Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Generasjon av menneskelig 3D lungevev kulturer (3D-LTCs) for sykdom modellering

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/58437
Automatic Translation
1,2,3, 4,5,6, 4,5,6, 2,7, *1,2,3, *1,2,3,8
1Comprehensive Pneumology Center, Ludwig-Maximilians-Universität and Helmholtz Zentrum Munich, 2German Center of Lung Research (DZL), 3Translational Lung Research and CPC-M bioArchive, Helmholtz Zentrum München, Comprehensive Pneumology Center Munich DZL/CPC-M, 4Department of Experimental Medical Science, Lung Bioengineering and Regeneration, Lund University, 5Wallenberg Center for Molecular Medicine, Lund University, 6Stem Cell Centre, Lund University, 7Asklepios Fachkliniken Munich-Gauting, 8Department of Medicine, Division of Pulmonary Sciences and Critical Care Medicine, University of Colorado
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll forberedelse til agarose-fylt menneskelige presisjonsstyrte kutte lunge skiver fra resected pasienten vev som er egnet for å generere 3D lunge vev kulturene modell menneskelige lungesykdommer i biologiske og biomedisinsk studier.

Abstract

Oversettelse av romanen funn som menneskelig sykdom er begrenset av tilgjengeligheten av menneskelig vev-baserte modeller av sykdom. Presisjonsstyrte kutte lunge skiver (PCLS) brukes som 3D lunge vev kulturer (3D-LTCs) representerer en elegant og biologisk svært relevante 3D celle kultur modell, som ligner svært på i situ vev på grunn av sin kompleksitet, biomekanikk og molekylære komposisjon. Vev kutting er mye brukt i ulike dyr modeller. 3D-LTCs avledet fra menneskelige PCLS kan brukes til å analysere Svar å romanen narkotika, som kan videre hjelpe deg å bedre forstå de mekanismer og funksjonelle effekten av legemidler i menneskelig vev. Utarbeidelse av PCLS fra kirurgisk resected lunge vevsprøver av pasienter, som erfarne lunge lobectomy, øker tilgjengeligheten av syke og peritumoral vev. Her beskriver vi en detaljert protokoll for generering av menneskelig PCLS fra kirurgisk resected myk-elastisk pasientens lungevev. Agarose ble introdusert i bronchoalveolar løpet av resectates, dermed bevare lunge strukturen og øke vevets stivhet, som er avgjørende for påfølgende kutting. 500 µm tykke skiver var forberedt fra vev blokken med en vibratome. Biopsi slag fra PCLS sikre sammenlignbare vev utvalgene og øke mengden av vevsprøver. Genererte lunge vev kulturer kan brukes i en rekke studier i menneskelig lunge biologi, inkludert patofysiologi og mekanismer av ulike sykdommer, for eksempel fibrotiske prosesser på sitt beste på (sub-) mobilnettet nivå. Høyeste fordelen av 3D-LTC ex vivo modellen er nær representasjonen av i situ menneskelige lunge i 3D vev arkitektur, celle type mangfold og lunge anatomi samt potensialet for vurdering av individuelle pasienter, som er relevant å videreutvikle romanen strategier for presisjon medisin.

Introduction

Kronisk og akutt lungesykdommer er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet verden1. For pasienter med kroniske lungesykdommer som hindrende lunge sykdom (COPD)2, alvorlig astma3, lunge kreft4 og diffuse parenchymal lunge sykdommer5er helbredende terapier ikke tilgjengelig. Selv om studier i dyremodeller for lungesykdommer har dypere forståelse av sykdommen pathomechanisms6 og har ført til identifisering av potensielle romanen terapeutiske mål7,8,9, disse modellene viser relevante biologiske og fysiologiske forskjeller sammenlignet med mennesker10. For å overvinne disse avvikene mellom murine og menneskets biologi samt anatomi, menneskelige ex vivo 3D lunge vev kultur er (3D-LTC) systemer brukt i ulike områder av biomedisinsk forskning. Disse 3D-LTC kultur systemene er basert på presisjonsstyrte kutte lunge skiver (PCLS). Generasjonen av PCLS ex vivo tillater analyse av en tredje romlige dimensionality, som gir mulighet for etterforskningen av romlige og funksjonelle forholdet mellom celler i hele alveoler og airways11, samt interstitium, blodkar og mesothelium. Spesielt er PCLS ex vivo modeller flercellet, betyr at de inneholder mest funksjonelle cellene i i situ lungene, dermed tett som representerer cellene innfødt biologiske miljøet og dermed overvinne den begrenset celle-celle og celle-matrix samhandling i de fleste 2D cellekultur tilnærminger. Inntil nå, ex vivo murine PCLS ble brukt til å modellere lunge sykdommer som COPD12, lunge fibrosis13, lunge kreft14, virusinfeksjon15,16, bronkopulmonal dysplasia17, og astma18. Imidlertid en betydelig andel av roman stoff terapi i menneskelig lungesykdommer som ble undersøkt i kliniske forsøk ikke oversette til klinikken på grunn av deres mangel på effekt eller sikkerhet, assumingly grunn ennå betydelig forskjeller mellom menneske og murine biologi og sykdom19,20,21.

