Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van kationische nanoliposomes, die is gebaseerd op de methode van de droge-film en kan worden gebruikt voor de veilige en efficiënte levering van in vitro getranscribeerd boodschapper-RNA.
Abstract
De ontwikkeling van boodschapper-RNA (mRNA)-op basis van therapieën voor de behandeling van verschillende ziekten meer en meer belangrijk vanwege de positieve wordt eigenschappen van in vitro getranscribeerd (IVT) mRNA. Met de hulp van IVT mRNA, kan de DOVO synthese van een gewenste eiwit worden opgewekt zonder het wijzigen van de fysiologische status van de doelcel. Bovendien, eiwit biosynthese kan precies worden gecontroleerd als gevolg van de voorbijgaande effect van IVT mRNA.
Voor de efficiënte transfectie van cellen, kunnen nanoliposomes (NLps) vormen een veilige en efficiënte leveringsvoertuig voor therapeutische mRNA. Deze studie beschrijft een protocol voor het genereren van veilige en efficiënte kationische NLps bestaande uit DC-cholesterol en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) als een levering vector voor IVT mRNA. NLps hebben een gedefinieerde grootte, een homogene verdeling, en een hoge kleurverandering capaciteit, en kan worden geproduceerd met behulp van de methode droge-film. Bovendien presenteren we verschillende testsystemen voor het analyseren van hun kleurverandering en transfectie efficacies met behulp van synthetische verbeterd groen fluorescent proteïne (eGFP) mRNA, alsmede hun effect op de levensvatbaarheid van de cellen. Over het algemeen voorziet gepresenteerd het protocol een effectieve en veilige benadering mRNA kleurverandering, die kan bevorderen en verbeteren van het beheer van therapeutische mRNA.
Introduction
Het gebruik van gemodificeerde mRNA voor therapeutische toepassingen blijkt groot potentieel in de laatste paar jaar. In monogenetic, cardiovasculaire en inflammatoire ziekten, evenals bij de ontwikkeling van vaccins, is mRNA een veelbelovende therapeutische agent1.
Eiwit substitutietherapie met mRNA biedt diverse voordelen ten opzichte van de klassieke gentherapie, die is gebaseerd op de transfectie van het DNA in de doel cellen2. De functie van mRNA initieert rechtstreeks in het cytosol. Hoewel het plasmide DNA (pDNA), een constructie van het double-stranded, circulaire kan DNA met een promotor-regio en een sequentie van genen codering van de therapeutische eiwitten3, ook daden in cytosol, het alleen worden opgenomen in cellen die zijn gaan door mitose op het moment van transfectie. Dit vermindert het aantal transfected cellen in het weefsel1,4. De transfectie van weefsels met zwakke mitose activiteit, zoals hartcellen, is met name moeilijk5. In tegenstelling tot pDNA optreden de transfectie en vertaling van mRNA in de cellen van de mitotische en niet-mitotische in het weefsel1,6. De virale integratie van DNA in het genoom van de gastheer kan komen met mutagene effecten of immuunreacties7,8, maar na de transfectie van cellen met een eiwit-encoding mRNA, de DOVO -synthese van de gewenste eiwit begint autonoom9,10. Bovendien kan de eiwitsynthese juist naar de behoefte van de patiënt door middel van individuele doses, zonder mengend in het genoom en het gevaar van mutagene effecten11worden aangepast. Het potentieel immuun-activeren van synthetisch gegenereerde mRNA kan drastisch worden verlaagd met behulp van pseudo-uridine en 5'-methylcytidine in plaats van uridine en cytosinetrifosfaat12. Pseudo-uridine gemodificeerde mRNA is ook aangetoond dat een verhoogde biologische stabiliteit en een aanzienlijk hogere translationeel capaciteit13.
Om te kunnen profiteren van de veelbelovende eigenschappen van mRNA gebaseerde therapie in klinische toepassingen, is het essentieel om een geschikt voertuig voor het vervoer van mRNA in de cel. Dit voertuig moet dragen niet-toxische eigenschappen in vitro en in vivo, de mRNA tegen nuclease-afbraak te beschermen, en bieden voldoende cellulaire opname voor een langdurige beschikbaarheid en vertaling van de mRNA14.
Onder allerlei mogelijke vervoerder voor in vivo drug levering, zoals koolstof nanotubes en quantumdots liposomen, de laatste zijn geweest de meest15,16studeerde. Liposomen zijn blaasjes bestaande uit een lipide dubbelgelaagde10. Ze zijn amfifiele met een hydrofobe en een hydrofiele sectie, en door de zelfstandige regeling van deze moleculen, is een bolvormige dubbellaagse gevormde17. Binnen de liposomen, kunnen therapeutische agenten of drugs worden ingekapseld en, dus, beschermd tegen enzymatische afbraak18. Liposomen met N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propaan] (DOTAP)20en21van het dioctadecylamidoglycylspermine (honden), of DC-cholesterol22, zijn goed gekenmerkt en vaak gebruikt voor cellulaire transfectie met DNA of RNA.
