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मानव 3 डी फेफड़ों के ऊतक संस्कृतियों की पीढ़ी (3d-LTCs) रोग मॉडलिंग के लिए

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/58437
Automatic Translation
1,2,3, 4,5,6, 4,5,6, 2,7, *1,2,3, *1,2,3,8
1Comprehensive Pneumology Center, Ludwig-Maximilians-Universität and Helmholtz Zentrum Munich, 2German Center of Lung Research (DZL), 3Translational Lung Research and CPC-M bioArchive, Helmholtz Zentrum München, Comprehensive Pneumology Center Munich DZL/CPC-M, 4Department of Experimental Medical Science, Lung Bioengineering and Regeneration, Lund University, 5Wallenberg Center for Molecular Medicine, Lund University, 6Stem Cell Centre, Lund University, 7Asklepios Fachkliniken Munich-Gauting, 8Department of Medicine, Division of Pulmonary Sciences and Critical Care Medicine, University of Colorado
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम agarose-भरा मानव परिशुद्धता की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद-resected रोगी ऊतक है कि 3 डी फेफड़ों ऊतक संस्कृतियों के लिए जैविक और जैव चिकित्सा अध्ययन में मानव फेफड़ों के रोगों मॉडल पैदा करने के लिए उपयुक्त है से फेफड़ों के स्लाइस में कटौती ।

Abstract

मानव रोग के लिए उपंयास खोजों के अनुवाद मानव ऊतक की उपलब्धता रोग के आधार पर आधारित मॉडल द्वारा सीमित है । प्रेसिजन-कट फेफड़ों के स्लाइस (PCLS) 3d फेफड़े के ऊतकों संस्कृतियों (3d LTCs) के रूप में इस्तेमाल एक सुरुचिपूर्ण और जैविक रूप से अत्यधिक प्रासंगिक 3 डी सेल संस्कृति मॉडल है , जो अपनी जटिलता, जैव यांत्रिकी और आणविक के कारण सीटू के ऊतकों में समान प्रतिनिधित्व करते हैं संरचना. ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया व्यापक रूप से विभिंन पशु मॉडलों में लागू किया जाता है । 3 डी-मानव PCLS से व्युत्पंन LTCs उपंयास दवाओं, जो आगे बेहतर तंत्र और मानव ऊतक में दवाओं के कार्यात्मक प्रभाव को समझने में मदद कर सकता है के लिए प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण किया जा सकता है । शल्य चिकित्सा से PCLS की तैयारी फेफड़ों के ऊतकों के नमूने रोगियों, जो फेफड़े lobectomy अनुभवी, रोगग्रस्त और peritumoral ऊतक की पहुंच बढ़ जाती है । यहां, हम शल्य चिकित्सा नरम लोचदार रोगी फेफड़े के ऊतकों से मानव PCLS की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन । Agarose resectates के bronchoalveolar अंतरिक्ष में पेश किया गया था, इस प्रकार फेफड़ों की संरचना के संरक्षण और ऊतक कठोरता, जो बाद में टुकड़ा करने की क्रिया के लिए महत्वपूर्ण है बढ़ रही है । vibratome के साथ टिशू ब्लॉक से ५०० µm मोटे स्लाइस तैयार किए गए । बायोप्सी PCLS से लिया घूंसे तुलनीय ऊतक नमूना आकार सुनिश्चित करने और आगे ऊतक नमूनों की मात्रा में वृद्धि । जनित फेफड़ों के ऊतकों संस्कृतियों मानव फेफड़ों जीव विज्ञान में अध्ययन की एक किस्म में लागू किया जा सकता है, pathophysiology और विभिन्न रोगों के तंत्र सहित, अपने पर सबसे अच्छा में fibrotic प्रक्रियाओं के रूप में (उप-) सेलुलर स्तर. 3 डी-एलटीसी ex vivo मॉडल का सबसे अधिक लाभ 3 डी ऊतक वास्तुकला, सेल प्रकार विविधता और फेफड़ों के एनाटॉमी के संबंध में सीटू मानव फेफड़ों में के रूप में अच्छी तरह से व्यक्तिगत रोगियों से ऊतक के आकलन के लिए क्षमता के अपने करीबी प्रतिनिधित्व है, जो आगे सटीक दवा के लिए उपंयास रणनीतियों का विकास करने के लिए प्रासंगिक है ।

