Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generation af kationiske Nanoliposomes til effektiv levering af In Vitro transskriberet Messenger RNA

Published: February 1, 2019 doi: 10.3791/58444
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 2,3, 1, 2,3, 1
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Clinical Research Laboratory, University Medical Center, 2Atherothrombosis and Vascular Biology, Baker Heart & Diabetes Institute, 3Department of Medicine, Monash University

Summary

Her beskriver vi en protokol for generation af kationiske nanoliposomes, som er baseret på metoden tør-film og kan bruges til sikker og effektiv levering af in vitro- transskriberet messenger RNA.

Abstract

Udviklingen af messenger RNA (mRNA)-baseret terapi til behandling af forskellige sygdomme bliver mere og mere vigtig på grund af positive egenskaber af in vitro transskriberet (IVT) mRNA. Ved hjælp af IVT mRNA, kan være fremkaldt de novo -syntesen af en ønskede protein uden ændring af målcellen fysiologiske tilstand. Derudover kan proteinsyntese styres netop på grund af forbigående effekten af IVT mRNA.

For den effektive Transfektion af celler, kan nanoliposomes (NLps) repræsenterer en sikker og effektiv levering køretøj for terapeutisk mRNA. Denne undersøgelse beskriver en protokol for at generere sikre og effektive kationiske NLps bestående af DC-kolesterol og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) som en levering vektor for IVT mRNA. NLps har en defineret størrelse, en homogen fordeling og en høj compleksering kapacitet og kan produceres ved hjælp af metoden tør-film. Desuden præsenterer vi forskellige testsystemer for at analysere deres kompleks og Transfektion efficacies ved hjælp af syntetiske forbedret grøn fluorescerende proteiner (eGFP) mRNA, samt deres effekt på cellernes levedygtighed. Samlet set giver præsenteres protokollen en effektiv og sikker tilgang til mRNA kompleks, som kan fremme og forbedre forvaltningen af terapeutiske mRNA.

Introduction

Brug af modificerede mRNA for terapeutisk anvendelse har vist stort potentiale i de sidste par år. I hjerte-kar-, provokerende og monogenetic sygdomme, samt i udviklingen af vacciner, er mRNA en lovende terapeutisk agent1.

Protein substitutionsterapi med mRNA tilbyder flere fordele i forhold til den klassiske genterapi, som er baseret på DNA Transfektion i target celler2. Funktionen mRNA indleder direkte i cytosol. Selvom plasmid DNA (pDNA), en konstruktion af dobbelt-strenget, cirkulært kan DNA indeholdende en promotor-regionen og en gensekvens, kodning den terapeutiske protein3, også handlinger i cytosol, det kun indgå i celler, som går gennem mitosen på tidspunktet for Transfektion. Dette reducerer antallet af transfekteret celler i væv1,4. Specifikt er Transfektion af væv med svag mitose aktivitet, såsom hjerte celler, vanskeligt5. I modsætning til pDNA forekomme Transfektion og oversættelse af mRNA i mitotiske og ikke-mitotiske celler i væv1,6. Viral integration af DNA i host-genom kan komme med mutagene virkninger eller immun reaktioner7,8, men efter Transfektion af celler med en protein-kodning mRNA, de novo -syntesen af det ønskede protein starter autonomt9,10. Derudover kan proteinsyntese justeres præcist til patientens behov gennem individuelle doser, uden at gribe ind i genomet og risikere mutagene virkninger11. Den immun aktivering potentiale af syntetisk genererede mRNA kunne sænkes drastisk ved hjælp af pseudo-uridine og 5'-methylcytidine i stedet for uridine og cytidine12. Pseudo-uridine modificerede mRNA har også vist sig at have en øget biologiske stabilitet og en betydeligt højere translationel kapacitet13.

For at kunne drage fordel af de lovende egenskaber af mRNA-baseret terapi i kliniske anvendelser, er det vigtigt at skabe et passende køretøj til transport af mRNA ind i cellen. Dette køretøj skal være forsynet med ikke-toksiske egenskaber i in vitro og i vivo, beskytte mRNA mod nukleasen-nedbrydning og give tilstrækkelig cellulære optagelse for en langvarig ledighed og oversættelse af mRNA14.