Kationogene liposomen bestaat uit een positief geladen lipide en een ongeladen fosfolipide23. Transfectie via kationische liposomen is één van de meest voorkomende methoden voor het vervoer van nucleic zuren in cellen24,25. De deeltjes van kationische lipide vormen complexen met de negatief-geladen fosfaat groepen in de ruggengraat van nucleïnezuur moleculen26. Deze zogenaamde lipoplexes hechten aan het oppervlak van de celmembraan en voer de cel via endocytosis of endocytose-achtige-mechanismen27.
In 1989, Malone, et al.. succesvol beschreven kationische lipide-gemedieerde mRNA transfectie28. Echter, met behulp van een mengsel van DOTMA en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), de groep vond dat DOTMA geopenbaard cytotoxische effecten28. Zohra et al. toonde bovendien aan dat DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammoniumformiaat-propaan chloride) kan worden gebruikt als een reagens van mRNA transfectie29. Echter, voor de efficiënte transfectie van cellen, DOTAP moeten worden gebruikt in combinatie met andere reagentia, zoals fibronectine29 of DOPE30. Tot nu toe, was DOTMA de eerste kationische lipide in de markt voor de levering van gene31. Andere lipiden als therapeutische dragers worden gebruikt of worden getest in verschillende stadia van klinische proeven, (bijvoorbeeld EndoTAG-I, met DOTAP als de drager van een lipide), wordt momenteel onderzocht in een klinische trial fase-II32.
Dit werk beschrijft een protocol voor het genereren van NLps met DC-cholesterol en DOPE. Deze methode is gemakkelijk uit te voeren en maakt de generatie van NLps van verschillende grootte. Het algemene doel van NLp generatie met de droge-film-methode is het creëren van liposomen voor mRNA kleurverandering, waardoor op efficiënte en biocompatibel cel transfectie in vitro14,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generatie van kationische Nanoliposomes (Figuur 1)
- Los de lipiden DC-cholesterol (3β-[N--(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoylfosfaat] cholesterol hydrochloride) en DOPE (dioleoyl phosphatidylethanolamine), geleverd als een poeder, in chloroform om een eindconcentratie van 25 mg/mL.
Opmerking: Bewaar de opgeloste lipiden bij-20 ° C. - Werken met 25 mg/mL stockoplossing van beide lipiden. Mix 40 µL van het opgeloste DC-cholesterol en 80 µL van het opgeloste DOPE in een maatkolf van glas.
Nota: Het bedrag van de totale lipide is 3 mg. Om te voorkomen dat een snelle verdamping van de chloroform, plaatst u de lipiden op ijs tijdens pipetteren. - Verdampen de chloroform gedurende 15 minuten onder een gasstroom argon. Vervolgens vul een exsiccator met silica gel, plaats de erlenmeyer open glas binnen en toepassen van een vacuüm 's nachts om ervoor te zorgen dat de resterende chloroform wordt ingedampt en een lipide-film wordt gevormd in de kolf van het glas.
Opmerking: Het werk snel en Vermijd geen onnodige O2 contact. - Hydrateren de gevormde lipide-film met 1 mL van de nuclease-gratis water en vortex de schorsing gedurende 15 minuten (figuur 2A). Daarna, plaats de schorsing in een ultrasoonapparaat bad voor 1 h (figuur 2B).
Opmerking: De opschorting worden licht bewolkt. - Monteren van de mini extruder volgens de instructies van de fabrikant, vul een spuit met de lipide-opschorting en de gevulde spuit en een lege spuit te plaatsen aan beide zijden van de extruder. Druk op de lipide-schorsing via het membraan uit één spuit naar de andere, 20 x-25 x, om het extruderen van de schorsing (figuur 2C).
Opmerking: De grootte van de NLps wordt bepaald door de poriegrootte van het membraan gebruikt. - Bewaar de NLps in een maatkolf van glas bij 4 ° C tot verder gebruik.
Opmerking: Na langdurige opslagtijd, de NLps moeten worden geplaatst in het ultrasoonapparaat bad opnieuw gedurende 15 minuten door 35 kHz te omzeilen complexvorming.
2. in Vitro transcriptie van synthetische mRNA
- Bereiden de eGFP-codering mRNA volgens het protocol gepubliceerd eerdere34.
