Summary
هنا يمكننا وصف بروتوكول لتوليد نانوليبوسوميس الأيوني، الذي يستند إلى الأسلوب الجاف-الفيلم ويمكن استخدامها الآمنة وتقديم كفاءة في المختبر نسخها رسول الجيش الملكي النيبالي.
Abstract
وضع الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً)-على أساس المداواة لعلاج الأمراض المختلفة أصبح أكثر وأكثر أهمية بسبب الإيجابية خصائص في المختبر نسخها مرناً (IVT). مع المساعدة من IVT مرناً، يمكن أن يتسبب حيثياته تخليق البروتين المطلوب دون تغيير الحالة الفسيولوجية للخلية الهدف. وعلاوة على ذلك، يمكن التحكم تخليق البروتين الحيوي بدقة نظراً لتأثير عابر من IVT مرناً.
تعداء كفاءة للخلايا، نانوليبوسوميس (نلبس) قد تمثل وسيلة إيصال آمنة وفعالة مرناً العلاجية. تصف هذه الدراسة وضع بروتوكول لتوليد آمنة وفعالة الموجبة نلبس تتألف من DC-الكوليسترول و 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (منشطات) كوسيلة إيصال مرناً IVT. نلبس بعد من معرفة حجم، توزيعاً متجانساً، وقدرة كومبليكسيشن عالية، ويمكن أن تنتج باستخدام الأسلوب الجاف-فيلم. وعلاوة على ذلك، نقدم نظم اختبار مختلفة لتحليل ما كومبليكسيشن وزيادة بلغت تعداء الاصطناعية باستخدام البروتينات الفلورية الخضراء (اجفب) مرناً، فضلا عن تأثيرها على بقاء الخلية. إجمالاً، ينص البروتوكول على عرض نهج فعالة وآمنة complexation مرناً، التي قد تقدم وتحسين الإدارة مرناً العلاجية.
Introduction
استخدام مرناً معدلة للتطبيقات العلاجية أظهرت إمكانات كبيرة في العامين الماضيين. في أمراض القلب والأوعية الدموية، والالتهابات، ومونوجينيتيك، وكذلك في تطوير اللقاحات، مرناً هو وكيل علاجية واعدة1.
العلاج استبدال البروتين مع مرناً يوفر العديد من المزايا على مدى العلاج الجيني الكلاسيكية، التي تستند إلى تعداء الحمض النووي في الخلايا الهدف2. يبدأ الدالة مرناً في مباشرة سيتوسول. على الرغم من أن بلازميد الحمض النووي (بدنا)، بنية مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل، والتعميم الحمض النووي الذي يحتوي على منطقة مروج وتسلسل جينات ترميز البروتين العلاجي3، أيضا من أعمال في سيتوسول، يمكن فقط إدراجها في الخلايا التي تسير من خلال الانقسام في وقت تعداء. وهذا يقلل عدد transfected الخلايا في الأنسجة1،4. على وجه التحديد، هو تعداء للأنسجة مع النشاط الانقسام ضعيفة، مثل خلايا القلب، صعوبة5. على النقيض من بدنا، تحدث تعداء وترجمة مرناً في الخلايا الانقسامية وغير الانقسامية في1،الأنسجة6. قد يأتي اندماج الحمض النووي الفيروسي في جينوم المضيف مع تأثيرات مطفرة أو ردود فعل المناعة7،8، ولكن بعد تعداء الخلايا التي تحتوي على ترميز البروتين مرناً، نوفو دي تخليق البروتين المطلوب يبدأ مستقلة9،10. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل تخليق البروتين تحديداً إلى الحاجة للمريض عن طريق الجرعات الفردية، دون التدخل في الجينوم والمخاطرة بتأثيرات مطفرة11. يمكن خفض إمكانات تنشيط المناعة مرناً ولدت صناعيا هائلا باستخدام أردين الزائفة و 5 '-ميثيلسيتيديني بدلاً من أردين وسيتيديني12. أردين الزائفة كما تبين مرناً معدلة زيادة استقرار البيولوجي وأعلى بكثير قدرات متعدية الجنسيات13.
لتكون قادرة على الاستفادة من خصائص الواعدة للعلاج على أساس مرناً في التطبيقات السريرية، من الضروري إنشاء أداة مناسبة لنقل مرناً في الخلية. يجب أن تحمل خصائص غير سامة في المختبر و في فيفوهذه المركبات وحماية مرناً ضد تدهور نوكلاس وتوفر امتصاص الخلوية كافية لتوافر المطول والترجمة مرناً14.
من بين جميع أنواع الناقل المحتملة في فيفو تسليم المخدرات، مثل الأنابيب النانوية الكربونية، ونقاط الكم، والدهنية، هذا الأخير قد تم درس أكثر من15،16. الدهنية حويصلات تتألف من بلير الدهن10. وهم أمفيفيليك مع مسعور ومقطع ماء، ومن خلال هذا الترتيب الذاتي لهذه الجزيئات، طبقة مزدوجة كروية شكلت17. داخل الدهنية، العوامل العلاجية أو المخدرات يمكن تغليف و، وبالتالي، محمية من تدهور الانزيمية18. الدهنية التي تحتوي على N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium كلوريد (دوتما)19، [1، 2-مكررا (أوليويلوكسي)-3-البروبان (تريميثيلامونيو)] (دوتاب)20، و21من ديوكتاديسيلاميدوجليسيلسبيرميني (الكلاب)، أو الكولسترول DC-22، تتميز جيدا وكثيراً ما تستخدم تعداء الخلوية مع الحمض النووي الريبي أو.