Blandt alle mulige carrier typer for i vivo drug delivery, såsom kulstof-nanorør, quantum dots og Liposomer, sidstnævnte har været studeret mest15,16. Liposomer er vesikler bestående af en lipid tolagede10. De er amphiphilic med en hydrofob og en hydrofil sektion, og gennem selvstændig ordningen af disse molekyler, en sfærisk dobbelt lag er dannet17. Inde i Liposomer, kan terapeutiske agenter eller narkotika være indkapslet og dermed beskyttet mod Enzymatisk nedbrydning18. Liposomer som indeholder N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chlorid (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propan] (DOTAP)20, og dioctadecylamidoglycylspermine (hunde)21, eller DC-kolesterol22, er godt præget og ofte benyttes til cellulære Transfektion med DNA eller RNA.

Kationiske Liposomer består af et positivt ladede lipid og et tomt phospholipid23. Transfektion via kationiske Liposomer er en af de mest almindelige metoder til transport af nukleinsyrer i celler24,25. Kationiske lipid partikler danner komplekser med negativt ladede fosfat-grupper i rygraden i nukleinsyre molekyler26. Disse såkaldte lipoplexes tillægger overfladen af cellemembranen og komme ind i cellen via endocytose eller endocytose-lignende-mekanismer27.

I 1989, Malone mfl. korrekt beskrevet kationiske lipid-medieret mRNA Transfektion28. Men ved hjælp af en blanding af DOTMA og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), gruppen fandt at DOTMA manifesteret cytotoksiske virkninger28. Derudover viste Zohra et al. , at DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammoniumformiat-propan chlorid) kan bruges som et mRNA Transfektion reagens29. For den effektive Transfektion af celler, bør DOTAP anvendes i kombination med andre reagenser, såsom fibronektin29 eller DOPE30. Hidtil har var DOTMA den første kationiske lipid på markedet anvendes til gen levering31. Andre lipider er brugt som terapeutisk luftfartsselskaber eller testes i forskellige stadier af kliniske forsøg, (f.eks. EndoTAG-I, som indeholder DOTAP som lipid transportør), undersøges i øjeblikket i et fase II kliniske forsøg32.

Dette arbejde beskriver en protokol for generation af NLps indeholdende DC-kolesterol og DOPE. Denne metode er nem at udføre og giver mulighed for generation af NLps i forskellige størrelser. Det generelle mål med NLp generation ved hjælp af metoden tør-film er at skabe Liposomer til mRNA kompleks, således at effektiv og biokompatible celle Transfektion in vitro-14,33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generation af kationiske Nanoliposomes (figur 1)

  1. Opløse lipider DC-kolesterol (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] kolesterol hydrochlorid) og DOPE (dioleoyl phosphatidylethanolamin), leveres som et pulver i chloroform at opnå en endelig koncentration på 25 mg/mL.
    Bemærk: Gemme de opløste lipider ved-20 ° C.
  2. Arbejde med 25 mg/mL stamopløsning af både lipider. Mix 40 µL af den opløste DC-kolesterol og 80 µL af den opløste DOPE i et glas kolbe.
    Bemærk: Det samlede lipid beløb er 3 mg. For at undgå hurtig fordampning af chloroform, placere lipider på isen under pipettering.
  3. Fordampe chloroform i 15 min. under et argon gasflow. Efterfølgende udfylde en ekssikkator med silica gel, kolben åbent glas inde og anvende et vakuum natten over for at sikre, at de resterende chloroform er fordampet, og et lipid film er dannet inde glas kolbe.
    Bemærk: Arbejde hurtigt og undgå unødvendige O2 kontakt.
  4. Rehydrere dannede lipid film med 1 mL af nukleasen-gratis vand og vortex suspension for 15 min (figur 2A). Bagefter, placere suspensionen i en sonikering bad for 1 h (figur 2B).
    Bemærk: Suspension vil være lidt overskyet.
  5. Samle mini ekstruder ifølge fabrikantens anvisninger, Fyld en sprøjte med lipid suspension, og placere den fyldte sprøjte og en tomme sprøjte på begge sider af ekstruder. Tryk på lipid suspension gennem membran fra en sprøjte til den anden, 20 x-25 x, til at presse suspension (figur 2 c).
    Bemærk: Størrelsen af NLps bestemmes af porestørrelse af membranen anvendes.
  6. Gemme NLps i et glas kolbe ved 4 ° C indtil videre anvendelse.
    Bemærk: Efter længere tids opbevaringstid, NLps bør placeres i sonikering bad igen i 15 min. ved 35 kHz at omgå kompleks dannelse.