Introduction

जीर्ण और तीव्र फेफड़ों के रोगों1दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु का एक प्रमुख कारण हैं । प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग (सीओपीडी)2, गंभीर अस्थमा3, फेफड़ों के कैंसर4 और फैलाना parenchymal फेफड़ों के रोगों की तरह पुरानी फेफड़ों के रोगों के साथ रोगियों के लिए5, उपचारात्मक चिकित्सा वर्तमान में उपलब्ध नहीं हैं । हालांकि फेफड़ों के रोगों के लिए पशु मॉडलों में अध्ययन रोग6 pathomechanisms की समझ गहरा है और संभावित उपंयास चिकित्सकीय लक्ष्य7,8,9की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया है, इन मॉडलों को प्रासंगिक जैविक और शारीरिक मतभेद प्रदर्शित जब मनुष्यों की तुलना में10। murine और मानव जीव विज्ञान के बीच इन विसंगतियों को दूर करने के साथ ही शरीर रचना विज्ञान, मानव पूर्व vivo 3d फेफड़े के ऊतक संस्कृति (3d एलटीसी) सिस्टम जैव चिकित्सा अनुसंधान के विभिंन क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है । ये 3d एलटीसी कल्चर सिस्टम परिशुद्धता-कट लंग स्लाइसेस (PCLS) पर आधारित होते हैं. PCLS पूर्व vivo की पीढ़ी के एक तिहाई स्थानिक आयामीता है, जो पूरे alveoli और11एयरवेज में कोशिकाओं के स्थानिक और कार्यात्मक संबंधों की जांच के लिए अनुमति देता है के विश्लेषण की अनुमति देता है, साथ ही साथ interstitium, vasculature और mesothelium. विशेष रूप से, PCLS पूर्व vivo मॉडल कोशिकीय हैं, जिसका अर्थ है कि वे सीटू के फेफड़ों में सबसे कार्यात्मक कोशिकाओं होते हैं, इस प्रकार बारीकी से ' कोशिकाओं देशी जैविक पर्यावरण का प्रतिनिधित्व करने और इस तरह सीमित सेल पर काबू पाने-सेल और सेल मैट्रिक्स सबसे 2d में बातचीत सेल संस्कृति दृष्टिकोण । अबतक, पूर्व vivo murine PCLS सीओपीडी12, फेफड़े फाइब्रोसिस13, फेफड़ों के कैंसर14, वायरल संक्रमण15,16, bronchopulmonary dysplasia17की तरह फुफ्फुसीय रोगों, मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया और दमा18. हालांकि, मानव फेफड़ों के रोगों में उपंयास दवा चिकित्सा के काफी अनुपात है कि नैदानिक परीक्षणों में जांच की गई प्रभावकारिता या सुरक्षा की उनकी कमी के कारण क्लिनिक में अनुवाद नहीं कर रहे हैं, संभालने के कारण मानव और के बीच अभी तक काफी मतभेद murine जीव विज्ञान और रोग19,20,21.

कई वर्षों में, मानव PCLS मोटे तौर पर रसायनों और दवाओं के फेफड़ों विषाक्तता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हाल ही में, मानव फेफड़ों के ऊतकों सीओपीडी के साथ रोगियों से इस्तेमाल किया गया है22,23, अस्थमा24, और फेफड़ों फाइब्रोसिस25, pathophysiological और औषधीय अध्ययन को आगे बढ़ाने के लिए. प्रतिप्रदायिक रोगी अंग सामग्री का उपयोग करके और तत्संबंधी PCLS पैदा करके, एक एक जटिल 3 डी ऊतक पर्यावरण22 का प्रतिनिधित्व करने और अंग की देशी सेलुलर विविधता के सबसे बनाए रखने में दोहराऊंगा प्रमुख रोग की पहचान कर सकते हैं । इसके अलावा, रोगग्रस्त ऊतक प्रयोगात्मक setups की एक किस्म में लागू जिगर में परिवर्तन की तरह रोग की नकल करने के लिए दिखाया गया था, आंत और गुर्दे26,27,28,29.

हालांकि, फेफड़ों के ऊतकों की प्रोसेसिंग कई कारणों के लिए चुनौतीपूर्ण रहता है । ठोस ऊतक के विपरीत, देशी फेफड़े पैरेन्काइमा वेंटिलेशन के बिना पतन और कम ऊतक कठोरता दर्शाती है । इन गुणों ऊतक की टुकड़ा करने की क्रिया में बाधा । इस प्रकार, एयरवेज के भरने और कम-पिघलने बिंदु agarose के साथ वायुकोशीय अंतरिक्ष देशी फेफड़ों की संरचना को बरकरार रखता है और परिशुद्धता के लिए आवश्यक कठोरता-murine और मानव फेफड़ों की टुकड़ा करने की क्रिया कटौती30प्रदान करता है । मानव फेफड़े resectates अनुसंधान प्रयोजनों के लिए दान उनके स्वभाव anatomically द्वारा कर रहे हैं, आनुवंशिक रूप से और शारीरिक रूप से अत्यधिक विविध, इस प्रकार अक्सर एक उच्च अंतर रोगी परिवर्तनशीलता पेश जब25प्रयोग प्रदर्शन । पूरे पालि या पूरे फेफड़े के explants के विपरीत, फेफड़ों के नमूनों में वक्ष शल्य चिकित्सा के माध्यम से संप्रदाय जरूरी संरचनात्मक क्षेत्रों का पालन नहीं करते हैं और इसलिए विशेष तैयारी की आवश्यकता होती है । इस अनुच्छेद में, हम मानव PCLS की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत और अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो कि फेफड़ों के ऊतकों और उनके बाद की खेती और मॉडल फेफड़े के रोग के लिए प्रयोगात्मक उपयोग से होता है ।

Protocol

मानव ऊतक के उपयोग को लुडविग-Maximillian विश्वविद्यालय [म्यूनिख, जर्मनी (परियोजना संख्या 455-12) की एथिक्स समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था]. ट्यूमर से मुक्त मानव फेफड़ों के चौराहों फेफड़ों के रोगों के लिए Asklepios बैंक द्वारा प्रदान की गई (Gauting, जर्मनी, परियोजना संख्या 333-10) ।

नोट: मानव PCLS उत्पादन की सभी प्रक्रियाओं (चित्रा 1) एक बाँझ लामिना प्रवाह हुड के तहत किया जाता है ।

1. उपकरणों और सामग्री की तैयारी

  1. agarose के साथ फेफड़ों के ऊतकों की मुद्रास्फीति के लिए सभी सामग्री के रूप में नीचे वर्णित तैयार करें ।
    1. खेती को तैयार मध्यम: Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) एफ-12 एल के साथ पूरक-Glutamine, HEPES, १०,००० ie पेनिसिलिन, १०,००० ie Streptomycin और ०.१% (वी/वी) भ्रूण गोजातीय सीरम ।
      नोट: मध्यम ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रयोग किया जाता है ।
    2. एक बाँझ धातु टिशू पेपर के साथ कवर ट्रे तैयार करें । ट्रे पर एक बाँझ 15 सेमी सेल संस्कृति पकवान प्लेस ।
    3. खेती मध्यम के 15 मिलीलीटर के साथ सेल संस्कृति पकवान भरें ।
    4. एक 3% (डब्ल्यू/वी) agarose समाधान कम पिघलने बिंदु agarose की खेती मध्यम के 30 मिलीलीटर की एक ंयूनतम में उचित मात्रा को भंग करके तैयार करें ।
    5. एक माइक्रोवेव में उबलते तक समाधान गर्मी । एक जल स्नान में ४२ डिग्री सेल्सियस के लिए agarose समाधान ठंडा । तरल agarose समाधान पानी स्नान में संग्रहीत रखें ।
    6. तैयार कई ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों तरल agarose से भरा ।