- Versterken de eGFP volgorde uit het plasmide met 0,7 µM van de forward (5'-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3') en omgekeerde (5'-T120 CTT CTT ACT CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3') primers en de polymerase kit met PCR.
- Mix 20 µL van een commerciële bufferoplossing die het smeltende gedrag van DNA (Tabel of Materials), evenals 20 µL van de 5 x-mix van de polymerase-kit verandert. Voeg 7 µL van elke (forward en reverse) primer.
- Voeg toe 25 ng van de plasmide eGFP het mengsel en 2 µL van polymerase van de polymerase-kit.
Opmerking: Houd de polymerase op ijs voordat het pipetteren aan de oplossing. - Toevoegen van de nuclease-vrije H2O aan het mengsel, tot een volume van 100 µL.
- De cycli van PCR in de thermocycler volgens het protocol in tabel 1worden uitgevoerd.
- Zuiveren van de DNA-sequentie eGFP-codering met de PCR zuivering kit.
- Daarom, meng de PCR-oplossing met 500 µL van bindende buffer uit de kit en ermee te vullen zuivering kolommen.
- Centrifugeer de kolommen bij maximumsnelheid voor 1 min en gooi het filtraat.
- Voeg 750 µL van was buffer I tot en met de kolom, centrifuge opnieuw op de maximum snelheid voor 1 min en negeren het filtraat.
- Herhaal de centrifuge stap 1 x om de buffer van de kolom filter.
- De kolom overbrengen in een verse 1.5-mL-buis.
- Voeg 20 µL van nuclease-vrije H2O naar de kolom, Incubeer gedurende 1 minuut en centrifuge voor 1 min op maximale snelheid. Herhaal deze stap.
- Meten van de concentratie van het DNA met een fotometer en opslaan bij-20 ° C.
- Voer de DNA kwaliteit analyses met behulp van de Elektroforese van het gel. Voeg 0,5 g agarose in Tris-boraat-EDTA (FSME) buffer en warmen in de magnetron op hoog vuur totdat de agarose volledig is opgelost.
- 5 µL van gel-kleuring oplossing toevoegen aan de vloeibare agarose, vul de oplossing in de bedwelmingsruimte gel en wacht totdat de gel is polymeervorm.
- Mix 200 ng van DNA met 2 µL van 6 x laden kleurstof en vul het tot een einde volume van 12 µL. Pipetteer een DNA-ladder, evenals het DNA-monster, in de gel putten en voer de elektroforese gedurende 1 uur bij 100 V.
- Analyseer de gel met een gel-analyseren station onder UV-licht.
- Voer de transcriptie in vitro voor het genereren van mRNA uit de opeenvolging van DNA met een in vitro transcriptie kit met T7-polymerase en vervangen door de gewijzigde nucleotiden van UTP en CTP met Ψ-UTP en methyl-CTP.
- Meng de ingrediënten aanleiding van tabel 2voor de transcriptie in vitro .
Nota: Vervang 1.5 µL van methyl-CTP met 1:10 Cy3-CTP verdund in nuclease-vrije H2O tijdens de transcriptie in vitro van eGFP mRNA tot Cy3-labeling van de mRNA. - Incubeer de IVT reactie mix voor 4 uur bij 37 ° C.
- Voeg 1 µL van DNase ik uit de T7 polymerase kit en Incubeer het gedurende 15 minuten door 37 ° C te verteren de DNA-sjabloon.
- Meng de ingrediënten aanleiding van tabel 2voor de transcriptie in vitro .
- Als u wilt zuiveren het mRNA, door de RNA-opschonen kit te gebruiken.
- Vul de IVT mix aan het volume van 100 µL met nuclease-vrije H2O.
- Voeg 350 µL van lysis-buffermengsel en meng door pipetteren omhoog en omlaag.
- Voeg 250 µL van 100% ethanol en meng opnieuw. Pipetteer de mix in de kolommen van het opruimen.
- Centrifugeer gedurende 15 s bij 8.000 x g en negeren het filtraat.
- Voeg 500 µL van de buffer wassen in een kolom, Centrifugeer nogmaals gedurende 15 s bij 8.000 x g, en verwijder het filtraat.
- Was de kolom 1 x met 500 µL van wassen buffer en Centrifugeer gedurende 2 min op 8.000 x g.
- Verplaats de kolom naar een verse 1.5-mL reactiebuis. Elueer de mRNA 2 x door een 1-min-incubatie van 20 µL van nuclease-vrije H2O op het membraan van de kolom, gevolgd door een 1-min centrifugeren bij maximale snelheid.