وتتألف الدهنية الموجبة دهن مشحونة بشكل إيجابي ودون توجيه تهمة إليه فسفوليبيد23. تعداء عبر الدهنية الموجبة واحد من الأساليب الأكثر شيوعاً لنقل الأحماض النووية في الخلايا24،25. تشكل جزيئات الدهن الموجبة المجمعات مع مجموعات الفوسفات مشحونة سلبا في العمود الفقري ل جزيئات الحمض النووي26. هذه ليبوبليكسيس ما يسمى نعلق على سطح غشاء الخلية وإدخال الخلية عن طريق الالتقام أو الالتقام-مثل-آليات27.
في عام 1989، مالون وآخرون. ووصف بنجاح الموجبة الدهون بوساطة مرناً تعداء28. ومع ذلك، باستخدام خليط من دوتما و 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (المخدر)، وجد الفريق أن دوتما تتجلى الآثار السامة للخلايا28. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت زهرة et al. أن دوتاب (1، 2-ديوليويلوكسي-3-تريميثيلامونيوم-البروبان كلوريد) يمكن أن تستخدم ككاشف تعداء مرناً29. ومع ذلك، تعداء كفاءة للخلايا، ينبغي استخدام دوتاب في تركيبة مع الكواشف الأخرى، مثل فيبرونيكتين29 أو30من المخدر. وحتى الآن، كان دوتما الدهون الموجبة الأولى في السوق المستخدمة ل توصيل الجينات31. الدهون الأخرى تستخدم كناقلات العلاجية أو يجري اختبارها في مراحل مختلفة من التجارب السريرية، (مثلاً، اندوتاج-الأول، الذي يحتوي على دوتاب كناقل دهن)، ويجري التحقيق حاليا في مرحلة الثانية لمحاكمة سريرية32.
يصف هذا العمل وضع بروتوكول لتوليد نلبس المحتوية على DC-الكوليسترول ومخدر. من السهل القيام بهذا الأسلوب ويسمح لتوليد نلبس ذات أحجام مختلفة. الهدف العام لتوليد البرمجة اللغوية العصبية باستخدام الأسلوب الجاف-فيلم إنشاء الدهنية ل complexation مرناً، مما يتيح تعداء خلية فعالة ومتوافق حيويا في المختبر14،33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-جيل نانوليبوسوميس الأيوني (الشكل 1)
- تذوب الدهون DC-الكوليسترول في الدم (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-كاربامويل] الكوليسترول هيدروكلوريد) ومنشطات (ديوليويل فوسفاتيديليثانولاميني)، تسليم كمسحوق، في كلوروفورم لتحقيق تركيز نهائي 25 ملغ/مل.
ملاحظة: تخزين الدهون المذابة في-20 درجة مئوية. - العمل مع حل الأسهم 25 ملغ/مل من الدهون على حد سواء. 40 مزيج ميليلتر المذاب DC-الكوليسترول وميليلتر 80 من المخدر المذابة في قارورة زجاج.
ملاحظة: كمية الدهون الإجمالية 3 ملغ. لتجنب التبخر السريع كلوروفورم، ضع الدهون على الجليد خلال بيبيتينج. - تبخير كلوروفورم لمدة 15 دقيقة تحت تدفق غاز أرجون. في وقت لاحق، ملء مجفف مع هلام السليكا، ضع قارورة زجاجية مفتوحة داخل، وتطبيق فراغ بين عشية وضحاها للتأكد من أن يتبخر كلوروفورم المتبقية، ويتم تشكيل فيلم دهن داخل قارورة زجاجية.
ملاحظة: العمل بسرعة، وتجنب الاتصال2 س لا لزوم لها. - ترطيب الفيلم شكلت المادة الدهنية مع 1 مل من المياه خالية من نوكلاس ودوامه تعليق لمدة 15 دقيقة (الشكل 2A). بعد ذلك، ضع التعليق في حمام سونيكيشن ح 1 (الشكل 2).
ملاحظة: سيتم التعليق غائم قليلاً. - تجميع الطارد ميني وفقا لإرشادات الشركة المصنعة وملء المحاقن مع تعليق المادة الدهنية ومكان المحاقن شغلها وحقنه فارغة على كلا الجانبين الطارد. اضغط على تعليق المادة الدهنية عبر الغشاء من حقنه واحدة إلى أخرى، 20 x-x 25، لقذف التعليق (الشكل 2).
ملاحظة: يتم تحديد الحجم نلبس من الغشاء الذي يستخدم حجم المسام. - تخزين نلبس في قارورة زجاج في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
ملاحظة: بعد التخزين فترات طويلة من الزمن، نلبس توضع في حمام سونيكاتيون مرة أخرى لمدة 15 دقيقة قبل 35 كيلو هرتز إلى الالتفاف حول تشكيل معقدة.