2. in Vitro transskription af syntetiske mRNA

  1. Forberede eGFP-encoding mRNA efter protokollen offentliggjort tidligere34.
  2. Forstærke eGFP sekvens fra plasmid med 0,7 µM af fremad (5'-TTG GAC FTT KBRT ACA GAA GCT AAT ACG-3') og omvendt (5'-T120 CTT CTT ACT CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3') primere og polymerasen kit med PCR.
    1. Bland 20 µL af en kommerciel stødpudeopløsning, som ændrer den smeltende opførsel af DNA (Table of Materials), samt 20 µL af 5 x mix fra polymerase kit. Tilføje 7 µL af hver (forward og reverse) primer.
    2. Tilføj 25 ng af eGFP plasmid til blandingen og 2 µL af polymerase fra polymerase kit.
      Bemærk: Hold polymerase på is før pipettering det til løsningen.
    3. Tilføje nukleasen-fri H2O til blandingen op til et volumen på 100 µL.
    4. Køre PCR-cykler i thermocycler efter protokollen i tabel 1.
  3. Rense eGFP-kodning DNA sekvens med PCR rensning kit.
    1. Derfor, bland PCR løsning med 500 µL af binding buffer fra kit og bruge det til at fylde rensning kolonner.
    2. Centrifugeres kolonner ved maksimal hastighed i 1 minut og kassér filtratet.
    3. Tilføje 750 µL af wash buffer I til kolonnen, centrifugeres igen ved maksimalt hastighed i 1 minut, og kassér filtratet.
    4. Gentag trinnet centrifuge 1 x at fjerne bufferen fra filteret kolonne.
    5. Overfør kolonnen til et frisk 1,5-mL-rør.
    6. Tilføj 20 µL af nukleasen-fri H2O til kolonnen, inkuberes i 1 min., og der centrifugeres i 1 minut ved maksimal hastighed. Gentag dette trin.
    7. Måler koncentrationen af DNA med et fotometer og opbevar den ved-20 ° C.
    8. Udføre DNA kvalitetsmålinger ved hjælp af gelelektroforese. Der tilsættes 0,5 g Agarosen i Tris-Borat-EDTA (TBE) buffer og varme det i mikroovnen på høj varme, indtil Agarosen er fuldstændigt opløst.
    9. Tilføje 5 µL af gel-farvning løsning til den flydende agarosegelelektroforese, fylde løsningen ind i gel kammeret og vente, indtil polymeriserede gel.
    10. Mix 200 ng af DNA med 2 µL af 6 x lastning farvestof og fyld den op til en ende volumen af 12 µL. der afpipetteres en DNA ladder, såvel som DNA-prøve, i gel brønde og køre elektroforese for 1 h på 100 V.
    11. Analysere gel ved hjælp af en analyse af gel station i UV-lys.
  4. Køre i vitro transskription for at generere mRNA fra DNA-sekvens med en in vitro- transskription kit indeholdende T7-polymerase og erstatte de modificerede nukleotider UTP og CTP med Ψ-UTP og methyl-CTP.
    1. Bland ingredienserne efter tabel 2for in vitro- transskription.
      Bemærk: Erstat 1,5 µL af methyl-CTP med 1:10 Cy3-CTP fortyndet i nukleasen-fri H2O under in vitro- transskription af eGFP mRNA at opnå Cy3-mærkning af mRNA.
    2. Inkuber IVT mastermix i 4 timer ved 37 ° C.
    3. Tilføj 1 µL af DNase jeg fra T7-polymerase kit og Inkuber den i 15 min. ved 37 ° C til at fordøje skabelonen DNA.
  5. For at rense mRNA, bruge RNA oprensning kit.
    1. Fylde IVT mix til omfanget af 100 µL med nukleasen-fri H2O.
    2. Tilføje 350 µL lysisbuffer og bland af pipettering op og ned.
    3. Tilsæt 250 µL af 100% ethanol og bland igen. Der afpipetteres mix i kolonnerne oprydning.
    4. Der centrifugeres i 15 s på 8.000 x g og kassér filtratet.
    5. Tilsæt 500 µL af vask buffer i en kolonne, der centrifugeres igen i 15 s på 8.000 x g, og fjern filtratet.
    6. Vaske kolonnen 1 x med 500 µL af wash buffer og centrifugeres i 2 min på 8.000 x g.
    7. Flytte kolonnen til en frisk 1,5 mL reaktion tube. Elueres mRNA 2 x af en 1-min inkubation af 20 µL af nukleasen-fri H2O på kolonne membran, efterfulgt af en 1-min centrifugering ved maksimal hastighed.
  6. Fjern fosfat-grupper fra mRNA ved hjælp af en dephosphorylation kit. Tilføje 4,5 µL af 10 x fosfatase buffer og 1 µL af fosfatase til mRNA og Inkuber i 1 time ved 37 ° C.
  7. Rense mRNA igen, efter trin 2.5.1 - 2.5.7.
  8. Måle mRNA samråd med et fotometer.
  9. Bruge gelelektroforese til at analysere renheden og størrelsen af mRNA. Derfor forberede en agarosegel som beskrevet i trin 2.3.9 - 2.3.10.
    1. Mix 3.3 µL af formamid, 1 µL af 37% formaldehyd, 1 µL af 10 x mænd og 1,7 µL af 6 x lastning farvestof med 200 ng af mRNA og fyld den op til 10 µL med nukleasen-fri H2O for hver stikprøve og RNA markør.
    2. Inkuber mix i 10 min. ved 65 ° C til mRNA denaturering. Indlæse wells af gel med mRNA og RNA markør og køre gel for 1 h på 100 V.
    3. Analysere gel ved hjælp af en gel doc station med UV-lys.