- Verwijder de fosfaat groepen uit de mRNA die met behulp van een defosforylerings-kit. 4.5 µL van 10 x fosfatase buffer en 1 µL van fosfatase toevoegen aan het mRNA en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Zuiveren de mRNA opnieuw, volgt 2.5.1 - 2.5.7.
- Meet het mRNA-overleg met een fotometer.
- Gebruik de gelelektroforese van het voor het analyseren van de zuiverheid en de grootte van de mRNA. Daarom bereiden een agarose gel zoals beschreven in stappen 2.3.9 - 2.3.10.
- Mix-3.3 µL van formamide, 1 µL van 37% formaldehyde, 1 µL van 10 x mannen en 1.7 µL van 6 x laden kleurstof met 200 ng van mRNA en vul het maximaal 10 µL met nuclease-vrije H2O voor elk monster en RNA marker.
- Incubeer de mix gedurende 10 minuten bij 65 ° C gedurende mRNA denaturatie. De putten van de gel met het mRNA en RNA marker laden en uitvoeren van de gel gedurende 1 uur bij 100 V.
- Het analyseren van de gel een gel doc station met UV-licht.
3. de kleurverandering van synthetische mRNA
- Ontdooi de synthetische mRNA op het ijs, vortex, en centrifuge kort voor het openen van de buis.
- Mix 10 µL van synthetische mRNA (mRNA concentratie is 100 ng/µL) met 1 µL, 2.5 µL, 5 µL, 10 µL of 20 µL van NLp schorsing (NLp concentratie is 3 mg/mL). Kort centrifugeren en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT) voor de vorming van de nanolipoplex.
Opmerking: Meng geen door pipetteren. Dit kan leiden tot het verlies van volume. Vortex kort voor een homogenisatie van het mengsel. - 1 mL van regelmatige cel medium toevoegen aan het nanolipoplexes en meng ze door pipetteren omhoog en omlaag.
4. analyse van de efficiëntie van de inkapseling van Nanoliposomes
- Om uit te voeren van de experimenten van de inkapseling, door de RNA kwantificering kit te gebruiken.
- De werkoplossing bereid door verdunning van de fluorescente kleurstof-1:200 voor een hoge-bereik en 1:2,000 voor een low-range assay.
Opmerking: Ontdooien de fluorescente kleurstof op het ijs. De werkoplossing direct voor gebruik bereiden. - Voorbereiden van de hoog-bereik en lage-bereik standaard curven met 1 mL van de stockoplossing van een 2 µg/mL van eGFP mRNA in nuclease-vrije H2O.
Opmerking: Voor de standaard curven gebruiken de mRNA die zal worden gebruikt in de experimenten van inkapseling. - Tabel 3 gebruiken voor de bereiding van hoog-bereik standaard (20 ng/mL - 1 µg/mL).
- Voor de standaard van low-range, Verdun de 2 µg/mL eGFP mRNA stockoplossing 1:20 om een eindconcentratie van 100 ng/mL. Bereid een low-range (1 ng/mL - 50 ng/mL) zoals beschreven in tabel 4.
- Combineer 1 µg eGFP mRNA (10 µL) en 7,5 µg van NLps (2.5 µL) en incubeer gedurende 20 min op RT.
Opmerking: Houd de mRNA op ijs Voorkom aantasting. - Voeg 1 mL nuclease-vrije H2O vorm nanolipoplexes en meng door pipetteren omhoog en omlaag.
- 1 mL van de 1:200 of 1:2,000 RNA fluorescente kleurstof werkoplossing toevoegen aan de ingekapselde monsters en normen en incubeer gedurende 5 min op RT in het donker.
- Pipetteer van de normen en de monsters in de duplicaten in een zwarte 96-wells-plaat en meten van de fluorescentie bij 530 nm op een microplate-lezer (Figuur 3).
5. bereiding van de cellen voor Transfectie
- Plaat 1.5 x 105 A549 cellen per putje van een 12-well plaat 1 d vóór transfectie.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 in regelmatige cel medium (DMEM/hoge glucose met 10% foetale runderserum [FBS], 2 mM L-glutamine, penicilline/streptomycine 1%) gedurende 24 uur voordat de transfectie.
6. de transfectie van de cellen
- Wassen het voorbereide cellen 1 x met 1 mL/putje PBS (zonder Ca2 +/Mg2 +).
- Voeg 1 mL bereid nanolipoplex mengsel, bevattende 1 µg eGFP die mRNA ingekapseld in 1-µL, 2.5-µL, 5-µL, 10-µL of 20-µL NLps, aan één putje van de bereid plaat met A549 cellen.