2-النسخ في المختبر مرناً الاصطناعية
- إعداد اجفب-ترميز نشرت مرناً بعد البروتوكول السابق34.
- تضخيم تسلسل اجفب من بلازميد مع 0.7 ميكرومتر قدما (5 '--وافق به GAC CCT CGT هيئة مكافحة الفساد جا بنا صرفة ACG-3') وعكس (5 'تي120 "ضريبة تحويل العملة"ضريبة تحويل العملة قانون كاج بنا نقل واكتساب التكنولوجيا عقاري AAA GAC CA-3') الإشعال وبوليميريز طقم مع بكر.
- مزيج 20 ميليلتر الحل التجاري العازلة مما يؤدي إلى تغيير في سلوك ذوبان الحمض النووي (جدول المواد)، فضلا عن 20 ميليلتر من مزيج 5 x من مجموعة بوليميراز. إضافة 7 ميليلتر من كل التمهيدي (الأمامية والعكسية).
- إضافة 25 نانوغرام بلازميد اجفب إلى الخليط و 2 ميليلتر من بوليميريز من مجموعة بوليميراز.
ملاحظة: الاحتفاظ بوليميراز على الجليد قبل بيبيتينج أنه في حل. - إضافة خالية نوكلاس ح2س إلى الخليط، تصل إلى حجم 100 ميليلتر.
- تشغيل دورات PCR في ثيرموسيكلير بعد على البروتوكول في الجدول 1.
- تنقية تسلسل الحمض النووي اجفب-ترميز مع مجموعة أدوات تنقية PCR.
- ولذلك، مزيج PCR الحل مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم من الطقم واستخدامها لملء الأعمدة تنقية.
- الطرد المركزي الأعمدة بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة وتجاهل في فيلتراتي.
- إضافة 750 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي الأول للعمود، مرة أخرى في الحد الأقصى للطرد المركزي بسرعة لمدة 1 دقيقة، وتجاهل filtrate.
- كرر الخطوة الطرد المركزي 1 x لإزالة المخزن المؤقت من عامل تصفية العمود.
- نقل العمود إلى أنبوب 1.5 مل طازجة.
- إضافة 20 ميليلتر من خالية نوكلاس ح2س إلى العمود واحتضان 1 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة بأقصى سرعة ممكنة. كرر هذه الخطوة.
- قياس تركيز الحمض النووي مع شحني وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- إجراء تحليلات نوعية الحمض النووي استخدام هلام التفريد. إضافة 0.5 غرام من [اغروس] في المخزن المؤقت تريس-بورات-يدتا (TBE) وتسخَّن في الميكروويف على حرارة عالية حتى يذوب تماما [اغروس].
- إضافة 5 ميليلتر لتلطيخ جل الحل للسائل [اغروس] وملء الحل إلى غرفة جل وانتظر حتى يتم بلمرة الهلام.
- ميكس 200 نانوغرام من الحمض النووي مع 2 ميليلتر من 6 × تحميل صبغ والتعبئة أنها تصل إلى وحدة تخزين نهاية من 12 ميليلتر. "الماصة؛" سلم الحمض النووي، فضلا عن عينات الحمض النووي، في جل الآبار وتشغيل التفريد ح 1 في 100 V.
- تحليل هلام استخدام محطة تحليل جل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
- تشغيل النسخ في المختبر لتوليد مرناً من تسلسل الحمض النووي مع مجموعة في المختبر نسخ مواد تتضمن T7-بوليميريز واستبدال النيوكليوتيدات معدلة UTP والأداء النظري المركب مع Ψ UTP و CTP الميثيل.
- للنسخ في المختبر ، مزيج من المكونات التالية في الجدول 2.
ملاحظة: استبدال 1.5 ميليلتر من الميثيل-CTP مع 01:10 Cy3-CTP المخفف في خالية من نوكلياسي ح2س أثناء النسخ في المختبر من اجفب مرناً لتحقيق وضع العلامات Cy3 من مرناً. - احتضان هذا المزيج IVT رد فعل ح 4 في 37 درجة مئوية.
- أضف 1 ميليلتر من الدناز أنا من بوليميريز T7 كيت واحتضان عليه لمدة 15 دقيقة قبل 37 درجة مئوية لهضم الدنا القالب.
- للنسخ في المختبر ، مزيج من المكونات التالية في الجدول 2.
- لتنقية مرناً، استخدم مجموعة أدوات تنظيف الجيش الملكي النيبالي.
- تملأ مزيج IVT لحجم 100 ميليلتر مع خالية نوكلاس ح2o.
- إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
- إضافة 250 ميليلتر من الإيثانول 100% ويخلط مرة أخرى. "الماصة؛" هذا المزيج في أعمدة تنظيف.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ق مبلغ 000 8 × ز وتجاهل فيلتراتي.
- إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت الغسيل إلى عمود، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 15 ثانية بواقع 000 8 × ز، وإزالة فيلتراتي.
- أغسل العمود 1 x مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي وجهاز الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في س 8,000 ز.
- نقل العمود إلى أنبوب جديد 1.5 مل رد. الوت مرناً 2 x بحضانة 1-دقيقة 20 ميليلتر من ح نوكلاس خالية2س على الغشاء العمود، متبوعاً الطرد المركزي 1-دقيقة بأقصى سرعة ممكنة.