3. compleksering af syntetiske mRNA

  1. Optø den syntetiske mRNA på is, vortex det, og der centrifugeres kort før åbning af røret.
  2. Mix 10 µL af syntetiske mRNA (mRNA koncentration er 100 ng/µL) med 1 µL, 2,5 µL, 5 µL, 10 µL eller 20 µL af NLp suspension (NLp koncentration er 3 mg/mL). Centrifugeres kort og Ruger i 20 min. ved stuetemperatur (RT) for nanolipoplex dannelse.
    Bemærk: Må ikke blandes af pipettering. Dette kan føre til tab af volumen. Vortex kort tid til en grundig blanding.
  3. Der tilsættes 1 mL af regelmæssige celle medium til nanolipoplexes og bland dem af pipettering op og ned.

4. analyse af Nanoliposomes effektivitet, indkapsling

  1. For at udføre indkapsling eksperimenter, bruge RNA kvantificering kit.
  2. Forberede brugsopløsning ved fortynding af fluorescerende farvestof 1:200 for en høj-range og 1:2,000 for en laveste assay.
    Bemærk: Optø den fluorescerende farvestof på is. Forberede brugsopløsning umiddelbart før brug.
  3. Forberede de høj-range og laveste standard kurver ved hjælp af 1 mL af en 2 µg/mL stamopløsning af eGFP mRNA i nukleasen-fri H2O.
    Bemærk: For standard kurver, bruge det mRNA, der skal bruges i indkapsling eksperimenter.
  4. Brug tabel 3 for udarbejdelsen af høj-range standard (20 ng/mL - 1 µg/mL).
  5. For den laveste standard, fortyndes 2 µg/mL eGFP mRNA stamopløsning 1:20 for at opnå en endelig koncentration på 100 ng/mL. Forberede en laveste standard (1 ng/mL - 50 ng/mL), som beskrevet i tabel 4.
  6. Kombiner 1 µg for eGFP mRNA (10 µL) og 7,5 µg NLps (2,5 µL) og Ruger i 20 min. på RT.
    Bemærk: Hold mRNA på is for at undgå nedbrydning.
  7. Der tilsættes 1 mL af nukleasen-fri H2O form nanolipoplexes og blanding af pipettering op og ned.
  8. Der tilsættes 1 mL af 1:200 eller 1:2,000 RNA fluorescerende farvestof brugsopløsning til indkapslede prøver og standarder og Inkuber i 5 min på RT i mørke.
  9. Der afpipetteres standarder og prøver i dubletter i en sort 96-brønd plade og måle fluorescens på 530 nm på en mikrotiterplade læser (figur 3).

5. forberedelse af celler til Transfektion

  1. Plade 1,5 x 105 A549 celler/brønd af et 12-godt plade 1 d før Transfektion.
  2. Inkuber cellerne ved 37 ° C og 5% CO2 i regelmæssig celle medium (DMEM/høje glukose med 10% føtal bovint serum [FBS], 2 mM L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin) i 24 timer før Transfektion.

6. Transfektion af celler

  1. Vaske den forberedte celler 1 x med 1 mL/hul PBS (uden Ca2 +/Mg2 +).
  2. Der tilsættes 1 mL af rede nanolipoplex blanding, der indeholder 1 µg for eGFP mRNA indkapslet i 1-µL, 2,5-µL, 5 µL, 10 µL eller 20 µL NLps, at et godt forberedt pladens med A549 celler.
  3. Tilføj nanolipoplex suspension til cellerne og inkuberes ved almindelige betingelser for 24 timer til at analysere Transfektion virkning, eller for 24 og 72 timer til at analysere cellernes levedygtighed efter Transfektion.
    Bemærk: Transfektion med NLps kræver ikke en mellemlang ændring.