- De schorsing van de nanolipoplex toevoegen aan de cellen en Incubeer bij regelmatige voorwaarden gedurende 24 uur voor het analyseren van de transfectie werkzaamheid, of 24 uur en 72 uur voor het analyseren van de levensvatbaarheid van de cellen na transfectie.
Opmerking: Transfectie met NLps is niet vereist voor een middellange verandering.
7. analyse van cel transfectie werkzaamheid met behulp van Stroom Cytometry en fluorescentie microscopie
- Verwijder het supernatant en wassen van de cellen met 1 mL/goed PBS (zonder Ca2 +/Mg2 +) te verwijderen van de resterende NLps.
- Stroom cytometry voorbereiden op de cellen.
- Trypsinize van de cellen met 500 µL per putje trypsine/EDTA (0.05%) bij 37 ° C gedurende 3 minuten Stop het proces en inactivering van de trypsine door hetzelfde bedrag (500 µL per putje) van regelmatige FBS-bevattende medium toe te voegen.
- De cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g centrifugeren en verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof zonder het aanraken van de cel-pellet.
- Wassen van de cellen met 1 mL PBS (zonder Ca2 +/Mg2 +).
- Resuspendeer de cellen in 300 µL van 1 x fixatie oplossing en breng de cellen in stroom cytometry buizen.
- Analyseren van de cellen op 488 nm in een flow cytometer (figuur 4A).
Opmerking: Vortex de cellen 1 x rechtstreeks voor het meten.
- De cellen voorbereiden door fluorescentie microscopie.
- Herstellen van de cellen met de 1 mL/putje 100% methanol, die eerder werd opgeslagen bij-20 ° C.
- Voeg toe 500 µL per putje 300 nM DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) opgelost in PBS (zonder Ca2 +/Mg2 +) en incubeer gedurende 5 min. in het donker.
- De DAPI-oplossing verwijderen en de cellen opnieuw wassen met 100% methanol opgeslagen bij-20 ° C.
- Het analyseren van de cellen met behulp van een fluorescentie Microscoop (figuur 4B).
Opmerking: Gebruik de volgende excitatie/emissie golflengtes: eGFP 488/509 nm, DAPI 358/461 nm en Cy3 550/570 nm.
8. cel levensvatbaarheid Assay
- Los 5 mg MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) in 1 mL RPMI (zonder fenol rood).
Opmerking: De opgeloste MTT moet verder verdund 1:10 (eindconcentratie: 0,5 mg/mL) in RPMI vóór gebruik. - Wassen van transfected cellen 3 x met 1 mL/putje PBS (zonder Ca2 +/Mg2).
Opmerking: De resten van het medium regelmatige cel moeten volledig worden verwijderd. - Voeg 500 µL per putje van 1:10 verdund MTT-oplossing aan de cellen en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C.
- Verwijder de MTT-oplossing uit de cellen na incubatie en voeg 500 µL per putje DMSO (dimethylsulfoxide). Incubeer opnieuw gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
- De oplossing van DMSO in drieling Pipetteer in een bodemplaat, die duidelijk-96-Wells en meet het adsorptiepercentage bij 540 nm microplate lezer gebruikt.
- De levensvatbaarheid van de onbehandelde cel instellen op 100% en de levensvatbaarheid van de cellen van de andere fracties in vergelijking met de onbehandelde cellen (Figuur 5) te berekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van het protocol zoals beschreven, NLps bestaande uit de lipiden DC-cholesterol en DOPE opgesteld met behulp van de methode van de droge-film (Figuur 1). Tijdens de voorbereiding toont de nanoliposome oplossing verschillende stadia in de troebelheid (Figuur 2).
De werkzaamheid van de inkapseling van de NLps kan dan na de inkapseling van 1 microgram van mRNA eGFP-codering worden geanalyseerd door het analyseren van de gratis hoeveelheid mRNA, die niet was ingekapseld, met behulp van het RNA kwantificering kit (Figuur 3).
Na de inkapseling van eGFP die mRNA in verschillende hoeveelheden van NLps, de gevormde nanolipoplexes kan worden geïncubeerd met cellen kunnen in vitro en het percentage cellen eGFP-uiting worden geanalyseerd met behulp van stroom cytometry 24 h posttransfection (figuur 4A) . Zelfs 1 µL van de nanoliposome oplossing is voldoende om een hoge transfectie van de cellen in vitro. Wanneer de cellen zijn transfected met NLps met Cy3-gelabelde eGFP mRNA, de aanwezigheid van de eGFP mRNA in het cytoplasma (rode fluorescentie), evenals de reeds geproduceerde eGFP proteïne (groene fluorescentie) kan worden gevisualiseerd (figuur 4B).