- قم بإزالة مجموعات الفوسفات من مرناً باستخدام مجموعة ديفوسفوريليشن. إضافة ميليلتر 4.5 x 10 الفوسفاتيز المخزن المؤقت و 1 ميليلتر من الفوسفاتيز إلى مرناً واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية.
- تنقية مرناً مرة أخرى، في أعقاب الخطوات 2.5.1-2.5.7.
- قياس التوافق مرناً مع شحني.
- استخدم جل التفريد لتحليل النقاء وحجم مرناً. ولذلك، تعد [اغروس] هلام كما هو موضح في الخطوات 2.3.9-2.3.10.
- ميليلتر 3.3 مزيج من ميثلامين، 1 ميليلتر من 37% فورمالدهيد، 1 ميليلتر من 10 x الرجال، و 1.7 ميليلتر من 6 × تحميل صبغ مع 200 نانوغرام مرناً وملء ما يصل إلى 10 ميليلتر مع خالية نوكلاس ح2س لكل عينة وعلامة الجيش الملكي النيبالي.
- احتضان هذا المزيج لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية تمسخ مرناً. تحميل الآبار جل مع مرناً وعلامة الجيش الملكي النيبالي وتشغيل الهلام ح 1 في 100 V.
- تحليل الجل باستخدام محطة دوك هلام مع الأشعة فوق البنفسجية.
3-كومبليكسيشن مرناً الاصطناعية
- ذوبان الجليد مرناً الاصطناعية على الجليد، ودوامه، وقبل وقت قصير من افتتاح الأنبوب للطرد المركزي.
- ميكس 10 ميليلتر من مرناً الاصطناعية (تركيز مرناً 100 نانوغرام/ميليلتر) مع 1 ميليلتر أو ميليلتر 2.5، 5 ميليلتر، ميليلتر 10 أو 20 ميليلتر من تعليق البرمجة اللغوية العصبية (تركيز البرمجة اللغوية العصبية 3 مغ/مل). الطرد المركزي بإيجاز واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لتشكيل نانوليبوبليكس.
ملاحظة: لا تخلط بيبيتينج. وهذا يمكن أن يؤدي إلى فقدان وحدة التخزين. دوامة قريبا لخلط دقيق. - أضف 1 مل من الخلية العادية المتوسطة إلى نانوليبوبليكسيس ومزجها بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
4-تحليل كفاءة تغليف نانوليبوسوميس
- للقيام بتجارب التغليف، استخدام أدوات القياس الكمي الجيش الملكي النيبالي.
- إعداد الحل العامل بتمييع صبغة فلورسنت 1: 200 لمجموعة السامي، و 1:2,000 مقايسة منخفضة-مجموعة.
ملاحظة: ذوبان الجليد صبغة الفلورسنت على الجليد. إعداد الحل العامل مباشرة قبل الاستخدام. - إعداد المنحنيات القياسية مجموعة عالية ومنخفضة-نطاق استخدام 1 مل حل الأسهم 2 ميكروغرام/مل من اجفب مرناً في خالية نوكلاس ح2o.
ملاحظة: للمنحنيات القياسية، استخدم مرناً التي سيتم استخدامها في التجارب التغليف. - استخدام الجدول 3 لإعداد مجموعة عالية المعيار (20 نانوغرام/ملليلتر-1 ميكروغرام/مل).
- للمعيار النطاق المنخفض، وتمييع اجفب 2 ميكروغرام/مل مرناً حل الأسهم 01:20 لتحقيق تركيز نهائي من 100 نانوغرام/مليلتر. إعداد معيار النطاق منخفض (1 نانوغرام/ملليلتر-50 نانوغرام/مل) كما هو موضح في الجدول 4.
- الجمع بين 1 ميكروغرام من اجفب مرناً (10 ميليلتر) و 7.5 ميكروغرام نلبس (2.5 ميليلتر) واحتضانها لمدة 20 دقيقة في الرايت
ملاحظة: يبقى مرناً على الجليد لتجنب تدهور. - إضافة 1 مل من خالية نوكلاس ح2س بشكل نانوليبوبليكسيس ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
- أضف 1 مل من محلول العامل 1: 200 أو 1:2,000 صبغة الفلورسنت على الحمض النووي الريبي لعينات مغلفة والمعايير، واحتضان لمدة 5 دقائق في RT في الظلام.
- "الماصة؛" المعايير وعينات في التكرارات في لوحة سوداء 96-جيدا وقياس fluorescence في 530 نانومتر على قارئ ميكروسكوبية (الشكل 3).
5-إعداد الخلايا تعداء
- لوحة 1.5 × 105 من لوحة كذلك 12 د 1 قبل تعداء A549 الخلايا/جيدا.
- احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في الخلية العادية المتوسطة (الجلوكوز دميم/عالية مع 10% الجنيني البقري المصل [FBS]، 2 مم ل الجلوتامين، 1% البنسلين/ستربتوميسين) عن 24 ساعة قبل تعداء.
6-تعداء الخلايا
- أغسل الذي أعد الخلايا س 1 مع 1 مل/بئر PBS (دون Ca2 +/Mg2 +).