7. analyse af celle Transfektion effektivitet ved hjælp af flowcytometri og Fluorescens mikroskopi

  1. Fjern supernatanten og cellerne vaskes med 1 mL/godt PBS (uden Ca2 +/Mg2 +) til at fjerne de resterende NLps.
  2. Forberede flowcytometri cellerne.
    1. Trypsinize celler med 500 µL/brønd trypsin/EDTA (0,05%) ved 37 ° C i 3 min. Stop processen og inaktivere trypsin ved at tilføje den samme mængde (500 µL/brønd) regelmæssig FBS-holdige medium.
    2. Centrifugeres celler i 5 min på 400 x g og fjern forsigtigt supernatanten uden at røre den celle pellet.
    3. Cellerne vaskes med 1 mL PBS (uden Ca2 +/Mg2 +).
    4. Resuspend celler i 300 µL 1 x fiksering løsning og overføre cellerne i flow flowcytometri rør.
    5. Analysere celler på 488 nm i en flow forskellige (figur 4A).
      Bemærk: Vortex celler 1 x direkte før måling.
  3. Forberede cellerne til fluorescens mikroskopi.
    1. Fix cellerne med 1 mL/godt 100% methanol, der var tidligere opbevares ved-20 ° C.
    2. Tilføje 500 µL/brønd 300 nM DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole) opløses i PBS (uden Ca2 +/Mg2 +) og Inkuber i 5 min. i mørke.
    3. Fjerne DAPI løsning og cellerne vaskes igen med 100% methanol opbevares ved-20 ° C.
    4. Analysere celler ved hjælp af et fluorescens mikroskop (figur 4B).
      Bemærk: Brug de følgende excitation/emission bølgelængder: eGFP 488/509 nm, DAPI 358/461 nm og Cy3 550/570 nm.

8. celle levedygtighed Assay

  1. 5 mg af MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) opløses i 1 mL af RPMI (uden phenol rød).
    Bemærk: Den opløste MTT skal blive yderligere fortyndet 1:10 (endelig koncentration: 0,5 mg/mL) i RPMI før brug.
  2. Vask de transfected celler 3 x med 1 mL/hul PBS (uden Ca2 +/Mg2).
    Bemærk: Resterne af den regelmæssige celle medium bør helt fjernet.
  3. Tilsættes 500 µL/brønd af 1:10 fortyndet MTT løsning til cellerne og Inkuber i 4 timer ved 37 ° C.
  4. Fjern MTT løsning fra celler efter inkubation og tilsæt 500 µL/brønd DMSO (dimethylsulfoxid). Inkuber igen i 10 minutter ved 37 ° C.
  5. Afpipetteres DMSO løsning i trillinger i en klar-96-brønd bundplade og måle adsorption ved 540 nm med en mikrotiterplade læser.
  6. Indstille cellen ubehandlet levedygtighed på 100% og beregne cellernes levedygtighed for de andre grupper i forhold til ubehandlet kontrol celler (figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af protokollen som beskrevet, blev NLps bestående af lipider DC-kolesterol og DOPE udarbejdet ved hjælp af metoden tør-film (figur 1). Under forberedelsen viser nanoliposome løsning forskellige stadier i turbiditet (figur 2).

Indkapsling effekten af NLps kan derefter analyseres efter indkapsling af 1 µg for eGFP-kodning mRNA ved at analysere den gratis mængden af mRNA, som ikke blev indkapslet, ved hjælp af RNA kvantificering kit (figur 3).

Efter indkapsling af eGFP mRNA i forskellige mængder af NLps, den dannede nanolipoplexes kan sættes i varmeskab med celler kan in vitro- og procentdelen af eGFP-udtrykker celler analyseres ved hjælp af flow flowcytometri 24 h posttransfection (figur 4A) . Selv 1 µL af nanoliposome løsning er tilstrækkelig til at opnå en høj Transfektion af celler in vitro. Når cellerne er transfekteret med NLps indeholdende Cy3-mærket eGFP mRNA, tilstedeværelsen af eGFP mRNA i cytoplasma (rød fluorescens), samt de allerede producerede eGFP protein (grøn fluorescens) kan være visualiseret (figur 4B).

Da Transfektion af celler ved hjælp af nanolipoplexes kan have negative effekter på cellerne, levedygtigheden af cellerne blev testet 24 h (figur 5A) og 72 h (figur 5B) posttransfection. Ingen virkninger på cellernes levedygtighed kan påvises, når cellerne blev behandlet med 2,5 eller 5 µL af NLps eller nanolipoplexes, henholdsvis.

Figure 1
Figur 1: skematisk oversigt over fremstillingen af kationiske nanoliposomes. Først, de opløste lipider DC-kolesterol og DOPE bør blandes sammen i en glas kolbe. Det andet synlige chloroform væske skal være fordampet under argon eller nitrogen gasflow og chloroform rester skal have lov til at fordampe natten over i vakuum. Tredje, dannede lipid filmen på bunden af glas kolbe bør være rehydreret med nukleasen-fri H2O, efterfulgt af vortexing til at danne multilamellar Liposomer. Gennem ultralydbehandling og ekstrudering af Liposom løsning, klar-til-brug unilamellar NLps er produceret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: nanoliposome løsningen i forskellige stadier i produktionsfasen. (A) denne figur viser Liposom løsning direkte efter rehydrering af lipid film og vortexing for 15 min samt (B) efter 1 time i en sonikering bad (C) efterfulgt af 25 cyklusser af ekstrudering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: indkapsling effekten af nanoliposomes. Dette panel viser kvantificering af gratis eGFP mRNA efter indkapsling i NLps. Resultaterne er præsenteret som middel ± SEM (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Transfektion effekten af nanolipoplexes. (A) dette panel viser bestemmelse af Transfektion ved hjælp af forskellige mængder af NLps for at indkapsle 1 µg for eGFP mRNA 24 h posttransfection bedste mRNA/nanoliposome ratio. (B) dette panel viser påvisning af Cy3-mærket syntetiske mRNA indkapslet i 2,5 µL NLps og eGFP udtryk i celler 24 h posttransfection (skalalinjen = 50 µm). Resultaterne er præsenteret som middel ± SEM (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: cellernes levedygtighed efter Transfektion med nanoliposomes og indkapslet mRNA. Dette panel viser måling af cellers levedygtighed ved hjælp af en MTT assay (A) 24 h og (B) 72 h posttransfection. Resultaterne er præsenteret som middel ± SEM (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Trin Temperatur i ° C Varighed
1 95 5 min
2 94 15 s
3 55 1 min
4 72 1 min
5 Gå til 2 30 x
6 72 10 min
7 4 hold

Tabel 1: PCR cyklus protokol til DNA amplifikation.

Koncentration Beløb
ATP 7,5 mM 4 ΜL
GTP 1,875 mM 1 ΜL
5'-Methylcytidin 7,5 mM 3 ΜL
Ψ 7,5 mM 3 ΜL
ARCA 2,5 mM 10 ΜL
DNA-skabelon 1,5 µg
Buffer mix 1 x 4 ΜL
T7 enzym mix 4ΜL
RNase-hæmmer 1 ΜL
Nukleasen-frit vand Fyld op til 40 µL

Tabel 2: Mix til den in vitro- transskription af DNA til mRNA.

Volumen af nukleasen-fri H2O (µL) Volumen af eGFP mRNA høj-range stamopløsning (µL) Volumen af 1:200 fluorescerende farvestof (µL) Endelig koncentration (ng/mL)
0 100 100 1000
50 50 100 500
90 10 100 100
98 2 100 20
100 0 100 Tom

Tabel 3: Protokol for en høj-range standardkurve.

Volumen af nukleasen-fri H2O (µL) Volumen af eGFP mRNA laveste stamopløsning (µL) Bind 1: 2000 fluorescerende farvestof (µL) Endelig koncentration (ng/mL)
0 100 100 50
50 50 100 25
90 10 100 5
98 2 100 1
100 0 100 Tom

Tabel 4: Protokol for en laveste standardkurve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den præsenterede protokol beskriver generation af NLps med høj indkapsling effekten for syntetisk modificerede mRNA, samt den pålidelige Transfektion af celler i vitro. Desuden, NLps sikre frigivelsen af mRNA, som til gengæld er oversat til en funktionel proteiner inde i cellerne. Derudover transfections ved hjælp af NLps kan udføres i regelmæssig celle medium, resulterer i høj celle viabilities under Transfektion, og vare op til tre dage efter Transfektion.

For at bruge mRNA som en terapeutisk, er selvstændige montering system for levering at foretrække. De mest almindelige Transfektion reagenser omfatter kationiske lipider, herunder Liposomer. Som Liposomer er positivt ladede, kan negativt ladede nukleinsyrer indkapslet i dem, således at elektrostatiske tilbagevisningen af cellemembraner skal overvinde35. Kationiske lipid DC-kolesterol er allerede blevet beskrevet i tidligere undersøgelser som en stabil og biokompatible køretøj36. Tilføjelsen af de neutrale lipid DOPE fører til en forbedret Transfektion effekten37. I betragtning af de skitserede fordele nævnt ovenfor, disse lipider blev valgt for udarbejdelsen af NLps. Derudover har tidligere undersøgelser vist, at brugen af disse to lipider er at foretrække frem for andre på grund af en øget cellulær Transfektion sats med negativt ladede nukleinsyrer38.