2. संप्रदायिक फेफड़े के ऊतक

  1. ताजा ट्यूमर मुक्त फेफड़े के ऊतकों lobectomy resectates के तुरंत DMEM एफ में लकीर के बाद-12 मध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर चरण 3 तक ।
  2. ठंड से अधिक नहीं 4-8 एच के ischemia समय से पहले प्रसंस्करण के लिए ।

3. निरीक्षण और Agarose भरने से पहले संप्रदायिक ऊतक का चयन

  1. मध्यम से चिमटी के साथ ऊतक उठा । आदेश में ऊतक को किसी भी नुकसान से बचने के लिए, विशेष रूप से फुफ्फुस के लिए, वायुमार्ग में चिमटी के साथ ऊतक संभाल ही ।
  2. तालिका 1में परिभाषित फेफड़ों Agarose भरने के स्कोर के मानदंडों के आधार पर ऊतक की गुणवत्ता स्कोर ।
  3. यदि ऊतक गुणवत्ता के ऊपर या ७२ के बराबर है रन 4 कदम के लिए आगे बढ़ें । यदि ऊतक की गुणवत्ता ६० के नीचे बनाए रखा है, agarose भरने के साथ आगे जारी नहीं है ।
    नोट: यदि ऊतक स्कोर ६० और ६८ के बीच है, agarose भरने और ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया अभी भी उचित परिणाम हो सकता है, और प्रयोग की लालसा के लिए एक अंतिम निर्णय के मामले को मामला बना दिया है । हालांकि, फेफड़ों के ऊतकों कि उपर्युक्त आवश्यकताओं को पूरा नहीं किया, ज्यादातर agarose भरने में विफल रहता है ।

4. Agarose भरने के द्वारा फेफड़े के ऊतकों मुद्रास्फीति

  1. भंडारण माध्यम से ऊतक लिफ्ट और ऊतक से अतिरिक्त मीडिया नाली । 15 सेमी संस्कृति 1.1.2 में तैयार पकवान में फेफड़ों के ऊतकों स्थानांतरण ।
  2. 1.1.3 से कम पिघलने बिंदु agarose के साथ एक 30 मिलीलीटर सिरिंज भरें ।
  3. obturator को हटाने और यह एक 30 मिलीलीटर सिरिंज के लिए संलग्न द्वारा एक परिधीय शिरापरक कैथेटर तैयार
  4. ऊतक है कि ऊतक के एक बरकरार अनुभाग हवादार है में एक श्वसनी (0.5-3 मिमी व्यास) की पहचान ( चित्रा 2देखें) ।
  5. चयनित श्वसनी (0.5-3 मिमी व्यास) में प्रवेशनी डालें ।
  6. धीरे प्रवेशनी धक्का धीरे आगे के रूप में जहां तक संभव हो ।
  7. संदंश के साथ प्रवेशनी के चारों ओर दमा की दीवार सेक द्वारा प्रवेशनी के आसपास श्वसनी सील, आदर्श रूप में एक ही समय में किसी भी आसंन फुफ्फुसीय धमनी clamping ।
  8. बंद करना इन एयरवेज के माध्यम से agarose लीक रोकने के लिए एक शल्य क्लैंप के साथ अन्य अतिरिक्त एयरवेज ।
  9. संस्कृति पकवान से संदंश के साथ ऊतक उठा ।
  10. मैंयुअल रूप से कोई तेजी से ०.३ मिलीलीटर से सिरिंज के साथ agarose डालना/ agarose भरने की गति लगभग ०.०५ और ०.३ मिलीलीटर के बीच भिंन हो सकता है/एयरवेज और/या atelectasis के विषम प्रतिरोध के कारण ।
  11. यदि उच्च प्रतिरोध भरते समय या ऊतक से टपक agarose मनाया जाता है, तो चरण ४.४ से एक अलग श्वसनी के साथ पूरी प्रक्रिया का पुनर्प्रयास करें । नीचे बताए अनुसार समस्या निवारण करें ।
    नोट: agarose भरने की डिग्री ऊतक और क्षेत्रों की तरह छोटे शंकु के agarose भरने में कैथेटर के परिणामों के गहरी पैठ में कैथेटर की स्थिति पर अत्यधिक निर्भर है (*) फेफड़ों के ऊतकों (चित्रा 2c) ।
    1. उच्च प्रतिरोध के मामले में, कैथेटर की स्थिति की कोशिश ऊतक (#) (चित्रा 2d) के अधिकांश क्षेत्रों के उचित भरने की ओर जाता है ।
    2. समीपस्थ ब्रांकाई या अन्य airway अवरोधों में जल्दी जम agarose के प्लग के रूप में (तीर) ऊतक के एक अधूरा भरने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं (चित्रा 2E), इस भरे क्षेत्र में दोषों को जन्म दे सकता है के रूप में agarose भरने मजबूर नहीं है, लेकिन के एक भरने में नहीं बाधित ऊतक भागों ।
    3. cannulated श्वसनी से व्युत्पंन श्वसन पेड़ लकीर के दौरान क्षतिग्रस्त है और तरल agarose की एक निरंतर लीक में agarose भरने परिणाम ( चित्रा 2Fमें तीर), airway प्रणाली के एक अधिक परिधीय भाग में कैथेटर डालने के लिए ऊतक (*) (चित्रा 2g) का एक छोटा सा हिस्सा भरें । साथ ही, क्षतिग्रस्त पेरिफेरल airway को सर्जिकल क्लैंप (arrow) (figure2H) के साथ सील करें ।
  12. फेफड़ों के ऊतकों को पूरी तरह से भर जाता है जब तक agarose लागू करें । अधिक नहीं ऊतक फुलाना के रूप में इस ऊतक संरचना और उसकी कोशिकाओं को अपरिवर्तनीय नुकसान का कारण हो सकता है ।
  13. श्वसनी कि भरने के लिए इस्तेमाल किया गया था तुरंत दबाना । clamping करने से पहले प्रवेशनी निकालें ।
  14. agarose solidification सुनिश्चित करने के लिए 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति माध्यम में ऊतक की मशीन ।
  15. यदि resected ऊतक एकाधिक दमा प्रविष्टियों है, दोहराने चरण ४.२ करने के लिए ४.१३ जब तक ऊतक के सभी भागों agarose से भर रहे हैं ।
  16. टुकड़ा करने की क्रिया जब तक 4 ° c ठंड मध्यम में agarose भरा फेफड़ों के ऊतकों की दुकान ।