- أضف 1 مل خليط نانوليبوبليكس المعدة، يحتوي على 1 ميكروغرام من اجفب مرناً مغلفة في 1 ميليلتر أو ميليلتر 2.5 أو 5 ميليلتر، 10 ميليلتر أو نلبس 20-ميليلتر، إلى بئر واحدة للوحة المعدة مع خلايا A549.
- إضافة تعليق نانوليبوبليكس للخلايا واحتضان في الظروف العادية ح 24 لتحليل فعالية تعداء، أو ح 24 و 72 ح لتحليل جدوى الخلية بعد تعداء.
ملاحظة: تعداء مع نلبس لا تتطلب تغييرا في متوسط.
7-تحليل كفاءة تعداء الخلايا استخدام التدفق الخلوي والفحص المجهري Fluorescence
- إزالة المادة طافية وتغسل الخلايا مع 1 مل/وأيضا برنامج تلفزيوني (دون Ca2 +/Mg2 +) لإزالة نلبس المتبقية.
- إعداد الخلايا للتدفق الخلوي.
- تريبسينيزي الخلايا مع 500 ميليلتر/بئر التربسين/يدتا (0.05%) عند 37 درجة مئوية للحد الأدنى 3 توقف العملية وإلغاء تنشيط التربسين بإضافة نفس المبلغ (500 ميليلتر في البئر) المتوسطة العادية المحتوية على FBS.
- الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 400 x ز وإزالة المادة طافية بعناية دون لمس بيليه الخلية.
- تغسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني (دون Ca2 +/Mg2 +).
- ريسوسبيند الخلايا في 300 ميليلتر من 1 x تثبيت الحل ونقل الخلايا في أنابيب التدفق الخلوي.
- تحليل الخلايا في 488 نانومتر في تدفق سيتوميتير (الشكل 4 أ).
ملاحظة: دوامة الخلايا 1 x مباشرة قبل القياس.
- إعداد الخلايا للفحص المجهري الأسفار.
- إصلاح الخلايا مع 1 مل/بئر 100 ٪ الميثانول، التي تم تخزينها مسبقاً في-20 درجة مئوية.
- إضافة 500 ميليلتر/بئر 300 نانومتر DAPI (4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي) حله في برنامج تلفزيوني (دون Ca2 +/Mg2 +) واحتضانها لمدة 5 دقائق في الظلام.
- إزالة الحل DAPI وتغسل الخلايا مرة أخرى مع 100 ٪ الميثانول المخزنة في-20 درجة مئوية.
- تحليل الخلايا باستخدام مجهر الأسفار (الشكل 4 باء).
ملاحظة: استخدام أطوال موجية الإثارة/الانبعاثات التالية: اجفب 488/509 شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط DAPI 358/461 Cy3 550/570 نانومتر.
8-خلية جدوى الفحص
- تذوب 5 ملغ MTT (بروميد 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) في 1 مل ربمي (دون الأحمر الفينول).
ملاحظة: MTT حله يجب أن يكون كذلك المخفف 01:10 (التركيز النهائي: 0.5 ملغ/مل) في ربمي قبل الاستخدام. - أغسل transfected الخلايا 3 x مع 1 مل/بئر PBS (دون Ca2 +/Mg2).
ملاحظة: ما تبقى المتوسطة الخلية العادية ينبغي أن تكون إزالتها بالكامل. - إضافة من 01:10 500 ميليلتر/جيدا تضعف حل MTT للخلايا واحتضانها ح 4 في 37 درجة مئوية.
- إزالة الحل MTT من الخلايا بعد الاحتضان وإضافة 500 ميليلتر/بئر [دمس] (ثنائي ميثيل سلفوكسيد). احتضان مرة أخرى لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- "الماصة؛" الحل [دمس] في ثلاثة توائم في لوحة 96-جيدا واضحة لأسفل وقياس الامتزاز في 540 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية.
- تعيين بقاء الخلية غير المعالجة على 100% وحساب صلاحية خلية من المجموعات الأخرى بالمقارنة مع الخلايا التحكم غير المعالجة (الشكل 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام البروتوكول كما هو موضح، أعدت نلبس تتألف من الدهون DC-الكوليسترول ومخدر باستخدام الأسلوب الجاف-فيلم (الشكل 1). أثناء الإعداد، يظهر الحل نانوليبوسومي مراحل مختلفة في تعكر (الشكل 2).
يمكن ثم تحليل فعالية التغليف نلبس بعد التغليف من 1 ميكروغرام من اجفب-ترميز مرناً من خلال تحليل كمية مجانية مرناً، الذي كان غير مغلفة، باستخدام أدوات القياس الكمي الحمض النووي الريبي (الشكل 3).
بعد تغليف اجفب يمكن المحتضنة مرناً في كميات مختلفة نلبس، نانوليبوبليكسيس المشكلة مع الخلايا في المختبر ، والنسبة المئوية للتعبير عن اجفب الخلايا يمكن تحليلها باستخدام التدفق الخلوي ح 24 بوسترانسفيكشن (الشكل 4 أ) . حتى 1 ميليلتر لحل نانوليبوسومي غير كافية لتحقيق تعداء عالية من الخلايا في المختبر. عندما يتم transfected الخلايا مع نلبس المحتوية على اجفب المسمى Cy3 مرناً، تصور وجود اجفب يمكن أن يكون مرناً في السيتوبلازم (ومضان أحمر)، فضلا عن البروتين اجفب المنتجة بالفعل (الفلورية الخضراء) (الشكل 4 باء).
منذ تعداء الخلايا باستخدام نانوليبوبليكسيس يمكن أن تترك آثاراً ضارة على الخلايا، اختبر صلاحية الخلايا ح 24 (الشكل 5A) وبوسترانسفيكشن ح 72 (الشكل 5 (ب)). تعذر الكشف عن لا آثار على بقاء الخلية عند الخلايا تعامل مع 2.5 أو 5 ميليلتر نلبس أو نانوليبوبليكسيس، على التوالي.
رقم 1: نظرة عامة التخطيطي لعملية التصنيع من نانوليبوسوميس الأيوني. أولاً، ينبغي أن تكون مختلطة الدهون المذابة DC-الكوليسترول ومنشطات معا في قارورة زجاج. ثانيا، ينبغي أن تبخر السوائل كلوروفورم مرئية تحت الأرجون أو تدفق غاز النيتروجين وبقايا كلوروفورم ينبغي أن يسمح تتبخر بين ليلة وضحاها في فراغ. ثالثا، ينبغي أن امهاء الفيلم شكلت المادة الدهنية في الجزء السفلي لقارورة زجاجية مع خالية نوكلاس ح2س، تليها فورتيكسينج لتشكيل الدهنية مولتيلاميلار. من خلال سونيكاتيون وقذف الحل الحويصلية، أونيلاميلار جاهزة للاستخدام ويتم إنتاج نلبس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الحل نانوليبوسومي في مراحل مختلفة أثناء التصنيع. (أ) هذا الرقم يظهر الحل الحويصلية مباشرة بعد الإماهة الفيلم الدهن وفورتيكسينج لمدة 15 دقيقة، فضلا عن (ب) بعد ح 1 في سونيكيشن حمام (ج) تليها دورات 25 من النتوء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: فعالية التغليف نانوليبوسوميس- تظهر لوحة هذا التحديد الكمي اجفب الحرة مرناً بعد التغليف في نلبس. وترد النتائج كما يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: فعالية تعداء نانوليبوبليكسيس- (أ) هذا الفريق يدل على تصميم أفضل نسبة مرناً/نانوليبوسومي تعداء استخدام كميات مختلفة من نلبس لتغليف 1 ميكروغرام من اجفب مرناً بوسترانسفيكشن ح 24. (ب) يظهر هذا الفريق كشف مرناً الاصطناعية المسمى Cy3 مغلفة في ميليلتر 2.5 نلبس والتعبير اجفب في بوسترانسفيكشن ح 24 الخلايا (شريط المقياس = 50 ميكرومتر). وترد النتائج كما يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: خلية البقاء بعد تعداء مع نانوليبوسوميس ومرناً مغلفة. يظهر هذا الفريق بقياس صلاحية الخلية استخدام الإنزيم MTT (A) ح 24 وبوسترانسفيكشن (ب) ح 72. وترد النتائج كما يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الخطوة | درجة الحرارة في درجة مئوية | المدة |
| 1 | 95 | 5 دقيقة |
| 2 | 94 | 15 s |
| 3 | 55 | 1 دقيقة |
| 4 | 72 | 1 دقيقة |
| 5 | انتقل إلى 2 30 x | |
| 6 | 72 | 10 دقيقة |
| 7 | 4 | عقد |
الجدول 1: بكر دورة البروتوكول لتضخيم الحمض النووي.
| تركيز | المبلغ | |
| ATP | 7,5 مم | 4 ميليلتر |
| أنشئ | 1,875 مم | 1 ميليلتر |
| 5-ميثيلسيتيدين | 7,5 مم | 3 ميليلتر |
| Ψ | 7,5 مم | 3 ميليلتر |
| أركا | 2.5 مم | 10 ميليلتر |
| قالب الحمض النووي | 1.5 ميكروغرام | |
| ميكس المخزن المؤقت | س 1 | 4 ميليلتر |
| ميكس إنزيم T7 | 4ΜL | |
| رناسي-المانع | 1 ميليلتر | |
| المياه خالية من نوكلاس | ملء ميليلتر يصل إلى 40 | |
الجدول 2: ميكس في المختبر النسخ من الحمض النووي مرناً.
| حجم خالية نوكلاس ح2س (ميليلتر) | حجم اجفب مرناً عالية-مجموعة الأوراق المالية حل (ميليلتر) | حجم 1: 200 صبغة الفلورسنت (ميليلتر) | التركيز النهائي (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 1000 |
| 50 | 50 | 100 | 500 |
| 90 | 10 | 100 | 100 |
| 98 | 2 | 100 | 20 |
| 100 | 0 | 100 | فارغة |
الجدول 3: البروتوكول لمنحنى قياسي عالية-المدى-
| حجم خالية نوكلاس ح2س (ميليلتر) | حجم اجفب مرناً الأسهم المنخفضة-مجموعة حل (ميليلتر) | حجم صبغة الفلورسنت 1:2000 (ميكروليتر) | التركيز النهائي (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 50 |
| 50 | 50 | 100 | 25 |
| 90 | 10 | 100 | 5 |
| 98 | 2 | 100 | 1 |
| 100 | 0 | 100 | فارغة |
الجدول 4: البروتوكول لمنحنى قياسي منخفض النطاق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف البروتوكول قدم توليد نلبس مع تغليف عالية الفعالية مرناً معدلة صناعيا، وكذلك تعداء موثوقة من الخلايا في المختبر. وعلاوة على ذلك، نلبس كفالة الإفراج عن مرناً، الذي بدوره يترجم إلى بروتين وظيفية داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، ترانسفيكشنز استخدام نلبس يمكن أن يؤديها في الخلية العادية المتوسطة، وأسفر عن ارتفاع الخلية فيابيليتيس أثناء تعداء، ويستمر ثلاثة أيام بعد تعداء.
لاستخدام مرناً العلاجية، تجميع ذاتي نظام لتسليمها المفضل. الكواشف تعداء الأكثر شيوعاً تشمل الدهون الموجبة، بما في ذلك الدهنية. كما يتوجب إيجابيا الدهنية، يمكن تغليف الأحماض النووية المشحونة سلبيا في لهم، مما يسمح للتنافر الالكتروستاتيكي أغشية الخلايا يتم التغلب على35. الدهون الموجبة قد سبق وصفها في دراسات سابقة DC-الكوليسترول كمركبات مستقرة ومتوافق حيويا36. إضافة المادة الدهنية محايدة المخدر يؤدي إلى كفاءة محسنة تعداء37. النظر في المزايا المحددة المشار إليها أعلاه، واختيرت هذه الدهون للتحضير نلبس. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت الدراسات السابقة أن استخدام هذه الدهون اثنين الأفضل على الآخرين بسبب معدل زيادة تعداء خلوية مع الأحماض النووية المشحونة سلبا على38.
لتوليد ناجحة نلبس ونانوليبوبليكسيس، من الضروري إيلاء اهتمام إضافي لبعض الخطوات. ينبغي أن يتم هذا إجراء جيل نانوليبوسومي تحت س2-مجاناً الشروط. يمكن أن يؤدي وجود س2 خلال الجيل البرمجة اللغوية العصبية إلى تدهور فوسفوليبيدات وانخفاض إمكانية تكرار نتائج39. وعلاوة على ذلك، على الرغم من التعديلات، مرناً حساس جداً فيما يتعلق بالتدهور من خلال نوكليسيس. ومن ثم الإماهة الفيلم الدهن، استخدام خالية رناسي ح2س ينصح بشدة لمنع تدهور مرناً أثناء كومبليكسيشن. أيضا، ينبغي ضمان ظروف خالية من رناسي لتخزين نانوليبوبليكسيس.
وعلاوة على ذلك، يمكن أن تشكل نلبس المجاميع مع مرور الوقت بسبب نظام دينامي حراري غير مستقرة. وتشمل المعلمات تأثير درجة حرارة التخزين والشحن السطحي الدهنية40. قد يؤدي تجميع البرمجة اللغوية العصبية في زعزعة الاستقرار في غشاء الحويصلية وخطر مرغوبة مرناً الإفراج عن41، مما يؤدي إلى تدهور كفاءة ومرناً تعداء الفقيرة في الفضاء خارج الخلية. ومع ذلك، سيظهر كما سبق، يمكن تخزين نانوليبوبليكسيس عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر دون التجميع أو فقدان فعاليتها تعداء35.
باستخدام الدهنية كنظام الناقل المخدرات، يمكن حلها باثنين من المشاكل الرئيسية لإيصال الأدوية. الدهنية حماية المخدرات مغلفة من التدهور وقادرون على الأنسجة المستهدفة التي تحتوي بطانة متقطع، مثل الكبد أو نخاع العظم16سلبية. لإيصال العلاجية من الأحماض النووية، والمعلمات مثل حجم الجسيمات والتغليف القدرة الحاسمة لاستيعاب المركبات الاسمافرون التقييم والخلوية. وبخاصة، حجم الدهنية في مقياس نانومتر يسمح تفاعل مع غشاء الخلية42 والمهم، وبالتالي، في فيفو استخدام لاحقاً. أولاً، ينبغي أن تكون الدهنية صغيرة بما يكفي لتجنب إزالة الألغام عن طريق النظام الكلي والكبد43. ثانيا، ينبغي أن يساعد حجم الحويصلية للتغلب على الحاجز الأوعية الدموية لاستهداف خلايا الجهاز المطلوب. وأفيد أن الدهنية في نطاق الحجم 100-300 نانومتر تمكنوا من كفاءة ترانسفيكت44من خلايا الكبد؛ ولكن كبير الحجم الدهنية (مثلاً، 400 نانومتر) لم تكن قادرة على التغلب على حاجز غشائي45.
على الرغم من أن قد أنشئ الأسلوب وصف لإيصال مرناً، فإنه يمكن تنفيذ أيضا للمداواة الأحماض النووية الأخرى، مثل ميكرورنا. وفي دراسة أجريت مؤخرا، أثبتنا أن microRNA 126 يمكن أن تكون مستهدفة بشكل انتقائي، وذلك، وضع تمدد الأوعية الدموية الابهري البطني يمكن أن يحول دون فعالية46. المداواة الحمض النووي/الجيش الملكي النيبالي يمكن أن يسبب الآثار الجانبية، مثل تنشيط الصفائح الدموية، عندما يأتون إلى الاتصال المباشر مع خلايا، التعبئة والتغليف داخل الدهنية يمكن تجنب هذا، وبالتالي جعلها كذلك فائدة47. ولذلك الأسلوب الذي قدم هنا تنوعاً للغاية ويمكن استخدامها لتصميم إيصال الأدوية لكثير من الأمراض. البروتوكول المعمول ليس فقط يسمح توليد سريعة وفعالة من حيث التكلفة لحامله مرناً كفاءة مع حجم محدد ولكن أيضا توفر إمكانية تخصيص صياغة المادة الدهنية وفقا لاحتياجات تطبيق معين: (1) الحجم ويمكن بسهولة تغيير الدهنية عن طريق تغيير عوامل التصفية؛ (2) على سطح الدهنية مشحونة بشكل إيجابي يمكن تعديله باستخدام، على سبيل المثال، البولي إيثيلين غليكول، إلى زيادة الاستقرار وتأخير التخليص الدم خلال في فيفو التطبيق48. ربط أجسام مضادة محددة الدهنية يسمح التنفيذ الهادف ل المخدرات مغلفة49. مع مزيد من الفحص ونظرة أكثر تفصيلاً في الخصائص الفيزيائية، قد لا يزال تحسين البروتوكول عليها.
تتوفر ثلاثة أساليب شائعة لتوليد الدهنية،: الجاف-فيلم وحقن الإيثانول، وتبخر عكس المرحلة. في يانغ وآخرون. كانت تقنيات التصنيع الثلاث هذه الدراسة، مقارنة مع35. ووجد أن الدهنية مع حجم معرفة وتوزيع المتساوي في الحل يمكن أن تتولد باستخدام الأسلوب الجاف-فيلم. وعلاوة على ذلك، قام الإجراء الجاف-فيلم في هذه الدراسة أدت إلى إنتاج نلبس مع حجم محدد من 200 نانومتر، وتوزيعا متجانساً، وتغليف عالية قدرة.
من ناحية، المسؤول عن الإيجابية الدهنية يؤدي إلى تغليف زيادة القدرات و أفضل خلية الانصهار السطحية،50،51،52، ولكن من ناحية أخرى، قد تزعزع استقرار غشاء الخلية وتنشيط مسارات مختلفة التنشيط المناعي وخلية الموت27،53. ومع ذلك، يمكن التقليل من خصائص apoptotic الدهون الموجبة باستخدام مساعد دهن مخدر54،55. ووجد في دراسة تشانغ et al., أن نسبة 1:2 DC-الكوليسترول ومنشطات خلال جيل الحويصلية يؤدي إلى تعداء الخلوية الأكثر كفاءة استخدام الأحماض النووية38. في أسلوب تنفيذها في هذه الدراسة، استخدمت نسبة الدهون الكولسترول DC-1:2 ومنشطات في تعليق المادة الدهنية المختلطة أثناء إعداد الفيلم الدهن، والدهنية المعدة أدت إلى كفاءة عالية تعداء، وفي نفس الوقت، ارتفاع الخلية البقاء. كما عثر على نتائج مشابهة باحثون آخرون، مثل سياني56 وفرهود37.
وبوجه عام، استخدمت الدهنية لسنوات في التجارب السريرية، وعرض كبير توافق مع الحياة وسمية منخفضة في فيفو. في تركيبة مع مرناً، يمكن نلبس للكفاءة في تقديم مرناً للخلايا أو الأجهزة في المختبر و في فيفو، للحث على حيثياته توليف البروتين المطلوب. فيما يتعلق بالتطبيقات العلاجية، نانوليبوبليكسيس يمكن استخدامها، على سبيل المثال، في بقع شفاء الجرح عبر الجلد مرناً التسليم57 لتنشيط تجديد الخلايا، أو كرذاذ نيبوليزيشن من مرناً58 لعلاج الرئة الأمراض59،60 مثل التليف الكيسي.
ويضمن البروتوكول قدم طريقة سهلة ويمكن الوصول إليها لتوليد نلبس استخدام الأسلوب الجاف-الفيلم، التي يمكن استخدامها لتغليف كفاءة في المختبر ثم نسخها مرناً وآمنة تعداء الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
لا شيء
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
| (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
| 4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
| BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
| Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
| Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
| Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
| Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
| Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
| RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
| Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
| Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
| GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
| peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
| Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |
References
- Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don't shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
- Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
- Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
- Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
- Youn, H., Chung, J. -K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8 (2014).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
- Michel, T., Wendel, H. -P., Krajewski, S. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. Kormann, M. , IntechOpen. 3-20 (2016).
- Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
- Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
- Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
- Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
- Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
- Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
- Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
- Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
- Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
- Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
- Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
- Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
- Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
- Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497 (2011).
- Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
- Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
- Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943 (2014).
- Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
- Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
- Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
- Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
- Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
- Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
- Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
- Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
- Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience Reports. 22 (2), 197-224 (2002).
- Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. "In vivo" distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
- Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
- Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
- Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
- Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
- Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
- Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
- Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
- Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
- Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
- Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
- Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
- Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
- Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
- Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504 (2015).
- Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