For den succesfulde generation af NLps og nanolipoplexes er det kritisk at være ekstra opmærksom på nogle af trinnene. Proceduren nanoliposome generation bør gennemføres under O2-fri betingelser. Tilstedeværelsen af O2 under NLp generation kan føre til nedbrydning af fosfolipider og reduceret reproducerbarhed39. Desuden, trods ændringer, mRNA er meget følsomme med hensyn til nedbrydning gennem nukleaser. Derfor, for rehydrering af lipid film, brug af RNase-fri H2O anbefales kraftigt at forhindre mRNA forringelse under kompleks. RNase-fri betingelser bør også sikres til opbevaring af nanolipoplexes.

Derudover kan NLps danne aggregater over tid på grund af den ustabile termodynamisk system. Indflydelse parametre omfatter opbevaringstemperatur og overflade afgift af Liposomer40. NLp aggregering resultere i destabiliseringen af Liposom membran og risikoen for uønskede mRNA frigive41, fører til dårlig Transfektion effektivitet og mRNA nedbrydning i det ekstracellulære rum. Dog, som tidligere vist, nanolipoplexes kan opbevares ved 4 ° C i op til seks måneder uden sammenlægning eller tab af Transfektion effekten35.

Ved at bruge Liposomer som et lægemiddel carrier system, kan to af de centrale problemer af medicinafgivelse løses. Liposomer beskytte den indkapslede stof mod nedbrydning og er i stand til passivt målvæv, der har en diskontinuerlig endotel, som lever eller knoglemarv16. For levering af terapeutiske nukleinsyrer, parametre såsom partikelstørrelse og indkapsling kapacitet er kritisk for evaluering og cellulære optagelse af liposomal køretøjer. Især, størrelsen af Liposomer i nanometer skala giver mulighed for interaktion med celle membranen42 og er dermed vigtige for i vivo brugen senere. Først, Liposomer skal være lille nok til at undgå clearance gennem den renale og hepatiske system43. For det andet bør Liposom størrelse bidrage til at overvinde de blodkar barriere for at målrette cellerne i det ønskede orgel. Det blev rapporteret, at Liposomer i størrelsesområde for 100-300 nm var i stand til effektivt transfect hepatocytter44; dog store Liposomer (fx400 nm) ikke var i stand til at overvinde de endotel barriere45.

Selv om den beskrevne metode er blevet etableret til mRNA levering, kan den også gennemføres for andre nukleinsyre therapeutics, såsom microRNA. I en nylig undersøgelse viste vi at microRNA 126 kan målrettes selektivt, og derfor udviklingen af abdominale aortaaneurismer kunne være effektivt forhindret46. Da DNA/RNA therapeutics kan forårsage bivirkninger, såsom trombocyt aktivering, når de kommer i direkte kontakt med cellerne, kan emballage i Liposomer undgå dette, hvilket gør det yderligere fordelagtige47. Derfor, metoden præsenteres her er meget alsidig og kan bruges til at designe medicinafgivelse for mange sygdomme. Den etablerede protokol ikke kun giver mulighed for hurtig og omkostningseffektiv generation af en effektiv mRNA carrier med en defineret størrelse, men tilbyder også mulighed for at tilpasse lipid formuleringen efter behov i et bestemt program: (1) størrelsen af den Liposomer kan nemt ændres ved at ændre filtre; (2) de positivt ladede Liposomer overflade kunne ændres ved at bruge, for eksempel, polyethylenglycol, for at øge stabiliteten og forsinkelse blod clearance under i vivo ansøgning48. Bindingen af specifikke antistoffer mod Liposomer tillader målrettet levering af indkapslede drug49. Med yderligere undersøgelse og en mere detaljeret indsigt i de fysiske egenskaber, kan protokollen stadig forbedres.

For generation af Liposomer, tre fælles metoder er tilgængelige: tør-film, ethanol injektion og omvendt-fase fordampning. I Yang mfl. undersøgelse, disse tre fremstillingsteknikker blev sammenlignet med35. Det konstateredes, at Liposomer med en defineret størrelse og en ligelig fordeling i løsningen kan genereres ved hjælp af metoden tør-film. Derudover tør-film procedure gennemført i denne undersøgelse resulterede i produktionen af NLps med en defineret størrelse på 200 nm, en homogen fordeling og en høj indkapsling kapacitet.