5. परिशुद्धता-काट फेफड़ों टुकड़ा करने की क्रिया

  1. फेफड़ों के ऊतकों है कि ठोस agarose से भर रहे है क्षेत्रों की पहचान । वे धीरे सेल संस्कृति पकवान के नीचे के खिलाफ चिमटी के साथ दबाया जाता है जब ठोस रूप से भरा क्षेत्रों पतन नहीं होगा ।
    1. ५.१ में वर्णित क्षेत्रों के 1-1.5 सेमी3 ब्लॉक एक्साइज, जबकि एक तरफ अभी भी फुफ्फुस के साथ कवर किया जाना चाहिए ।
  2. एक cyanoacrylate गोंद का उपयोग करके vibratome के धारक से संपर्क फुफ्फुस पक्ष के साथ प्रत्येक व्यक्ति के ऊतकों ब्लॉक देते हैं ।
    नोट: फुफ्फुस थोड़ा लोचदार है और इसलिए vibratome ब्लेड के साथ काटने में बाधा उत्पंन । ऊतक धारक पर रखा, फुफ्फुस काटने के साथ हस्तक्षेप नहीं होगा और, महत्वपूर्ण बात, cyanoacrylate गोंद और ऊतक पैरेन्काइमा गोंद के ंयूनतम प्रसार के लिए अनुमति के बीच एक प्राकृतिक बाधा रूपों ।
  3. निंनलिखित सेटिंग्स के साथ vibratome के साथ फेफड़ों के ऊतकों स्लाइस: मोटाई: ५०० µm, आवृत्ति: १०० हर्ट्ज, चाकू के आयाम: १.२ मिमी, 3-12 µm के ब्लेड के आगे की गति/एस, जो ऊतक कठोरता पर निर्भर करता है । अगर टुकड़ा ठीक से कटौती नहीं है, या अगर ऊतक ब्लॉक ही कांपना शुरू होता है ब्लेड की दखलंदाजी-गति को कम करें ।
  4. धीरे vibratome ट्रे से संदंश के साथ एक 12 की अच्छी तरह से खेती मध्यम से भरी थाली के एक कुआं में उठाने से टुकड़ा हस्तांतरण । अंत में, मानक सेल संस्कृति की स्थिति के तहत एक मशीन में फेफड़ों स्लाइसें मशीन ।
  5. टुकड़ा करने की क्रिया बंद जब ऊतक ब्लॉक के 2-3 mm unslice गोंद इस क्षेत्र की ऊतक अखंडता समझौता हो सकता है के बाद से काट दिया जाता है ।

6. PCLS घूंसे की जनरेशन

  1. एक खाली 10 सेमी डिश के लिए एक अच्छी तरह से फेफड़ों के स्लाइस स्थानांतरण ।
  2. एक PCLS की ऊपरी सतह के लिए एक 4 मिमी बायोप्सी पंच orthogonally प्लेस और दक्षिणावर्त और उल्टी घुमाव में पंच ले जाने के लिए शुरू करते हैं ।
  3. एक ९६-अच्छी तरह से थाली के कुओं में सेल संस्कृति माध्यम भरें । संदंश के साथ ऊतक घूंसे लिफ्ट और एक ९६-अच्छी तरह से थाली के कुओं में घूंसे हस्तांतरण । अंत में, 1.1.1 में तैयार माध्यम में डूब फेफड़ों घूंसे मशीन । मानक शर्तों के तहत एक सेल संस्कृति मशीन में (21% (वी/वी) ऑक्सीजन, 5% (वी/वी) कार्बन डाइऑक्साइड और ९५% आर्द्रता, ३७ डिग्री सेल्सियस पर) ।

7. टिशू कल्चर और सैंपल हार्वेस्टिंग

  1. संस्कृति PCLS और मानक सेल संस्कृति की स्थिति के तहत एक मशीन में रातोंरात घूंसे ।
  2. संस्कृति PCLS और १२० घंटे की एक अधिकतम के लिए उल्लिखित शर्त के तहत घूंसे उनकी पीढ़ी के लिए सेलुलर व्यवहार्यता और कार्य सुनिश्चित करने के लिए ।
  3. कटाई के लिए प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आरएनए, PCLS धोने और फास्फेट में तीन बार मुक्का मारा खारा (पंजाब), उंहें cryovials और स्नैप-फ्रीज में तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरण ।
  4. स्रावित प्रोटीन के विश्लेषण के लिए कल्चर्ड PCLS घूंसे का नमूना मध्यम supernatant.
    1. ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए, PCLS को धो लें और पंजाबियों के साथ तीन बार घूंसे और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन द्वारा उंहें 4% paraformaldehyde के साथ ठीक । अंत में, आगे की बहाव धुंधला के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पंजाब में PCLS की दुकान ।

Representative Results

PCLS जनरेशन
PCLS की पीढ़ी चार आवश्यक चरणों में अलग किया जा सकता है: सर्जिकल फेफड़े के ऊतकों लकीर, agarose भरना, vibratome आधारित PCLS पीढ़ी, और PCLS की संस्कृति । संप्रदाय फेफड़ों ऊतक कम पिघलने बिंदु agarose, जो टुकड़ा करने की क्रिया के लिए फेफड़ों के ऊतकों को आवश्यक कठोरता कहते है और देशी फेफड़ों की संरचना और वास्तुकला को बरकरार रखता है से भर जाता है । ध्यान दें की, PCLS पीढ़ी अत्यधिक समय लेने वाली है, इस प्रकार अक्सर रातोंरात भंडारण DMEM एफ में भरा फेफड़ों के ऊतकों के 12 मध्यम एक अतिरिक्त कदम के रूप में शामिल किया जा सकता है और PCLS पीढ़ी अगले दिन पर शुरू कर दिया है । निंनलिखित प्रयोगात्मक सेटअप पर निर्भर करता है, उत्पंन PCLS मानक सेल संस्कृति ०.१% (डब्ल्यू/वी) भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त माध्यम में रातोंरात तैयार किया जा सकता है, प्रयोगात्मक शर्तों के पहले लागू कर रहे हैं । 3 डी-LTCs व्यवहार्य और प्रदर्शन सेलुलर कार्यशीलता (जैसे surfactant प्रोटीन स्राव के रूप में) के लिए १२० ज22 के लिए इस प्रोटोकॉल (चित्रा 1) में उल्लिखित संस्कृति की स्थिति में थे और उसके आगे सुधार पर अनुकूलित किया जा सकता है ।

Agarose भरना
ऊतक के agarose भरने के लिए, agarose-भरा सिरिंज से जुड़ी १.३ मिमी व्यास के साथ एक परिधीय शिरापरक कैथेटर की एक प्रवेशनी में कटौती ऊतक की सतह पर एक श्वसनी में डाला गया था (चित्रा 2a). ब्रांकाई अक्सर एक फेफड़े के धमनी के पास स्थानीयकृत रहे हैं । जबकि धमनियों पतली दीवारों है और पतन के लिए करते हैं, ब्रांकाई एक अच्छा दिखाई लुमेन का प्रदर्शन किया । ऊतक अखंडता के आधार पर, कैथेटर फेफड़ों की परिधि में श्वसन पेड़ की कई पीढ़ियों के माध्यम से उन्नत किया जा सकता है । प्रवेश श्वसनी चिमटी (चित्रा बी) का उपयोग करके प्रवेशनी के आसपास सील किया गया था । फुफ्फुसीय धमनी एक ही समय में चिमटी से clamped किया जा सकता है । बाद में, ऊतक ऊपर उठाया है और तरल agarose धीरे वायुमार्ग में जगाकर है ।

कैथेटर की स्थिति पर निर्भर करता है, ऊतक के बहुमत तरल agarose (चित्रा 2d) से भरा जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, शंकु फेफड़ों के ऊतकों, जो फेफड़ों के पैरेन्काइमा में प्रवेश श्वसनी द्वारा हवादार को प्रतिबिंबित के भागों की तरह, agarose (चित्रा 2c) से भरा हो सकता है । दोनों परिदृश्यों में, ठोस रूप से भरे ऊतक क्षेत्रों का एक विशिष्ट पैटर्न देखा जा सकता है: पहला, ऊतक का एक प्रमुख हिस्सा कील (चित्रा 2d) में भरा हुआ है, या दूसरी बात, अच्छी तरह से भरे ऊतक क्षेत्रों के छोटे फैला हुआ दौर क्षेत्रों दिखाई देते हैं ( चित्र 2c). agarose थक्के या अन्य कारणों के कारण एयरवेज बाधा के कुछ हिस्सों, ऊतक के कुछ हिस्सों agarose के साथ ठीक से भरा नहीं हो सकता है । इस प्रकार, ऊतक के केवल भागों टुकड़ा करने की क्रिया के लिए लागू हो सकता है । agarose भरने की प्रक्रिया के दौरान रिसावों के मामले में, भरा श्वसन पेड़ के कुछ हिस्सों छिद्रित हो सकता है और फेफड़ों के ऊतकों को भरने लगभग असंभव हो जाता है लेकिन, संभव वर्कअराउंड एक अधिक परिधीय श्वसनी के माध्यम से भरना शामिल हैं, एक गहरी बाहर एयरवेज (चित्रा 2g), या रिसाव क्षेत्र (चित्रा 2H) के संभावित clamping में प्रवेशनी के प्रवेश ।

परिशुद्धता-कट फेफड़ों टुकड़ा करने की क्रिया
एक लंबाई और 1-1.5 सेमी की चौड़ाई में ऊतक ब्लॉकों ऊतक क्षेत्रों है, जो पूरी तरह से जम agarose (आंकड़ा 3बी)से भर रहे थे से आबकारी थे । अगले, व्यक्तिगत ऊतक ब्लॉकों vibratome के ऊतक धारक पर चिपके हुए थे (आंकड़ा 3सी) । ५०० µm मोटी PCLS उत्पंन किया गया है, जबकि vibratome में ऊतक ब्लॉक 3-12 µm के बीच गति के साथ आगे बढ़ रहा था/एस (चित्रा 3d3F) । अंत में, PCLS सेल संस्कृति ०.१% (डब्ल्यू/वी) भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त माध्यम में डूबे थे और मानक सेल संस्कृति की स्थिति में कल्चरित, के रूप में कदम 7 उल्लिखित ।

संवर्धन के 48h के बाद मानव 3d-एलटीसी की प्रायोगिक readouts
एक प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला, के रूप में पहले Alsafadi एट अल.25द्वारा वर्णित है, चित्र 4a-4cमें दिखाया गया है । Immunolabeling fibronectin (लाल) और सेल नाभिक (DAPI, ब्लू), मानव 3d एलटीसी पूर्व vivo में संरक्षित वायुकोशीय संरचना के इमेजिंग के लिए अनुमति दी । एक profibrotic cytokine कॉकटेल के साथ मानव PCLS घूंसे के उपचार (वृद्धि कारक बीटा 1 को बदलने सहित, प्लेटलेट व्युत्पंन विकास कारक एबी, lipophosphatidyl एसिड, और ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा) के लिए ४८ ज फाइब्रोसिस के परिणामस्वरूप मानव में परिवर्तन की तरह 3d-LTCs । qPCR द्वारा, फाइब्रोसिस के एक महत्वपूर्ण प्रेरण-प्रासंगिक extracellular मैट्रिक्स घटकों कोलेजन प्रकार 1 और 3 डी में fibronectin जीन-एलटीसी घूंसे profibrotic कॉकटेल (चित्रा 4d) के साथ इलाज पर मनाया गया । इसके अतिरिक्त, mesenchymal मार्कर vimentin के प्रोटीन का स्तर 3d एलटीसी घूंसे (चित्रा 4E) के उपचार के बाद 4 रोगियों में से 3 में अनियमित पाया गया ।

Figure 1
चित्रा 1: PCLS पीढ़ी के कार्यप्रवाह । फेफड़ों लकीर के ट्यूमर मुक्त क्षेत्रों अच्छी तरह से अपने ऊतक अखंडता के कारण निरीक्षण कर रहे हैं । यदि ऊतक आगे उपयोग के लिए उपयुक्त रन बनाए है (स्कोरिंग सामग्री और तरीकों अनुभाग में विस्तार से समझाया गया है), यह अगले तरल agarose से भरा है । ऊतक जम agarose से भरा ब्लॉकों बाद में एक vibratome के साथ कटा हुआ हैं । सेल संस्कृति माध्यम में जलमग्न, 3 डी-एलटीसी अपनी पीढ़ी के बाद १२० ज के लिए संस्कृति रहे हैं । 3 डी-LTCs के बहाव का विश्लेषण प्रोटीन या आरएनए-अभिव्यक्ति, जीवित ऊतक प्रतिदीप्ति इमेजिंग, साथ ही ऊतक के निर्धारण के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग शामिल है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: कम पिघलने बिंदु agarose के साथ फेफड़ों के ऊतकों को भरने । फेफड़े के ऊतकों एक परिधीय शिरापरक कैथेटर जो एक श्वसनी फुफ्फुसीय धमनी (चित्रा 2a) के निकटवर्ती में डाला जाता है के साथ cannulated है । चिमटी श्वसनी में प्रवेशनी को ठीक करने के लिए और फेफड़े के धमनी को दबाना तरल agarose के लीक से बचने के लिए उपयोग किया जाता है । ४२ ° c पर तरल agarose एक 30 मिलीलीटर सिरिंज (चित्रा बी) के साथ फेफड़ों के ऊतकों में डाल दिया है । भरने के दौरान प्रवेशनी की एक बाहर की स्थिति भरा ऊतक (चित्रा 2c) के छोटे क्षेत्रों में परिणाम होगा, जबकि समीपस्थ स्थिति एक बड़ा ऊतक मात्रा (चित्रा 2d) के भरने सुनिश्चित करेगा । वायुमार्ग के किसी भी अवरोधकों ऊतक मात्रा कि भरा जा सकता है की मात्रा कम हो जाएगा (चित्रा 2E). agarose लीक होने के मामले में, एक बाहर का प्रवेशनी पोजिशनिंग और/या रिसाव की ओर अकड़न फेफड़ों के ऊतकों के उचित agarose भरने (चित्रा 2F-2H)सक्षम बनाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: परिशुद्धता-काट फेफड़ों टुकड़ा करने की क्रिया । एक सफलतापूर्वक agarose-भरे फेफड़े के ऊतकों एक स्केलपेल (आंकड़ा 3ए) के साथ एक ऊतक ब्लॉक (1 सेमी x १.५ सेमी एक्स 1 सेमी) का एक टुकड़ा उत्पाद करने के लिए प्रयोग किया जाता है । अगले उत्पाद वाले ऊतक ब्लॉक ऊतक धारक से चिपके हुए है, स्केल बार 1 सेमी (चित्रा 3 बी) इंगित करता है । अधिमानतः, ऊतक के रूप में चित्र 3सी में दिखाया ऊतक धारक की सतह के लिए अपनी फुफ्फुस सतह के साथ चिपके हुए है । ५०० µm मोटी स्लाइस ऊतक (चित्रा 3 डी और 3E) के सापेक्ष एक 10 डिग्री-15 ° कोण में एक नीलमणि चाकू के साथ vibratome द्वारा काट रहे हैं । 2-3 सेमी में काटने की प्रक्रिया परिणाम3 बड़े बरकरार फेफड़े के स्लाइस, स्केल बार = 5 मिमी (चित्रा 3F) । इसके अतिरिक्त, एक बायोप्सी पंच का उपयोग करके, 4 मिमी के व्यास के साथ छोटे reproducible घूंसे उत्पन्न किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: संस्कृति के 48h के बाद मानव 3d-LTCs का प्रायोगिक readouts. 4 मिमी व्यास का एक मानव 3d एलटीसी पंच fibronectin के लिए immunostained (लाल) और DAPI (नीले रंग में) (चित्रा 4a-4c) था । स्केल पट्टियां = १,००० µm. चित्रा 4c मर्ज की गई छवि दिखाता है । PCLS का आरएनए विश्लेषण मात्रात्मक आरटी द्वारा-पीसीआर profibrotic कॉकटेल25द्वारा COL1A1 और FN1 जीन अभिव्यक्ति की उल्लेखनीय वृद्धि दर्शाता है । चित्रा 4E PCLS, जो एक fibrotic कॉकटेल25के साथ इलाज किया गया के पूरे प्रोटीन lysates के एक immunoblot प्रदर्शित करता है । Vimentin के लिए जांच और β-Actin रोगी नमूने 1, 3, और 4 में profibrotic कारकों के साथ उपचार के बाद mesenchymal मार्कर (Vimentin) के एक वृद्धि हुई प्रोटीन अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

कसौटी अंक
ऊतक नमूना है फुफ्फुस सतह बरकरार है । 20
ऊतक नमूने macroscopically बरकरार है, चीरा, स्क्वैश, टूटना और विकृतियों की कमी लगता है । 20
ऊतक के नमूने में एक व्यास > 1mm के साथ कम से एक श्वसनी शामिल हैं । 20
ऊतक के नमूने में रक्त का कोई या केवल कम मात्रा में होता है । 4
ऊतक नमूना मध्यम में पूरी तरह से संग्रहीत किया गया था और atelectasis की कोई स्पष्ट संकेत से पता चलता है. 4
पिछले चौबीस घंटे के अंदर टिश्यू सैम्पल को दोबारा से संप्रदाय किया गया । 4
ऊतक के नमूने अपने सबसे बड़े व्यास में 5cm से बड़ा है । 4
कुल योग में:

तालिका 1: फेफड़ों Agarose भरने स्कोर । फेफड़ों Agarose भरने स्कोर (LAFS) सफलता की दर के साथ अपने बाद vibratome आधारित PCLS उत्पादन के लिए Agarose के साथ एक ऊतक लकीर भरने के साथ संबद्ध । स्कोर मानदंडों के सभी बिंदुओं को ऊतक से मुलाकात की रकम । एक LAFS बराबर या ऊपर ७२ भविष्यवाणी अच्छा agarose भरने के गुण, ६० नीचे एक अंक ऊतक के agarose भरने की एक उच्च संभावित विफलता की भविष्यवाणी की ।

Discussion

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल तरल agarose और बाद vibratome टुकड़ा करने की क्रिया के साथ भरने के द्वारा मानव फेफड़े के ऊतकों resectates से PCLS की पीढ़ी को शामिल किया गया । ऊतक स्लाइस की पीढ़ी के अंगों के एक जोड़े के लिए पहले प्रदर्शन किया, जिगर और मस्तिष्क की तरह था, जबकि इन अंगों की अंतर्निहित कठोरता ऊतक के किसी भी संशोधन के बिना सीधे टुकड़ा करने की क्रिया की अनुमति दी । ध्यान दें, फेफड़ों के ऊतकों की प्रारंभिक उचित तैयारी PCLS पैदा करने में सबसे महत्वपूर्ण कदम है । फेफड़ों के Agarose भरने अपनी नरम और लोचदार प्रकृति को स्थिर करने के लिए पसंद की विधि है, और एक समरूप और reproducible PCLS पीढ़ी को सुनिश्चित करने के लिए । छोटे वायुमार्ग के लिए पहुंच प्रदान करने के लिए cannulated फेफड़ों के ऊतकों के बड़े एयरवेज, और साथ ही बरकरार फेफड़ों पैरेन्काइमा के लिए कर रहे हैं । एक बरकरार फुफ्फुस की कमी है, जो agarose लगभग असंभव भरने बनाता है, एक प्रमुख कारण है क्यों फेफड़ों ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया के लिए ज्यादातर प्रयोग करने योग्य नहीं है । संभावित रूप से, एक सिंथेटिक फुफ्फुस मूल रूप से प्रताड़ित मचानों पर कार्यात्मक प्रयोगों के लिए डिज़ाइन संभावित explants के सफल agarose भरने कि एक बरकरार फुफ्फुस31कमी को प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है । फुफ्फुस बरकरार के साथ एक मानव फेफड़े के ऊतकों टुकड़ा में जिसके परिणामस्वरूप लकीर टुकड़ा करने की क्रिया के लिए ऊतक ब्लॉकों पैदा करने के लिए आवश्यक हैं । कीट ऊतक अधिक पूरी तरह से बरकरार पालियों से कैंसर लकीरें या पूरे फेफड़ों explants जो रोगियों के फेफड़ों प्रत्यारोपण किया गया से ट्यूमर मुक्त ऊतक के कारण उपलब्ध है ।

सामांयतः, दो प्रणालियों PCLS उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जाता है: Krumdieck ऊतक स्लाइसर15 और थरथानेवाला microtomes (vibratomes) । ऊतक स्लाइसर एक धातु पोत है, जो इस पोत के अंत में ९० डिग्री पर PCLS में कटौती के माध्यम से एक ऊतक ब्लॉक गुजर द्वारा स्लाइसें उत्पंन करते हैं । Vibratomes ऊतक पर कम कतरनी बल डालती है जो एक शांत मध्यम स्नान, में जलमग्न हो जाता है कि एक कूल्ड मीडियम बाथ, में डूब जाता है के एक लंगर ब्लॉक पर क्षैतिज एक हिल चाकू ले जाकर PCLS उत्पन्न करते हैं । यह खेती से पहले ऊतक के कम कठोर उपचार में परिणाम है । दूसरी ओर, vibratome कटिंग अधिक समय और काम लेने वाली होती है । हमारे हाथ में, vibratome टुकड़ा करने की क्रिया एक दिन में १०० PCLS या ५०० PCLS घूंसे की एक अधिकतम के उत्पादन में सक्षम है, सबसे प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए पर्याप्त है । PCLS विभिंन तरीकों से प्रसंस्कृत किया जा सकता है: (क) ट्रांस कुओं से जुड़ी, इस प्रकार एक एयर लिक्विड इंटरफेस (अली) प्रणाली, (ख) गतिशील अंग संस्कृति (डॉक्टर), या (ग) के रूप में सेल संस्कृति माध्यम में जलमग्न मानक सेल संस्कृति की स्थिति में पैदा । PCLS की खेती में विस्तार से पहले22,23,25वर्णित किया गया था; हालांकि, दुनिया भर में विभिंन प्रयोगशालाओं में उनके उपयोग के बीच खेती की स्थिति का एक सामांय मानक अभी भी याद आ रही है । विशेष रूप से, culture समय महत्वपूर्ण हो सकता है: के रूप में murine PCLS, SFTPC धनात्मक वायुकोशीय प्रकार 2 कक्षों की हानि १४४ h के बाद मनाया जाता है, लेकिन नहीं १२० h22के बाद । इसके अलावा, चयापचय गतिविधि के लिए murine में स्थिर रहने लगता है22 और मानव PCLS25 के लिए १२० ज ।

PCLS की पीढ़ी के लिए तकनीकी सीमाओं के एक जोड़े हैं: संख्या और resectates के आकार समय के साथ उतार चढ़ाव; agarose भरने की क्षमता है, जो प्राप्त ऊतक के भीतर बरकरार फुफ्फुस की उपस्थिति पर निर्भर करता है, PCLS पीढ़ी की अंतिम सफलता निर्धारित करता है; और ऊतक विनाश प्राप्त (रोगग्रस्त) फेफड़े के ऊतकों के भीतर रोग परिवर्तन की वजह से PCLS तैयारी के साथ हस्तक्षेप हो सकता है । Airway अवरोधों और fibrotic बरकरार वायुकोशीय अंतरिक्ष कमी ऊतक agarose भरने के साथ बाधा और इस तरह fibrotic ऊतक एक मांग कार्य की टुकड़ा करने की क्रिया करना । सीओपीडी या अल्फा-1-विरोधी trypsin की कमी के रूप में रोगों में पाया Emphysematous ऊतकों agarose भरने के दबाव का सामना नहीं कर सकता है, और alveoli और स्थापत्य कलाकृतियों का टूटना में परिणाम होगा । इन मामलों में, कम agarose एकाग्रता का उपयोग, उदाहरण के लिए , 1% (डब्ल्यू/वी), agarose भरने के दौरान दबाव और गति में कमी करने के लिए उपयोगी हो सकता है । कुल मिलाकर, ऊतक के रोग राज्य नाटकीय रूप से PCLS पीढ़ी के लिए ऊतक के उपयोग को सीमित कर सकते हैं । इन सभी मापदंडों PCLS की मात्रा है कि फेफड़ों के ऊतकों से उत्पन्न किया जा सकता है, और यह भी समय की मात्रा PCLS उत्पादन करने के लिए लेता है निर्धारित करते हैं । PCLS की आगे सीमाएं आकार या ऊतक सामग्री के संबंध में विभिन्न फेफड़ों के स्लाइस के बीच में विसंगतियां हैं, जिन्हें प्रयोगों के लिए आगे सामान्यीकरण चरणों की आवश्यकता होती है. इस पर काबू पाने के लिए, एक ही स्लाइस के समान क्षेत्रों के बायोप्सी घूंसे उत्पन्न किया जा सकता है । यह प्रक्रिया ऊतक परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए उपयुक्त है और, एक अतिरिक्त लाभ के रूप में, प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि PCLS नमूनों की संख्या में वृद्धि.

अंत में, मानव 3 डी agarose से फेफड़ों के ऊतकों संस्कृतियों फेफड़ों शरीर क्रिया विज्ञान और रोगों के अध्ययन के लिए एक जटिल मानव मॉडल प्रदान PCLS भर । प्रोटोकॉल resected फेफड़ों के ऊतकों और उनकी खेती से PCLS की तैयारी का एक विस्तृत वर्णन प्रदान करता है, और इसके अलावा मानव फेफड़ों के चौराहों के भरने agarose में चुनौतियों का पता है और कैसे उंहें दूर करने के लिए ।

Disclosures

सभी लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

लेखक विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए Marisa न्यूमन के आभारी हैं. सभी फेफड़ों के ऊतकों कृपया सीपीसी-एम जैव-संग्रह द्वारा प्रदान की गई । इस काम को जर्मन फेफड़े अनुसंधान केंद्र (DZL), Helmholtz एसोसिएशन और सीपीसी अनुसंधान स्कूल अनुदान के द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Hyrax V50 Zeiss -
Hyrax CU 65 Zeiss -
Vasofix Braunüle 18 G B. Braun Melsungen AG 4268130B
30 mL NORM-INJECT Henke Sass Wolf 4830001000
Guarded disposable scalpels, sterile Swann-Morton
Loctite 406 Henkel LOCTITE 406
Synthetic Single Crystal Sapphire Delaware Diamond Knives -
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES Gibco 31330-038
Penicillin Streptomycin Gibco by Life Technologies 15070-063
Special process fetal bovine serum (Sera Plus) Pan Biotech P30-3702
Disposable Biopsy Punch pfm medical 48401
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile Falcon / Corning 353219
Agarose, low geling temperature Sigma A9414-100G

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References

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Gerckens, M., Alsafadi, H. N., Wagner, D. E., Lindner, M., Burgstaller, G., Königshoff, M. Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling. J. Vis. Exp. (144), e58437, doi:10.3791/58437 (2019).

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