Aangezien de transfectie van cellen met behulp van nanolipoplexes kan nadelige gevolgen voor cellen hebben, de levensvatbaarheid van de cellen 24u (figuur 5A) is getest en 72 h (figuur 5B) posttransfection. Geen gevolgen voor de levensvatbaarheid van de cellen kunnen worden gedetecteerd wanneer de cellen werden behandeld met 2,5 of 5 µL van NLps of nanolipoplexes, respectievelijk.
Figuur 1: Schematisch overzicht van het productieproces van kationische nanoliposomes. Ten eerste, de opgeloste lipiden DC-cholesterol en DOPE moeten worden vermengd in een maatkolf van glas. Ten tweede, de zichtbare chloroform vloeistof moet worden verdampt onder argon of stikstof gasstroom en de restjes van chloroform mag 's nachts verdampen in vacuüm. Ten derde, de gevormde lipide-film op de onderkant van de glazen kolf moet worden rehydrated met nuclease-vrije H2O, gevolgd door vortexing multilamellar liposomen vormen. Door de ultrasoonapparaat en extrusie van de liposomen-oplossing, de kant-en-klare unilamellar NLps worden geproduceerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: de nanoliposome oplossing in verschillende fasen tijdens het productieproces. (A) dit cijfer toont de liposomen oplossing direct na rehydratie de lipide film-en vortexing voor 15 min, evenals (B) na 1 h in een ultrasoonapparaat bad (C) gevolgd door 25 cycli van extrusie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: inkapseling werkzaamheid van de nanoliposomes. Dit paneel toont de kwantificering van gratis eGFP mRNA na inkapseling in NLps. De resultaten worden gepresenteerd als middel van ± SEM (n = 3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: transfectie werkzaamheid van de nanolipoplexes. (A) dit paneel toont de bepaling van de beste mRNA/nanoliposome verhouding voor Transfectie met behulp van verschillende hoeveelheden NLps om in te kapselen 1 µg eGFP mRNA 24u posttransfection. (B) dit paneel toont de detectie van Cy3-geëtiketteerden synthetische mRNA ingekapseld in 2.5 µL NLps en de expressie van eGFP in de cellen 24 h posttransfection (de schaal bar = 50 µm). De resultaten worden gepresenteerd als middel van ± SEM (n = 3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: levensvatbaarheid van cellen na de transfectie met nanoliposomes en ingekapselde mRNA. Dit paneel toont de meting van de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van een MTT assay (A) 24u en (B) 72 h posttransfection. De resultaten worden gepresenteerd als middel van ± SEM (n = 3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Stap | Temperatuur in ° C | Duur |
| 1 | 95 | 5 min |
| 2 | 94 | 15 s |
| 3 | 55 | 1 min |
| 4 | 72 | 1 min |
| 5 | Ga naar 2 30 x | |
| 6 | 72 | 10 min |
| 7 | 4 | Houd |
Tabel 1: PCR cyclus protocol voor DNA-amplificatie.
| Concentratie | Bedrag | |
| ATP | 7,5 mM | 4 ΜL |
| GTP | 1,875 mM | 1 ΜL |
| 5'-Methylcytidin | 7,5 mM | 3 ΜL |
| Ψ | 7,5 mM | 3 ΜL |
| ARCA | 2,5 mM | 10 ΜL |
| DNA-sjabloon | 1,5 µg | |
| Buffer mix | 1 x | 4 ΜL |
| T7 enzym mix | 4ΜL | |
| RNase-remmer | 1 ΜL | |
| Nuclease-gratis water | vullen van maximaal 40 µL | |
Tabel 2: Mix voor de in vitro transcriptie van DNA naar mRNA.
| Volume van de nuclease-vrije H2O (µL) | Volume van eGFP mRNA hoog-bereik stockoplossing (µL) | Volume van 1:200 fluorescente kleurstof (µL) | Eindconcentratie (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 1000 |
| 50 | 50 | 100 | 500 |
| 90 | 10 | 100 | 100 |
| 98 | 2 | 100 | 20 |
| 100 | 0 | 100 | leeg |
Tabel 3: Protocol voor een hoge-bereik standaard curve.
| Volume van de nuclease-vrije H2O (µL) | Volume van eGFP mRNA low-range stockoplossing (µL) | Volume van 1:2000 fluorescente kleurstof (µL) | Eindconcentratie (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 50 |
| 50 | 50 | 100 | 25 |
| 90 | 10 | 100 | 5 |
| 98 | 2 | 100 | 1 |
| 100 | 0 | 100 | leeg |
Tabel 4: Protocol voor een lage-bereik standaard curve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gepresenteerde protocol beschrijft de generatie van NLps met hoge inkapseling werkzaamheid voor synthetisch gemodificeerde mRNA, evenals de betrouwbare transfectie van cellen in vitro. Bovendien is de NLps garanderen de vrijlating van mRNA, die op zijn beurt, is vertaald in een functioneel proteïne in de cellen. Bovendien, de transfections met behulp van NLps kan worden uitgevoerd in normale cel medium, wat resulteert in hoge cel viabilities tijdens transfectie en duren tot drie dagen na de transfectie.