På den ene side den positive ladning af Liposomer fører til en øget indkapsling kapacitet og bedre celle overflade fusion50,51,52, men på den anden side det kan destabilisere cellemembranen og aktivere forskellige immun aktivering veje og celle død27,53. Dog kan de apoptotiske egenskaber af kationiske lipider minimeres ved hjælp af helper lipid DOPE54,55. I undersøgelsen af Zhang et al.konstateredes det, at forholdet 1:2 af DC-kolesterol og DOPE under Liposom generation fører til den mest effektive cellulære Transfektion ved hjælp af nukleinsyrer38. I metoden gennemføres i den nuværende undersøgelse, lipid forholdet 1:2 DC-kolesterol og DOPE blev brugt i blandet lipid suspension under lipid film forberedelse, og de forberedte Liposomer førte til høj Transfektion effektivitet og samtidig, højt celle levedygtighed. Lignende resultater blev også fundet af andre forskere, som Ciani56 og Thomass37.

Samlet set har Liposomer været brugt i årevis i kliniske forsøg, viser stor biokompatibilitet og lav toksicitet in vivo. I kombination med mRNA, kunne NLps bruges til effektiv levering af mRNA til celler eller organer i in vitro og i vivo, til at fremkalde de novo syntesen af en ønskede protein. Med hensyn til terapeutisk anvendelse, kunne nanolipoplexes anvendes, for eksempel i sår healing patches for transdermal mRNA levering57 at aktivere celle regenerering, eller som en spray til nebulization af mRNA58 til helbredelse af lunge sygdomme59,60 såsom cystisk fibrose.

Præsenteres protokollen garanterer en let og tilgængelig måde for generation af NLps ved hjælp af metoden tør-film, som derefter kan bruges til effektiv indkapsling af in vitro transskriberet mRNA og den sikker Transfektion af celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Ingen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) AppliChem, Darmstadt, Germany A2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) Avanti, Alabama, USA 700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany D1306
BD FACScan system BD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 340181
Chloroform Merck, Darmstadt, Germany 102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO) Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany 20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) Avanti, Alabama, USA 850725
Fluorescence microscope Zeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11668019
Mini extruder Avanti, Alabama, USA
Nuclease-free water Qiagen, Hilden, Germany 129114
Opti-Mem Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany Q33140
RPMI (w/o phenol red) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11835030
Silica gel Carl Roth, Karlsruhe, Germany P077
Trypsin/EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 25300054
HotStar HiFidelity Polymerase Kit Qiagen, Hilden, Germany 202602
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden, Germany 28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		 TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1014
Cyanine 3-CTP PerkinElmer, Baesweiler, Germany NEL580001EA
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany AM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog New England Biolabs, Ipswich, USA S1411L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs, Ipswich, USA M0289S
Agarose Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 16500-500
GelRed Biotium, Fremont, USA 41003
peqGOLD DNA ladder mix VWR, Pennsylvania, USA 25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder Fisher Scientific, Göteborg,
Sweden		 11528766

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
  2. Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
  3. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
  4. Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don't shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
  5. Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
  6. Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
  7. Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
  8. Youn, H., Chung, J. -K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
  9. Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8 (2014).
  10. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
  11. Michel, T., Wendel, H. -P., Krajewski, S. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. Kormann, M. , IntechOpen. 3-20 (2016).
  12. Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  13. Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
  14. Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
  15. Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
  16. Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
  17. Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
  18. Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
  19. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  20. Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
  21. Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
  22. Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
  23. Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
  24. Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
  25. Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
  26. Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
  27. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
  28. Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
  29. Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
  30. Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
  31. Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497 (2011).
  32. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  33. Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
  34. Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943 (2014).
  35. Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
  36. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
  37. Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
  38. Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
  39. Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
  40. Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
  41. Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
  42. Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
  43. Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience Reports. 22 (2), 197-224 (2002).
  44. Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. "In vivo" distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
  45. Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
  46. Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
  47. Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
  48. Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
  49. Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
  50. Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
  51. Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
  52. Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
  53. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
  54. Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
  55. Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
  56. Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
  57. Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
  58. Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504 (2015).
  59. Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
  60. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 144 mRNA nanoliposomes DOPE DC-kolesterol indkapsling Transfektion levering therapeutics
Generation af kationiske Nanoliposomes til effektiv levering af <em>In Vitro</em> transskriberet Messenger RNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Michel, T., Link, A., Abraham, M.… More

Michel, T., Link, A., Abraham, M. K., Schlensak, C., Peter, K., Wendel, H. P., Wang, X., Krajewski, S. Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA. J. Vis. Exp. (144), e58444, doi:10.3791/58444 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter