket återspeglar den lungparenkym som ventileras med den trängda igenom luftrör, bli fylld med Agarens (figur 2 c). I båda fallen ett karakteristiska mönster av stabilt fyllda vävnad regioner kan observeras: först en stor del av vävnaden fylls i kilar (figur 2D) eller andra mindre utskjutande runda områden noggrant fyllda vävnad visas områden ( Figur 2 c). Om delar av luftvägarna blockera på grund av agaros blodproppar eller andra orsaker, kan delar av vävnaden inte fyllas ordentligt med agarosgelelektrofores. Således kan endast delar av vävnad vara tillämpliga för skivning. Vid läckage under Agarens fylla förfarande, delar av trädet fyllda luftvägarna kan få perforerade och fyllning av lungvävnaden blir nästan omöjligt men, möjliga lösningar inkluderar fyllning via en mer perifer luftrör, en djupare penetration av kanylen i de distala luftvägarna (figur 2 g) eller potentiella fastspänning av läckageområdet (figur 2 H).
Precision-cut lung skivning
Vävnaden block på en längd och bredd på 1-1,5 cm var censurerade från vävnad regioner, som var helt fylld med stelnad agaros ()figur 3A-3B). Nästa, de enskilda vävnad block limmades vävnad innehavaren av vibratome (figur 3 c). 500 µm tjock avgiften genererades, medan vävnad blocket på vibratome avancera framåt med hastigheter mellan 3-12 µm/s. (figur 3D-3F). Slutligen, avgiften var nedsänkt i cellodlingsmedium som innehåller 0,1% (w/v) fetalt bovint serum och odlade på standard cell kultur villkor, som beskrivs steg 7.
Experimentell avläsning av mänskliga 3D-LTC efter 48h för odling
En representativ immunofluorescens färgning, som tidigare beskrivits av Alsafadi et al.25, visas i figur 4A-4 C. Immunolabeling av Fibronektin (röd) och cellkärnor (DAPI, blå), tillåtet för avbildning av den bevarade alveolära strukturen i den mänskliga 3D-LTC ex vivo. Behandling av människan avgiften stansar med en profibrotic cytokin cocktail (inklusive omvandla tillväxtfaktor beta 1, trombocyter härrör tillväxtfaktor AB, lipophosphatidyl syra och tumörnekrosfaktor alfa) för 48 h resulterade i fibros-liknande förändringar i mänskliga 3D-LTCs. Av qPCR observerades en betydande induktion av fibros-relevanta extracellulär matrix komponenter kollagen typ 1 och Fibronektin generna i 3D-LTC slag vid behandling med profibrotic cocktail (figur 4 d). Dessutom hittades proteinnivåer av de mesenkymala markör vimentin uppreglerad i 3 av 4 patienter efter behandling av 3D-LTC stämplingar (figur 4E).
Figur 1: arbetsflöde för avgiften generation. Tumör-fria områden av lung resektioner inspekteras noggrant på grund av deras vävnad integritet. Om vävnaden görs lämplig för vidare användning (scoring förklaras i detalj i avsnittet material och metoder), det är nästa fylld med flytande agaros. Vävnaden block fylld med stelnad agaros skivas därefter med en vibratome. Nedsänkt i cellodlingsmedium, odlas 3D-LTC upp till 120 h efter deras generation. Nedströms analyser av de 3D-LTCs involverar protein - eller RNA-uttryck, live-vävnad fluorescens imaging, samt immunofluorescens färgning efter fixering av vävnaden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: fylla lungorna med låg-smältande punkt agaros. Lungvävnaden är kanylerade med en perifer venkateter som sätts in i ett angränsande till lungpulsådern (figur 2A) luftrör. Pincett används fixar kanylen i luftrör och klämma lungartären för att undvika läckage av flytande Agarens. Flytande agaros vid 42 ° C hälls i lungvävnaden med en 30 mL spruta (figur 2B). En distala positionering av kanylen vid fyllning resulterar i små områden fyllda vävnad (figur 2 c), medan proximala positionering kommer att se till att fylla en större vävnad volym (figur 2D). Hinder i luftvägarna kommer att minska mängden vävnad som kan vara volymfylld (figur 2E). Händelse av agaros läcker, möjliggör en distala kanyl positionering eller fastspänning av läckage sida korrekt agaros fyllning av lungvävnad ()figur 2F-2 H). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Precision-cut lung skivning. Ett framgångsrikt agaros-fylld lungvävnad används för att punktskatt en bit av en vävnad block (1 x 1,5 cm x 1 cm) med en skalpell (figur 3A). Nästa exciderad vävnad blocket är limmade till vävnad innehavaren, skalstapeln anger 1 cm (figur 3B). Helst, vävnaden är limmade med dess pleural yta på ytan av vävnad innehavaren som visas i figur 3 c. 500 µm tjocka skivor skärs av vibratome med en safir kniv i 10 – 15° vinkel i förhållande till vävnaden (figur 3D och 3E). Styckning förfarandet resulterar i 2-3 cm3 stora intakt lung skivor, skala bar = 5 mm (figur 3F). Dessutom, med hjälp av en biopsi Hålslag, kan små reproducerbara slag med en diameter på 4 mm genereras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Experimental avläsning av mänskliga 3D-LTCs efter 48h kultur. En mänsklig 3D-LTC punch med 4 mm diameter var immunostained för Fibronektin (i rött) och DAPI (i blått) ()figur 4A-4C). Skala barer = 1000 µm. figur 4 c visar den sammanlagda bilden. RNA analys av avgiften med kvantitativ RT-PCR visar betydande ökningar av COL1A1 och FN1 genuttryck av profibrotic cocktail25. Figur 4E visar en immunoblot av hela protein lysates av avgiften, som behandlades med en fibrotisk cocktail25. Sondera för Vimentin och β-aktin visat ett ökat proteinuttryck av mesenkymala marker (vimentin) efter behandling med profibrotic faktorer i patientprover 1, 3 och 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Kriterium | Punkter |
| Vävnadsprov har intakt pleural yta. | 20 |
| Vävnadsprov verkar makroskopiskt intakt, saknar snitt, Squash, spricker och snedvridningar. | 20 |
| Vävnadsprov innehåller minst ett luftrör med diameter > 1mm. | 20 |
| Vävnadsprov innehåller inga eller endast lite uppgår av blod. | 4 |
| Vävnadsprov lagrades fullt i medium och visar inga uppenbara tecken på atelektas. | 4 |
| Vävnadsprov var resected inom fyra timmar. | 4 |
| Vävnadsprov är större än 5cm i största diameter. | 4 |
| Poäng i summan: |
Tabell 1: Lung agaros fylla poäng. Lung agaros fylla Poäng (LAFS) korrelerar med framgång-rate att fylla en vävnad resektion med agarosgelelektrofores för dess efterföljande vibratome-baserade avgiften produktion. Poängen summeras alla punkter av kriterier uppfylls genom vävnaden. En LAFS lika eller ovan 72 förutspår bra agaros fylla boenden, en poäng under 60 förutspår en mycket troligt fel på agaros fyllning av vävnaden.
Discussion
Protokollet beskrivs i detta manuskript täcker utvecklingen av avgiften från mänsklig lunga vävnad resectates genom att fylla den med flytande agaros och efterföljande vibratome skivning. Generation av vävnad skivor visades innan för ett par av organ, som lever och hjärna, medan inneboende styvheten i dessa organ får direkta skivning utan någon ändring av vävnad. Notera är inledande korrekt beredning av lungvävnaden det mest avgörande steget i generera avgiften. Agaros påfyllning av lungan är metoden för val att stabilisera sin mjuk och elastisk natur och att säkerställa en homogen och reproducerbara avgiften generation. Stora luftvägarna av opererande lungvävnaden är kanylerade för att ge åtkomst till de små luftvägarna samt intakt lungparenkym. Avsaknaden av en intakt lungsäcken, vilket gör agaros fylla nästan omöjligt, är en viktig orsak till varför lungvävnad mestadels inte är användbara för lung skivning. Prospektivt, skulle en syntetisk lungsäcken som ursprungligen avsedd att utföra funktionella experiment på cell-lösa ställningar potentiellt kunna tillämpas för att uppnå framgångsrika agaros fyllning av bladsticklingar som saknar ett intakt lungsäcken31. Resektioner vilket resulterar i en mänsklig lunga vävnad bit med intakt lungsäcken är nödvändiga för att generera vävnad block för skivning. Opererande vävnad är mer tillgängliga på grund av tumör-fri vävnad från cancer resektioner än helt intakt loberna eller hela-lung bladsticklingar av patienter som genomgick lungtransplantation.
Vanligen, två system används till att producera avgiften: den Krumdieck vävnad skivare15 och vibrerande mikrotomer (vibratomes). Vävnaden utsnitt generera skivor genom att passera en vävnad block genom metall fartyg, som klipper avgiften vid 90° i slutet av detta fartyg. Vibratomes generera avgiften genom att flytta en vibrerande kniv horisontellt över en förankrade block av vävnad som är nedsänkt i en kyld medium bad, som jämfört utsnittet Krumdieck utövar mindre tvärkraft på vävnad. Detta resulterar i mindre hårda behandling av vävnaden före odling. Å andra är vibratome styckning mer tid och arbete konsumerar. I våra händer stansar vibratome skivning aktiverade produktion av högst 100 avgiften eller 500 avgiften i en dag, tillräckligt för mest experimentella studier. AVGIFTEN kan vara odlade på olika sätt: (a) bifogas Trans-brunnar, vilket genererar ett luft flytande gränssnitt (ALI) system, (b) som dynamiska orgelkultur (DOC) eller (c) nedsänkt i cellodlingsmedium vid standard cellen odlingsbetingelser. I-detalj odling av avgiften var tidigare beskrivna22,23,25; dock saknas fortfarande en gemensam standard av odling villkor mellan deras användning i olika laboratorier runt om i världen. I synnerhet kultur tiden kan vara kritiska: liksom murina avgiften, en förlust av SFTPC positiva alveolära typ 2 celler observeras efter 144 h, men inte efter 120 h22. Dessutom verkar metabolisk aktivitet förblir stabila i murina22 och mänskliga avgiften25 för 120 h.
Det finns ett par tekniska begränsningar för generering av avgiften: antalet och storleken på resectates varierar över tid. effektiviteten i Agarens fyllning, som beror på närvaron av intakt lungsäcken inom erhållna vävnaden, avgör den slutliga framgången av avgiften generationen. och vävnad förstörs orsakas av sjukliga förändringar inom den erhållna (sjuka) lungvävnaden kan störa avgiften beredning. Luftvägarna hinder och fibrotisk vävnad saknas intakt alveolära utrymme hindrar med agarosgelelektrofores fyllning och därmed göra skivning av fibrotisk vävnad en krävande uppgift. Emphysematous vävnader som finns i sjukdomar såsom kol eller alfa-1-anti-trypsin-brist inte kan tåla trycket av agaros fylla, och kommer att resultera i bristning av alveolerna och arkitektoniska artefakter. I dessa fall kan användningen av agaros som låg koncentration, t.ex., 1% (w/v), vara bra att minska trycket och snabba under agaros fyllning. Sammantaget kan tillståndet sjukdomen av vävnad dramatiskt begränsa användningen av vävnaden för avgiften generation. Alla dessa parametrar fastställa beloppet för avgiften som kan genereras från lungvävnad, och även hur lång tid det tar för att producera avgiften. Ytterligare är begränsningar av avgiften inkonsekvenser mellan olika lung skivor med avseende på storlek eller vävnad innehåll, vilket kräver ytterligare normalisering steg för experiment. För att övervinna detta, kan biopsi slag av liknande regioner i samma segment skapas. Detta förfarande är benägna att minska vävnad variabiliteten och, som en extra förmån, öka antalet avgiften prover som kan användas för experiment.
Sammanfattningsvis, mänskliga 3D lung vävnadskulturer från agaros fylld avgiften ger en komplex human modell för att studera lungcancer fysiologi och sjukdomar. Protokollet ger en detaljerad beskrivning av förberedelserna av avgiften från opererande lungvävnad och deras odling, och dessutom hanterar utmaningar i agaros fyllning av mänskliga lungan resektioner och hur man kan övervinna dem.
Disclosures
Alla författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Författarna är tacksam mot Marisa Neumann för teknisk experthjälp. Alla lungvävnad var vänligt tillhandahålls av CPC-M Bio-arkivet. Detta arbete stöds av stadens tyska Lung forskning (DĒZL), Helmholtz föreningen och CPC forskarskolan bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | - | |
| Hyrax CU 65 | Zeiss | - | |
| Vasofix Braunüle 18 G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
| 30 mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
| Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
| Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
| Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | - | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
| Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
| Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
- Rosenberg, S. R., Kalhan, R., Mannino, D. M. Epidemiology of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Prevalence, Morbidity, Mortality, and Risk Factors. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine Med. 36 (4), 457-469 (2015).
- Hekking, P. P., et al. The prevalence of severe refractory asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (4), 896-902 (2015).
- Woodard, G. A., Jones, K. D., Jablons, D. M. Lung Cancer Staging and Prognosis. Cancer Treatment and Research. 170, 47-75 (2016).
- Ley, B., Collard, H. R., King, T. E. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 183 (4), 431-440 (2011).
- Burgstaller, G., et al. The instructive extracellular matrix of the lung: basic composition and alterations in chronic lung disease. European Respiratory Journal. 50 (1), (2017).
- Degryse, A. L., Lawson, W. E. Progress toward improving animal models for idiopathic pulmonary fibrosis. The American Journal of the Medical Sciences. 341 (6), 444-449 (2011).
- Fricker, M., Deane, A., Hansbro, P. M. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 9 (6), 629-645 (2014).
- Sagar, S., Akbarshahi, H., Uller, L. Translational value of animal models of asthma: Challenges and promises. European Journal of Pharmacology. 759, 272-277 (2015).
- Williamson, J. D., Sadofsky, L. R., Hart, S. P. The pathogenesis of bleomycin-induced lung injury in animals and its applicability to human idiopathic pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 41 (2), 57-73 (2015).
- Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of beta2-adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
- Skronska-Wasek, W., et al. Reduced Frizzled Receptor 4 Expression Prevents WNT/beta-Catenin-driven Alveolar Lung Repair in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 196 (2), 172-185 (2017).
- Lehmann, M., et al. Senolytic drugs target alveolar epithelial cell function and attenuate experimental lung fibrosis ex vivo. European Respiratory Journal. 50 (2), (2017).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Ebsen, M., et al. Infection of murine precision cut lung slices (PCLS) with respiratory syncytial virus (RSV) and chlamydophila pneumoniae using the Krumdieck technique. Pathology - Research and Practice. 198 (11), 747-753 (2002).
- Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
- Royce, S. G., et al. Airway Remodeling and Hyperreactivity in a Model of Bronchopulmonary Dysplasia and Their Modulation by IL-1 Receptor Antagonist. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (6), 858-868 (2016).
- Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 309 (10), L1219-L1228 (2015).
- Zscheppang, K., et al. Human Pulmonary 3D Models For Translational Research. Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).
- Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Human & Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
- Wang, L., et al. Differences between Mice and Humans in Regulation and the Molecular Network of Collagen, Type III, Alpha-1 at the Gene Expression Level: Obstacles that Translational Research Must Overcome. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 15031-15056 (2015).
- Uhl, F. E., et al. Preclinical validation and imaging of Wnt-induced repair in human 3D lung tissue cultures. European Respiratory Journal. 46 (4), 1150-1166 (2015).
- Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicology and Applied Pharmacology. 246 (3), 107-115 (2010).
- Banerjee, A., et al. Trichostatin A abrogates airway constriction, but not inflammation, in murine and human asthma models. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 132-138 (2012).
- Alsafadi, H. N., et al. An ex vivo model to induce early fibrosis-like changes in human precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), L896-L902 (2017).
- Westra, I. M., Oosterhuis, D., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut liver slices as a model for the early onset of liver fibrosis to test antifibrotic drugs. Toxicology and Applied Pharmacology. 274 (2), 328-338 (2014).
- Vatakuti, S., Schoonen, W. G., Elferink, M. L., Groothuis, G. M., Olinga, P. Acute toxicity of CCl4 but not of paracetamol induces a transcriptomic signature of fibrosis in precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 29 (5), 1012-1020 (2015).
- Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Disease Models & Mechanisms. 8 (10), 1227-1236 (2015).
- Li, M., de Graaf, I. A., Groothuis, G. M. Precision-cut intestinal slices: alternative model for drug transport, metabolism, and toxicology research. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (2), 175-190 (2016).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Wagner, D. E., et al. Design and Synthesis of an Artificial Pulmonary Pleura for High Throughput Studies in Acellular Human Lungs. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 184-195 (2014).