Voor het gebruik van mRNA als een therapeutische, heeft zelf montage systeem voor de levering de voorkeur. De meest voorkomende transfectie reagentia omvatten kationische lipiden, met inbegrip van liposomen. Zoals liposomen positief geladen zijn, kan negatief geladen nucleic zuren worden ingekapseld in hen, waardoor de elektrostatische afstoting van celmembranen worden overwonnen35. De kationische lipide DC-cholesterol is al beschreven in eerdere studies als een stabiele en biocompatibel voertuig36. De toevoeging van de neutrale lipide DOPE leidt tot een verbeterde transfectie werkzaamheid37. Gelet op de geschetste voordelen vermeld hierboven, deze lipiden werden gekozen voor de bereiding van NLps. Bovendien, hebben vorige studies aangetoond dat het gebruik van deze twee lipiden over anderen beter te wijten aan een verhoogde cellulaire transfectie tarief met negatief geladen nucleïnezuren38 is.
Voor de succesvolle generatie van NLps en nanolipoplexes is het cruciaal voor extra aandacht besteden aan enkele van de stappen. De procedure van nanoliposome generatie moet worden uitgevoerd onder O2-vrij van de voorwaarden. De aanwezigheid van O2 tijdens de NLp-generatie kan leiden tot de afbraak van fosfolipiden en verminderde reproduceerbaarheid39. Bovendien, ondanks wijzigingen, mRNA is zeer gevoelig met betrekking tot afbraak via nucleasen. Vandaar, voor de rehydratatie van de lipide-film, het gebruik van RNase-vrije H2O is sterk aanbevolen om te voorkomen dat de aantasting van het mRNA tijdens de complexvorming. RNase-vrij voorwaarden moeten ook worden gezorgd voor de opslag van nanolipoplexes.
Bovendien kan de NLps aggregaten na verloop van tijd vormen vanwege de unstable thermodynamisch systeem. De invloed parameters omvatten opslagtemperatuur en oppervlakte last van de liposomen40. NLp aggregatie kan leiden tot de destabilisatie van het liposoom membraan en het risico van ongewenste mRNA release41, wat leidt tot slechte transfectie werkzaamheid en mRNA afbraak in de extracellulaire ruimte. Echter zoals eerder getoond, nanolipoplexes kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal zes maanden zonder aggregatie of verlies van transfectie werkzaamheid35.
Met behulp van liposomen als een drug carrier systeem, kunnen twee van de belangrijkste problemen van de drug levering worden opgelost. Liposomen de encapsulated drug behoeden voor degradatie en kunnen passief doel weefsels die een discontinue endotheel, zoals de lever of het beenmerg16 hebben. Voor de levering van therapeutische nucleic acids, parameters zoals deeltjesgrootte en inkapseling capaciteit zijn cruciaal voor de evaluatie en de mobiele opname van liposomaal voertuigen. Met name de grootte van de liposomen in de nanometerschaal maakt een interactie met de celmembraan42 en is daarmee belangrijk voor het in vivo later gebruik. Eerste plaats moet de liposomen klein genoeg zijn om te voorkomen dat de goedkeuring door de renale en hepatische systeem43. Ten tweede, de liposomen grootte moet bijdragen tot het overwinnen van de bloedvaten barrière te richten op de cellen van de gewenste orgel. Het was gemeld dat liposomen in de groottewaaier van 100-300 nm konden efficiënt transfect hepatocyten44; echter, grote en middelgrote liposomen (bijvoorbeeld400 nm) waren niet in staat om te overwinnen de endothelial barrière45.
Hoewel de beschreven methode is vastgesteld voor mRNA levering, kan het ook worden toegepast voor andere therapeutiek van nucleic zuur, zoals microRNA. In een recente studie, we laten zien dat microRNA 126 selectief kan worden gericht en, dus, de ontwikkeling van de abdominale aorta aneurysma kan effectief verhinderd46. Als de therapeutiek van de DNA/RNA bijwerkingen, zoals de activering van de bloedplaatjes, veroorzaken kan wanneer zij in direct contact met cellen komen, verpakking binnen liposomen kunt voorkomen dat dit, waardoor het verder voordelige47. Daarom is de methode die hier gepresenteerd is zeer veelzijdig en kan worden gebruikt voor het ontwerpen van de drug levering voor vele ziekten. De gangbaar protocol niet alleen staat de snelle en rendabele generatie van een efficiënte mRNA vervoerder met een gedefinieerde grootte maar biedt ook de mogelijkheid voor het aanpassen van het lipide formulering op basis van de behoeften van een bepaalde toepassing: (1) de grootte van de liposomen kunnen gemakkelijk worden veranderd door het veranderen van de filters; (2) de oppervlakte van de positief geladen liposomen kan worden gewijzigd met behulp van, bijvoorbeeld, Polyethyleenglycol, om stabiliteit en vertraging bloed goedkeuring tijdens in vivo toepassing48. De binding van specifieke antilichamen tegen de liposomen kunt de gerichte levering van de encapsulated drug49. Met verder onderzoek en een meer gedetailleerd inzicht in de fysische eigenschappen, kan het protocol nog worden verbeterd.
Voor de generatie van liposomen, drie veelgebruikte methoden beschikbaar zijn: de droge-film, de ethanol-injectie en de verdamping van de omgekeerde-fase. In de Yang et al. studie, deze drie fabricagetechnieken waren ten opzichte van35. Bleek dat liposomen met een gedefinieerde grootte en een gelijke verdeling in de oplossing kunnen worden gegenereerd met behulp van de methode droge-film. Bovendien, de droge-film procedure gevoerd in dit onderzoek heeft geleid tot de productie van NLps met een gedefinieerde grootte van 200 nm, een homogene verdeling en een hoge inkapseling capaciteit.
Aan de ene kant, de positieve lading van de liposomen leidt tot een verhoogde inkapseling capaciteit en betere cel oppervlakte fusion50,51,52, maar aan de andere kant, het kan destabiliseren de celmembraan en activeren verschillende immuunactivatie trajecten en27,53van de dood van de cel. Echter kunnen de apoptotic eigenschappen van kationische lipiden worden geminimaliseerd door gebruik te maken van de helper lipide DOPE54,55. In de studie van Zhang et al.bleek dat een verhouding van 1:2 van DC-cholesterol en DOPE tijdens liposoom generatie leidt tot de meest efficiënte cellulaire transfectie met behulp van nucleïnezuren38. In de methode die is geïmplementeerd in de huidige studie, de lipide-verhouding 1:2 DC-cholesterol en DOPE werd gebruikt in de gemengde lipide schorsing tijdens de voorbereiding van de film lipide en de bereid liposomen geleid tot hoge transfectie werkzaamheid en, tegelijkertijd, hoog cel levensvatbaarheid. Vergelijkbare resultaten werden ook gevonden door andere onderzoekers, zoals Ciani56 en Farhood37.
Globaal, liposomen zijn gebruikt voor jaren in klinische proeven, met grote biocompatibiliteit en lage toxiciteit in vivo. In combinatie met mRNA, kan NLps worden gebruikt voor de efficiënte levering van mRNA aan cellen of organen in vitro en in vivo, voor het opwekken van DOVO synthese van een gewenste eiwit. Ten aanzien van therapeutische toepassingen, kan nanolipoplexes worden gebruikt, bijvoorbeeld in de wond genezing patches voor transdermaal mRNA levering57 te activeren cel regeneratie, of als een spray voor de nebulization van mRNA58 voor de behandeling van longkanker ziekten59,60 zoals cystic fibrosis.
Het gepresenteerde protocol garandeert een gemakkelijke en toegankelijke manier voor het genereren van NLps met behulp van de methode van droge-film, die vervolgens kan worden gebruikt voor de efficiënte inkapseling van in vitro getranscribeerd mRNA en de veilige transfectie van cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Geen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
| (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
| 4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
| BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
| Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
| Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
| Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
| Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
| Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
| RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
| Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
| Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
| GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
| peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
| Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |
References
- Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don't shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
- Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
- Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
- Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
- Youn, H., Chung, J. -K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8 (2014).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
- Michel, T., Wendel, H. -P., Krajewski, S. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. Kormann, M. , IntechOpen. 3-20 (2016).
- Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
- Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
- Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
- Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
- Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
- Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
- Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
- Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
- Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
- Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
- Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
- Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
- Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
- Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497 (2011).
- Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
- Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
- Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943 (2014).
- Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
- Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
- Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
- Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
- Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
- Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
- Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
- Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
- Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H.
- Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. "In vivo" distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
- Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
- Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
- Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
- Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
- Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
- Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
- Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
- Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
- Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
- Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
- Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
- Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
- Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
- Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504 (2015).
- Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