Over flere år, har menneskelige PCLS vært i stor grad brukt å vurdere lunge toksisitet av kjemikalier og narkotika. Bare nylig har menneskelige lungevev vært brukt fra pasienter med COPD22,23, astma24og lunge fibrosis25, å forfølge patofysiologiske og farmakologiske studier. Bruke resected pasienten orgel materiale og generere PCLS, en kan recapitulate store sykdom kjennetegnene i en kompleks 3D vev miljø22 representerer og vedlikeholde mesteparten av innfødte mobilnettet mangfoldet av orgelet. Videre ble syke vev som er brukt i en rekke eksperimentelle oppsett vist å etterligne sykdom som endringer i lever, tarm og nyre26,27,28,29.

Behandling av lungevev imidlertid utfordrende av flere grunner. I motsetning til solid vev, innfødt lunge parenchyma tendens til å skjule uten ventilasjon og utstillinger lavere vev stivhet. Disse egenskapene hindre kutting av vev. Dermed fylling av luftveiene og alveolar plass med lav-smeltende punkt agarose bevarer den opprinnelige lunge strukturen og gir stivhet nødvendig for presisjonsstyrte kutte kutting av murine og menneskelig lungene30. Menneskelige lunge resectates donert til forskningsformål er i sin natur anatomisk, genetisk og fysiologisk svært variert, dermed ofte presentere en høy Inter pasienten variasjon når utføre eksperimenter25. I motsetning til hele lobe eller hele lunge explants, lunge prøver resected med thorax kirurgi ikke nødvendigvis følger anatomiske segmentene og, derfor krever spesielle forberedelser. I denne artikkelen gir vi en detaljert og optimalisert protokoll for generering av menneskelig PCLS fra resected lungevev og påfølgende dyrking og rekreasjonsbruk til modell lungesykdom.

Protocol

Bruk av menneskelig vev ble godkjent av den etiske komiteen ved Ludwig-Maximillian universitetet [München, Tyskland (prosjektnummeret 455-12)]. Svulsten uten menneskelig lunge resections ble levert av Asklepios Biobank for lungesykdommer (Gauting, Tyskland, prosjektnummer 333-10).

Merk: Alle prosedyrer av menneskelig PCLS produksjon (figur 1) er gjort under sterilt laminær strømning hette.

1. forberedelse av instrumenter og materialer

  1. Forbered alt materiale for inflasjon av lungevev med agarose som beskrevet nedenfor.
    1. Forberede dyrking mediet: Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) F-12 med L-glutamin, HEPES, 10.000 IE Penicillin, 10.000 IE Streptomycin og 0,1% (v/v) fetal bovin serum.
      Merk: Mediet brukes på 37 ° C.
    2. Forberede en steril metallbrettet dekket med papir. Plass en steril 15 cm celle kultur parabol på skuffen.
    3. Fylle celle kultur parabol med 15 mL av dyrking medium.
    4. Utarbeide en 3% (w/v) agarose løsning ved å løse opp riktig mengde lav-smeltende punkt agarose i minst 30 mL av dyrking medium.
    5. Varme løsningen i mikrobølgeovn til koking. Cool agarose løsningen 42 ° C i et vannbad. Holde flytende agarose løsningen lagret i vannbad.
    6. Forbered flere 50 mL konisk rør fylt med flytende agarose.

2. resected lungevev

  1. Lager ny svulst gratis lungevev av lobectomy resectates umiddelbart etter eksisjon i DMEM F-12 medium på 4 ° C til trinn 3.
  2. Ikke overstige kaldt iskemi tid på 4-8 timer før behandling.

3. inspeksjon og rekke Resected vev før Agarose fylling

  1. Løfte vev fra mediet med pinsett. For å unngå skade på vev, spesielt til pleura, håndtere vevet med pinsett på luftveiene bare.
  2. Score vev kvaliteten av kriterier av lunge Agarose fylle Score definert i tabell 1.
  3. Videre til trinn 4 Hvis vevets kvalitet er scoret over eller lik 72. Hvis vevets kvalitet scores under 60, ikke fortsetter videre med agarose fylle.
    Merk: Hvis vev er mellom 60 og 68, agarose-fylling og vev slicing fortsatt kan produsere fornuftige resultater, og en endelig avgjørelse for forlengelse av eksperimentet har gjøres tilfelle til tilfelle. Imidlertid mislykkes lungevev som ikke oppfyller kravene ovenfor nevnte det meste i agarose fylle.

4. lunge vev inflasjon av Agarose fylling

  1. Løfte vev fra lagringsmediet og avløp overskytende media fra vevet. Overføre lungevev til 15 cm kultur parabolen utarbeidet i 1.1.2.
  2. Fyll en 30 mL sprøyte med lav-smeltende punkt agarose fra 1.1.3.
  3. Forberede en perifert venekateter ved å fjerne obturator og knytte den til en 30 mL sprøyte
  4. Identifisere en bronchus (0.5-3 mm i diameter) i vev som er ventilasjon en intakt delen av vev (se figur 2).
  5. Kanyle inn den valgte bronchus (0.5-3 mm i diameter).
  6. Skyv kanyle forsiktig frem så langt som mulig.
  7. Forsegle bronchus rundt kanyle ved å komprimere bronkial veggen rundt kanyle med tang, ideelt clamping noen tilstøtende lungearterien samtidig.
  8. Occlude andre ekstra airways med en kirurgisk klemme å hindre agarose lekker gjennom disse luftveiene.
  9. Løfte vev med tang fra kultur parabolen.
  10. Manuelt hell av agarose med sprøyten ingen raskere enn 0,3 mL/s. Hastigheten på agarose fylle kan variere mellom omtrent 0,05 og 0,3 mL/s på grunn av heterogene motstanden airways og/eller atelectasis.
  11. Hvis høy motstand mens fylling eller agarose lekker fra vevet er observert, prøv hele prosedyren med en annen bronchus fra trinn 4.4. Utføre feilsøking som beskrevet nedenfor.
    Merk: Graden av agarose fylle er svært avhengig av plasseringen av kateter i vevet og dyp gjennomtrenging av kateter resultatene agarose fylle av små membran som regioner (*) av lungevev (figur 2C).
    1. Ved høy motstand, prøv å plassere kateter fører til riktig fylling av de fleste områder av vev (#) (figur 2D).
    2. Som plugger av tidlig befestet agarose i proksimale bronchi eller andre airway hindringer (pil) kan føre til en ufullstendig fylling av vev (figur 2E), ikke Tving agarose fylle som dette kan føre til feil i det fylte området, men ikke i en fylling av hindret vev deler.
    3. Hvis åndedretts treet avledet fra den cannulated bronchus er skadet under resection og agarose fylle resultater i en konstant lekkasje av den flytende agarose (pil i figur 2F), sett kateter i en mer perifere del av luftveiene systemet Fyll en mindre del av vev (*) (figur 2 g). I tillegg forsegle skadet perifere luftveiene med en kirurgisk klemme (pil) (figur 2 H).
  12. Bruke agarose til lungevev er fylt helt. Ikke over økning vevet det kan forårsake irreversibel skade på vev strukturen og celler.
  13. Klemme bronchus som ble brukt for å fylle umiddelbart. Fjerne kanyle før clamping.
  14. Inkuber vevet i kultur middels på 4 ° C i 30 minutter til sikre agarose størkning.
  15. Hvis resected vevet har flere bronkial oppføringer, Gjenta trinn 4.2 til 4.13 til alle deler av vev er fylt med agarose.
  16. Lagre delene agarose fylt lunge vev i 4 ° C kaldt medium til kutting.

5. presisjonsstyrte kutte lunge kutting

  1. Identifisere områder i lungevev som er solid fylt med agarose. Solid fylt regioner skjules ikke når de trykkes forsiktig med pinsett mot bunnen av cellen kultur parabolen.
    1. Avgiftsdirektoratet en 1-1,5 cm3 blokk med områder som er beskrevet i 5.1, mens ene fortsatt skal være dekket med pleura.
  2. Fest hver individuelle vev blokk med pleural side å kontakte eieren av vibratome ved hjelp av en cyanoacrylate lim.
    Merk: Pleura er litt elastisk og derfor hindrer kutte med vibratome blad. Plassert på vev holderen, pleura vil ikke forstyrre skjæring og viktigere, danner en naturlig barriere mellom cyanoacrylate lim og vevets parenchyma muliggjør minimal spredningen av limet.
  3. Skjær lungevev med vibratome med følgende innstillinger: tykkelse: 500 µm, frekvens: 100 Hz, amplituden av kniven: 1,2 mm, forover på bladet av 3-12 µm/s, som avhenger av vev stivhet. Redusere protrusion-hastigheten på bladet hvis SKIVE ikke kuttes riktig, eller hvis vev blokken selv begynner å vibrere.
  4. Forsiktig overføre sektoren ved å løfte det med tang fra vibratome brett i et godt av en 12-vel plate fylt med dyrking medium. Endelig ruge lunge skiver i en inkubator under standard celle kultur forhold.
  5. Stopp kutting når 2-3 mm av vev blokken er igjen unsliced siden cyanoacrylate lim kan ha kompromittert vev integriteten til denne regionen.

6. generasjon PCLS slag

  1. Overføre lunge skiver fra en enkelt brønn til en tom 10 cm rett.
  2. Plassere et 4 mm biopsi puncher ortogonalt til den øvre overflaten av en PCLS og begynne å flytte puncher klokken og mot klokken rotasjoner.
  3. Fylle celle kultur medium i brønnene av en 96-brønns plate. Løfte vev slag med tang og overføre slag i brønnene av en 96-brønns plate. Endelig ruge lunge slag neddykket i medium i 1.1.1. i en celle kultur inkubator under standard betingelser (21% (v/v) oksygen, 5% (v/v) karbondioksid og 95% fuktighet, på 37 ° C).

7. vev kultur og prøve høsting

  1. Kultur PCLS og slag overnatter i en inkubator under standard celle kultur forhold.
  2. Kultur PCLS og slag under disponerte tilstand for maksimum 120 timer etter deres generasjon å sikre mobilnettet levedyktighet og funksjon.
  3. For høsting protein samt RNA, vaske PCLS og slag tre ganger i fosfat bufret saltvann (PBS), overføre dem i cryovials og snapin-fryse i flytende nitrogen.
  4. Eksempel middels nedbryting av kultivert PCLS slag for analyse av utskilles proteiner.
    1. Histologiske analyser, vask PCLS og slag tre ganger med PBS og løse dem med 4% paraformaldehyde ved rugende i 30 min på 37 ° C. Til slutt, lagre PCLS i PBS på 4 ° C for videre nedstrøms flekker.

Representative Results

PCLS generasjon
Generering av PCLS kan deles inn i fire grunnleggende trinn: kirurgisk lunge vev resection agarose fylling, vibratome-baserte PCLS generasjon og kultur PCLS. Kappet lungevev er fylt med lav-smeltende punkt agarose, som legger til nødvendig stivhet i lungevev til kutting og beholder opprinnelig lunge struktur og arkitektur. Av notatet, PCLS generasjon er svært tidkrevende, dermed ofte overnatting lagring av fylt lungevev i DMEM F-12 medium kan inngå som et ekstra trinn og PCLS generasjon er startet på neste dag. Avhengig av følgende eksperimentelle oppsett, kan generert PCLS være ruges overnatting i standard celle kultur medium med 0,1% (w/v) fetal bovin serum, før eksperimentelle forhold brukes. 3D-LTCs var levedyktig og utstilt cellulære funksjoner (for eksempel surfactant protein sekresjon) for opp til 120 h22 i kultur betingelsene beskrevet i denne protokollen (figur 1) og kan optimaliseres ved ytterligere forbedring av.

Agarose fylle
For agarose fylling av vev, en kanyle av en perifert venekateter 1.3 mm diameter knyttet til agarose-fylt sprøyten ble satt inn i en bronchus på overflaten av kuttet vev (figur 2A). Bronchi er ofte lokalisert nær en lungearterien. Mens arteriene har tynnere vegger og tendens til å kollapse, utstilt bronchi en godt synlig lumen. Avhengig av vevets integritet, kan kateter være avansert gjennom flere generasjoner av respiratoriske treet i utkanten av lungene. Gjennomsyret bronchus ble beseglet rundt kanyle ved hjelp av pinsett (figur 2B). Lungearterien kan være festet med pinsett samtidig. Etterpå vevet er løftet opp, og væske agarose er forsiktig innpodet i luftveiene.

Avhengig av plasseringen av kateter, kan et flertall av vev fylles med flytende agarose (figur 2D). Eventuelt kan membran som deler av lungevev, som gjenspeiler lungenes parenchyma ventilert av gjennomsyret bronchus, bli fylt med agarose (figur 2C). Et karakteristisk mønster av solid fylt vev regioner kan observeres i begge scenariene: først, en stor del av vev fylles kiler (figur 2D), eller andre mindre stikker rundt områdene grundig fylt vev områder vises ( Figur 2C). Hvis deler av luftveiene hindre på grunn av agarose clots eller andre årsaker, kan deler av vev ikke være riktig fylt med agarose. Dermed kan bare deler av vev være relevant for kutting. Ved lekkasjer under agarose fylle prosedyre, deler av fylt åndedretts treet kanskje bli perforert og fylling av lungevev blir nesten umulig men, mulige løsninger inkluderer fylling via en mer perifere bronchus, en dypere gjennomtrengning av kanyle i distale luftveiene (figur 2 g) eller potensielle fastklemming av lekkasje området (figur 2 H).

Presisjonsstyrte kutte lunge kutting
Vev blokker på en lengde og bredde på 1-1,5 cm ble fjernet fra vev regioner, som var helt fylt med befestet agarose ((figur 3A)-3B). Neste, personlige vev blokkene var limt på vev innehaver av vibratome (Figur 3 c). 500 µm tykk PCLS ble generert, mens vev blokken på vibratome rykket frem med hastigheter mellom 3-12 µm/s. (figur 3D-3F). Endelig var PCLS neddykket i celle kultur medium med 0,1% (w/v) fetal bovin serum og kultivert på standard celle kultur forhold, som beskrevet trinn 7.

Eksperimentell readouts av menneskelig 3D-LTC etter 48 timer av dyrking
En representant immunofluorescence flekker, som tidligere beskrevet av Alsafadi et al.25, er vist i figur 4A-4 C. Immunolabeling fibronectin (rød) og celle kjerner (DAPI, blå), tillatt for avbilding av bevarte alveolar strukturen i den menneskelige 3D-LTC ex vivo. Behandling av menneskelige PCLS slag med en profibrotic cytokin cocktail (inkludert transformere vekstfaktor beta 1, Platederivert avledet vekstfaktor AB, lipophosphatidyl syre og tumor nekrose faktor alpha) for 48t resultert i fibrose-lignende endringer i menneskelige 3D-LTCs. Av qPCR, ble en betydelig induksjon av fibrose relevante ekstracellulær matrix komponenter kollagen type 1 og fibronectin gener i 3D-LTC slag observert på behandling med profibrotic cocktail (Figur 4 d). I tillegg fant protein nivåer av mesenchymal markør vimentin upregulated i 3 av 4 pasienter etter behandling av 3D-LTC slag (figur 4E).

Figure 1
Figur 1: arbeidsflyten av PCLS generasjon. Svulst-fri områder av lunge resections er grundig inspisert på grunn av deres vev integritet. Hvis vevet er scoret egnet for videre bruk (scoring er forklart i detalj under materiale og metoder), den neste er fylt med flytende agarose. Vev blokker fylt med befestet agarose er senere skiver med en vibratome. Neddykket i celle kultur medium, er 3D-LTC kultivert til 120 h etter deres generasjon. Nedstrøms analyser av 3D-LTCs innebære protein - eller RNA-uttrykk, live-vev fluorescens imaging, samt immunofluorescence flekker etter fiksering av vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: fylle lungevev med lav-smeltende punkt agarose. Lungevev er cannulated med en perifert venekateter som settes inn i en bronchus ved lungearterien (figur 2A). Pinsett brukes til å korrigere kanyle i bronchus og klemme lungearterien for å unngå lekkasje av flytende agarose. Flytende agarose på 42 ° C helles i lungevev med en 30 mL sprøyte (figur 2B). En distale posisjonering av kanyle under fylling vil resultere i små områder av fylt vev (figur 2C), mens proksimale posisjonering vil sikre fylling av en større vev volum (figur 2D). Eventuelle hindringer i luftveiene vil redusere mengden av vev volum som kan være fylt (figur 2E). Ved agarose lekker, en distale kanyle plassering og/eller fastklemming av lekkasje siden gjør riktig agarose fylling av lungevev ()figur 2F-2 H). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: presisjonsstyrte kutte lunge kutting. En vellykket agarose-fylt lungevev brukes til å avgiftsdirektoratet et stykke en vev blokk (1 cm x 1,5 cm x 1 cm) med en skalpell (figur 3A). Neste forbrukeravgift vev blokken er limt til vev holderen, skala bar angir 1 cm (figur 3B). Helst er vevet limt med pleural overflaten på overflaten av vev holderen som vist i Figur 3 c. 500 µm tykke skiver er kuttet av i vibratome med en safir kniv i en 10° - 15° vinkel i forhold til vevet (figur 3D og 3E). Kutte prosedyren resultater i 2-3 cm3 store intakt lunge skiver, skala bar = 5 mm (figur 3F). I tillegg bruker en biopsi puncher, kan liten reproduserbar slag med en diameter på 4 mm genereres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: eksperimentell readouts av menneskelig 3D-LTCs etter 48h kultur. Et menneskelig 3D-LTC slag av 4 mm diameter var immunostained for fibronectin (i rødt) og DAPI (i blått) ((figur 4A-4C)). Skalere barer = 1000 µm. figur 4C viser det sammenslåtte bildet. RNA analyse av PCLS av kvantitative RT PCR viser betydelig økning av COL1A1 og FN1 genuttrykk av profibrotic cocktail25. Figur 4E viser en immunoblot av hele protein lysates av PCLS, som ble behandlet med en fibrotiske cocktail25. Leter etter Vimentin og β-utgangen demonstrert økt protein uttrykk for mesenchymal markøren (vimentin) etter behandling med profibrotic faktorer i pasientprøvene 1, 3 og 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Kriterium Poeng
Vevsprøve har intakt pleural overflate. 20
Vevsprøve synes macroscopically intakt, mangler snittene squashing, brudd og forvrengninger. 20
Vevsprøve inneholder minst én bronchus med en diameter > 1mm. 20
Vevsprøve inneholder ingen eller bare lite beløp av blod. 4
Vev prøven ble lagret fullt i middels og viser ingen åpenbare tegn til atelectasis. 4
Vevsprøve ble kappet pga i de siste fire timene. 4
Vev prøven er større enn 5cm i diameter største. 4
Resultat i sum:

Tabell 1: lunge Agarose fylle Score. Lunge Agarose fylle Score (LAFS) samsvarer med suksessrate å fylle en vev resection med agarose for sin senere vibratome-baserte PCLS produksjon. Poengsummen oppsummerer alle punkter av kriteriene oppfylt av vev. En LAFS lik eller over 72 spår god agarose dekkevne, en score under 60 spår en svært sannsynlig svikt i agarose fylling av vev.

Discussion

Protokollen beskrevet i dette manuskriptet dekker generasjonen av PCLS fra menneskelige lunge vev resectates ved å fylle den med flytende agarose og senere vibratome slicing. Generasjon av vev skiver var vist før et par organer, som lever og hjernen, mens iboende stivhet av disse organene tillatt direkte kutting uten endringer av vev. Av notatet er den første riktige forberedelsen av lungevev det mest avgjørende skrittet i å generere PCLS. Agarose fylling av lunge er metoden for valg å stabilisere sin myke og elastiske natur, og å sikre en homogen og reproduserbar PCLS generasjon. Store luftveiene resected lungevev er cannulated for å gi tilgang til små luftveiene og intakt lunge parenchyma. Mangel på en intakt pleura, som gjør agarose fylle nesten umulig, er en viktig grunn til hvorfor lungevev er stort sett ikke anvendelig for lunge kutting. Prospektivt, kan en syntetisk pleura opprinnelig utviklet for å utføre funksjonelle eksperimenter på decellularized stillaser potensielt brukes for å oppnå vellykket agarose fylling av explants som mangler en intakt pleura31. Resections resulterer i en menneskelig lunge vev stykke med intakt pleura er avgjørende for å generere vev blokker til kutting. Kappet vev er mer tilgjengelig på grunn av svulsten uten vev fra kreft resections enn fullt intakt lobes eller hele-lung explants av pasienter som gjennomgikk lungetransplantasjon.

Vanligvis to systemer brukes til å produsere PCLS: Krumdieck vev slicer15 og vibrerende mikrotomer (vibratomes). Vev slicere generere skiver av passerer en vev-blokk gjennom et metall fartøy, som skjærer PCLS ved 90° på slutten av fartøyet. Vibratomes genererer PCLS ved å flytte en vibrerende kniv vannrett over en forankret blokk av vev som er neddykket i en avkjølt middels bad, som sammenlignet med Krumdieck sliceren utøver mindre skjær makt på vevet. Dette resulterer i mindre hard behandling av vevet før dyrking. På den annen side, er vibratome kutte mer tid og arbeid forbruker. I våre hender, vibratome kutting aktivert produksjonen av maksimalt 100 PCLS eller 500 PCLS slag på en dag, tilstrekkelig for mest eksperimentelle studier. PCLS kan kultivert på ulike måter: (a) knyttet til Trans-brønner, dermed generere et flytende air-grensesnitt (ALI) system, (b) som dynamisk orgel kultur (DOC), eller (c) neddykket i celle kultur medium på standard celle kultur forhold. I detalj dyrking av PCLS ble beskrevet tidligere22,23,25; en felles standard av dyrking forhold mellom deres bruk i ulike labs verden er imidlertid fremdeles mangler. Spesielt kultur tiden kan være kritisk: som murine PCLS, tap av SFTPC positive alveolar type 2 celler er observert etter 144 h, men ikke etter 120 h22. I tillegg synes metabolsk aktivitet å være stabil i murine22 og menneskelig PCLS25 for 120 timer.

Det er et par av tekniske begrensninger for generering av PCLS: antall og størrelsen på resectates varierer over tid; effektiviteten av agarose fyller, som avhenger av tilstedeværelsen av intakt pleura i innhentet vevet, bestemmer den endelige suksessen av PCLS generasjon; og vev skyldes patologiske forandringer i innhentet (syke) lungevev kan forstyrre PCLS utarbeidelse. Airway hindringer og fibrotiske vev mangler intakt alveolar plass hindre med agarose fylle og dermed gjøre slicing av fibrotiske vev en krevende oppgave. Emphysematous vev som finnes i sykdommer som COPD eller alfa-1-anti-trypsin mangel ikke kan motstå presset av agarose fylle, og vil medføre brudd alveoler og arkitektoniske gjenstander. I disse tilfellene, kan bruk av lav agarose konsentrasjon, f.eks, 1% (w/v), være nyttig til å redusere trykket og hastighet under agarose fylling. Samlet kan sykdom delstaten vevet dramatisk begrense bruken av vev for PCLS generasjon. Alle disse parametrene bestemme mengden av PCLS som kan genereres fra lungevev, og også hvor lang tid det tar for å produsere PCLS. Ytterligere er begrensninger i PCLS uoverensstemmelser mellom ulike lunge skiver med hensyn til størrelse eller vev innhold, som krever ytterligere normalisering trinnene for eksperimenter. For å overvinne dette, kan biopsi slag av lignende regioner i samme stykke genereres. Denne fremgangsmåten er tilbøyelig til å redusere vev variasjon, og som en ekstra fordel, øke antall PCLS utdrag som kan brukes i eksperimenter.

Avslutningsvis menneskelige 3D lunge vev kulturer fra agarose fylt PCLS gi en kompleks menneskelige modellen for å studere lunge fysiologi og sykdommer. Protokollen gir en detaljert beskrivelse av utarbeidelse av PCLS fra resected lungevev og deres dyrking og videre løser utfordringer i agarose fylling av menneskelig lunge resections og hvor å overvinne dem.

Disclosures

Alle forfattere erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlig til Marisa Neumann for ekspert teknisk assistanse. Alle lunge vev var vennlige gitt av CPC-M Bio-arkivet. Dette arbeidet ble støttet av tysk midten av lunge forskning (DZL), Helmholtz Association og CPC forskning skole tilskudd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Hyrax V50 Zeiss -
Hyrax CU 65 Zeiss -
Vasofix Braunüle 18 G B. Braun Melsungen AG 4268130B
30 mL NORM-INJECT Henke Sass Wolf 4830001000
Guarded disposable scalpels, sterile Swann-Morton
Loctite 406 Henkel LOCTITE 406
Synthetic Single Crystal Sapphire Delaware Diamond Knives -
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES Gibco 31330-038
Penicillin Streptomycin Gibco by Life Technologies 15070-063
Special process fetal bovine serum (Sera Plus) Pan Biotech P30-3702
Disposable Biopsy Punch pfm medical 48401
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile Falcon / Corning 353219
Agarose, low geling temperature Sigma A9414-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
  2. Rosenberg, S. R., Kalhan, R., Mannino, D. M. Epidemiology of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Prevalence, Morbidity, Mortality, and Risk Factors. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine Med. 36 (4), 457-469 (2015).
  3. Hekking, P. P., et al. The prevalence of severe refractory asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (4), 896-902 (2015).
  4. Woodard, G. A., Jones, K. D., Jablons, D. M. Lung Cancer Staging and Prognosis. Cancer Treatment and Research. 170, 47-75 (2016).
  5. Ley, B., Collard, H. R., King, T. E. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 183 (4), 431-440 (2011).
  6. Burgstaller, G., et al. The instructive extracellular matrix of the lung: basic composition and alterations in chronic lung disease. European Respiratory Journal. 50 (1), (2017).
  7. Degryse, A. L., Lawson, W. E. Progress toward improving animal models for idiopathic pulmonary fibrosis. The American Journal of the Medical Sciences. 341 (6), 444-449 (2011).
  8. Fricker, M., Deane, A., Hansbro, P. M. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 9 (6), 629-645 (2014).
  9. Sagar, S., Akbarshahi, H., Uller, L. Translational value of animal models of asthma: Challenges and promises. European Journal of Pharmacology. 759, 272-277 (2015).
  10. Williamson, J. D., Sadofsky, L. R., Hart, S. P. The pathogenesis of bleomycin-induced lung injury in animals and its applicability to human idiopathic pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 41 (2), 57-73 (2015).
  11. Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of beta2-adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
  12. Skronska-Wasek, W., et al. Reduced Frizzled Receptor 4 Expression Prevents WNT/beta-Catenin-driven Alveolar Lung Repair in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 196 (2), 172-185 (2017).
  13. Lehmann, M., et al. Senolytic drugs target alveolar epithelial cell function and attenuate experimental lung fibrosis ex vivo. European Respiratory Journal. 50 (2), (2017).
  14. Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
  15. Ebsen, M., et al. Infection of murine precision cut lung slices (PCLS) with respiratory syncytial virus (RSV) and chlamydophila pneumoniae using the Krumdieck technique. Pathology - Research and Practice. 198 (11), 747-753 (2002).
  16. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  17. Royce, S. G., et al. Airway Remodeling and Hyperreactivity in a Model of Bronchopulmonary Dysplasia and Their Modulation by IL-1 Receptor Antagonist. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (6), 858-868 (2016).
  18. Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 309 (10), L1219-L1228 (2015).
  19. Zscheppang, K., et al. Human Pulmonary 3D Models For Translational Research. Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).
  20. Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Human & Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
  21. Wang, L., et al. Differences between Mice and Humans in Regulation and the Molecular Network of Collagen, Type III, Alpha-1 at the Gene Expression Level: Obstacles that Translational Research Must Overcome. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 15031-15056 (2015).
  22. Uhl, F. E., et al. Preclinical validation and imaging of Wnt-induced repair in human 3D lung tissue cultures. European Respiratory Journal. 46 (4), 1150-1166 (2015).
  23. Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicology and Applied Pharmacology. 246 (3), 107-115 (2010).
  24. Banerjee, A., et al. Trichostatin A abrogates airway constriction, but not inflammation, in murine and human asthma models. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 132-138 (2012).
  25. Alsafadi, H. N., et al. An ex vivo model to induce early fibrosis-like changes in human precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), L896-L902 (2017).
  26. Westra, I. M., Oosterhuis, D., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut liver slices as a model for the early onset of liver fibrosis to test antifibrotic drugs. Toxicology and Applied Pharmacology. 274 (2), 328-338 (2014).
  27. Vatakuti, S., Schoonen, W. G., Elferink, M. L., Groothuis, G. M., Olinga, P. Acute toxicity of CCl4 but not of paracetamol induces a transcriptomic signature of fibrosis in precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 29 (5), 1012-1020 (2015).
  28. Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Disease Models & Mechanisms. 8 (10), 1227-1236 (2015).
  29. Li, M., de Graaf, I. A., Groothuis, G. M. Precision-cut intestinal slices: alternative model for drug transport, metabolism, and toxicology research. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (2), 175-190 (2016).
  30. Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
  31. Wagner, D. E., et al. Design and Synthesis of an Artificial Pulmonary Pleura for High Throughput Studies in Acellular Human Lungs. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 184-195 (2014).

Tags

Medisin problemet 144 3D vev kultur ex-vivo vev kultur presisjonsstyrte kutte lunge skiver PCLS 3D-LTCs lungesykdom sykdom dyremodeller menneskelige ex-vivo modeller lunge fibrosis
Generasjon av menneskelig 3D lungevev kulturer (3D-LTCs) for sykdom modellering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gerckens, M., Alsafadi, H. N.,… More

Gerckens, M., Alsafadi, H. N., Wagner, D. E., Lindner, M., Burgstaller, G., Königshoff, M. Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling. J. Vis. Exp. (144), e58437, doi:10.3791/58437 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter