Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Generation der kationischen Nanoliposomes, basiert auf der Methode der trocken-Film und eignet sich für die sichere und effiziente Bereitstellung von in-vitro- Boten-RNA transkribiert.
Abstract
Die Entwicklung der Boten-RNA (mRNA)-basierten Therapeutika für die Behandlung von verschiedenen Krankheiten mehr und mehr an Bedeutung aufgrund der positiven wird Eigenschaften von in Vitro (IVT) mRNA transkribiert. Mit Hilfe von IVT mRNA kann die de-Novo -Synthese des gewünschten Proteins induziert werden, ohne den physiologischen Zustand der Zielzelle. Darüber hinaus kann Protein-Biosynthese durch die vorübergehende Wirkung der IVT mRNA exakt gesteuert werden.
Für die effiziente Transfektion von Zellen kann Nanoliposomes (NLps) eine sichere und effiziente Transportvehikel für therapeutische mRNA darstellen. Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur sicheren und effizienten kationischen NLps bestehend aus DC-Cholesterin und 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (Schmiere) als Lieferung Vektor für IVT mRNA zu generieren. NLps haben eine definierte Größe, eine homogene Verteilung und eine hohe Komplexierung Kapazität und kann mit der trocken-Film-Methode erzeugt werden. Darüber hinaus präsentieren wir unterschiedliche Testsysteme zu analysieren, ihre Komplexierung und Transfektion Ähnlichkeit mit synthetischen verstärkt grünes fluoreszierendes Protein (eGFP) mRNA, sowie ihre Auswirkungen auf die Zellviabilität. Insgesamt bietet der vorgestellte Protokoll einen effektiven und sicheren Zugang für mRNA Komplexierung, die Weiterentwicklung und Verbesserung die Verwaltung des therapeutischen mRNA kann.
Introduction
Die Verwendung von modifizierten mRNA für therapeutische Anwendungen hat großes Potenzial in den letzten Jahren gezeigt. In Herz-Kreislauf-, Entzündungs- und monogenetischen Krankheiten, sowie bei der Entwicklung von Impfstoffen ist mRNA eine vielversprechende therapeutische Mittel1.
Protein-Ersatz-Therapie mit mRNA bietet mehrere Vorteile gegenüber der klassischen Gentherapie, die auf DNA-Transfektion in die Ziel-Zellen2basiert. Die mRNA-Funktion startet direkt in das Zytosol. Obwohl das Plasmid DNA (pDNA), ein Konstrukt der doppelsträngigen, Rundschreiben kann DNA mit einem Promotor-Region und die Sequenz eines Gens, die Codierung der therapeutische Protein3, auch Handlungen im Zytosol, es nur in Zellen aufzunehmen die Mitose durchlaufen zum Zeitpunkt der Transfektion. Dies reduziert die Anzahl von transfizierten Zellen im Gewebe1,4. Insbesondere ist die Transfektion von Geweben mit schwachen Mitose Aktivität, z. B. Herzzellen, schwieriges5. Im Gegensatz zu pDNA treten die Transfektion und Übersetzung von mRNA in mitotischen und nicht mitotischen Zellen im Gewebe1,6. Die virale Integration von DNA in das Wirtsgenom kann mit mutagenen Effekte oder Immunreaktionen7,8, aber nach der Transfektion von Zellen mit einer Protein-Codierung mRNA, die de-Novo -Synthese des gewünschten Proteins kommen. startet autonom9,10. Darüber hinaus kann die Proteinsynthese genau auf den Patienten müssen durch Einzeldosen, ohne zu stören das Genom und riskieren mutagenen Effekte11eingestellt werden. Das Immunsystem aktivierende Potential der synthetisch erzeugten mRNA konnte drastisch gesenkt werden, mithilfe von Pseudo-Uridin und 5'-Methylcytidine anstelle von Uridin und Cytidin12. Pseudo-Uridin modifizierte mRNA auch gezeigt hat, haben eine erhöhte biologische Stabilität und eine deutlich höhere translationale Kapazität13.
Um die vielversprechenden Eigenschaften der mRNA-basierte Therapie in der klinischen Anwendung profitieren zu können, ist es wichtig, ein geeignetes Fahrzeug für den Transport von mRNA in die Zelle zu schaffen. Dieses Fahrzeug sollte nicht toxischen Eigenschaften in Vitro und in Vivozu tragen, schützen die mRNA gegen Nuklease-Abbau und bieten ausreichend zelluläre Aufnahme für eine längere Verfügbarkeit und Übersetzung der mRNA14.
Zwischen allen möglichen Träger für in Vivo Drug-Delivery, wie Kohlenstoff-Nanoröhren, Quantenpunkte und Liposomen, letztere wurden studierte am meisten15,16. Liposomen sind Vesikel bestehend aus einer Lipid Bilayer10. Sie sind amphiphil mit einer hydrophoben und einen hydrophilen Teil, und durch die selbständige Anordnung dieser Moleküle ist eine kugelförmige Doppelschicht gebildeten17. Im Inneren der Liposomen können Therapeutika oder Drogen gekapselt und somit geschützt von enzymatischen Abbau18. Mit N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium-Chlorid (DOTMA)19, Liposomen [1,2-Bis (Oleoyloxy)-3-Propan (Trimethylammonio)] (DOTAP)20und Dioctadecylamidoglycylspermine (Hunde)21, oder DC-Cholesterin22, gut charakterisiert sind und häufig für zelluläre Transfektion mit DNA oder RNA.
Kationische Liposomen umfassen eine positiv geladene Lipid und einer ungeladenen Phospholipid-23. Transfektion durch kationische Liposomen gehört zu den am häufigsten verwendeten Methoden für den Transport von Nukleinsäuren in Zellen24,25. Die kationischen Lipid-Partikel bilden komplexe mit den negativ geladenen Phosphatgruppen in das Rückgrat der Nukleinsäure-Moleküle26. Diese sogenannten Lipoplexes befestigen Sie an der Oberfläche der Zellmembran und geben Sie die Zelle durch Endozytose oder Endozytose ähnliche Mechanismen27.
Im Jahr 1989 Malone Et Al. erfolgreich beschrieben kationischen Lipid-mediated mRNA Transfektion28. Jedoch fand mit einer Mischung von DOTMA und 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (Schmiere), die Gruppe, dass DOTMA zytotoxische Effekte28manifestiert. Zohra Et Al. zeigten darüber hinaus, dass DOTAP (1,2-Dioleoyloxy-3-Trimethylammonium-Propan-Chlorid) als ein mRNA Transfektion Reagenz29genutzt werden kann. Allerdings sollte für die effiziente Transfektion von Zellen, DOTAP in Kombination mit anderen Reagenzien, wie Fibronektin29 oder Schmiere30verwendet werden. Bisher wurde DOTMA die erste kationische Lipid auf dem Markt für die gen-Lieferung-31verwendet. Andere Fette dienen als therapeutische Träger oder in verschiedenen Phasen der klinischen Studien getestet (z. B. EndoTAG-I, mit DOTAP als Lipid-Carrier), wird derzeit in einer Phase-II-klinische Studie32untersucht.
Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die Generation des NLps mit DC-Cholesterin und Schmiere. Diese Methode ist einfach durchzuführen und ermöglicht die Erzeugung von NLps in verschiedenen Größen. Das allgemeine Ziel der NLp-Generation mit der trocken-Film-Methode ist die Schaffung von Liposomen für mRNA Komplexierung, wodurch effizient und biokompatible Zelle Transfektion in-vitro-14,33.
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Protocol
1. Generation der kationischen Nanoliposomes (Abbildung 1)
- Lösen Sie die Lipide DC-Cholesterin (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-Carbamoylproxyl] Cholesterin Hydrochlorid) und Schmiere (Dioleoyl Phosphatidylethanolamine), geliefert als Pulver, in Chloroform, eine Endkonzentration von 25 mg/mL zu erreichen.
Hinweis: Bewahren Sie die gelösten Lipide bei-20 ° C. - Arbeiten Sie mit 25 mg/mL Stammlösung sowohl Lipide. Mix-40 µL der gelösten DC-Cholesterin und 80 µL die gelösten Schmiere in einem Glaskolben.
Hinweis: Das gesamte Lipid beträgt 3 mg. Um schnelle Verdunstung der Chloroform zu vermeiden, legen Sie die Lipide auf Eis beim Pipettieren. - Chloroform für 15 min unter einem Argon-Gasstrom zu verdampfen. Anschließend füllen Sie ein Exsikkator mit Kieselgel, legen Sie die offene Glaskolben innen und wenden Sie ein Vakuum über Nacht an, um sicherzustellen, dass die verbleibenden Chloroform verdampft wird und ein Lipid-Film innerhalb der Glaskolben entsteht.
Hinweis: Arbeiten Sie schnell und vermeiden Sie unnötigen O2 Kontakt. - Rehydrieren Sie die gebildeten Lipid-Film mit 1 mL Nuklease-freies Wasser und Wirbel die Suspension für 15 min (Abbildung 2A). Danach legen Sie die Aussetzung in ein Ultraschall-Bad für 1 h (Abb. 2 b).
Hinweis: Das Fahrwerk wird leicht bewölkt sein. - Montieren Sie den Mini-Extruder gemäß den Anweisungen des Herstellers, füllen Sie eine Spritze mit der Lipid-Aufhängung und legen Sie die Fertigspritze und eine leere Spritze auf beiden Seiten des Extruders. Drücken Sie die Lipid-Federung durch die Membran aus einer Spritze auf die andere, 20 x-25 X zu extrudieren Sie die Suspension (Abbildung 2).
Hinweis: Die Größe des NLps richtet sich nach der Porengröße der Membran verwendet. - Speichern Sie die NLps in einem Glaskolben bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung.
Hinweis: Nach längerer Lagerzeit sollte die NLps in der Beschallung Badewanne wieder für 15 min von 35 kHz, Komplexbildung zu umgehen platziert werden.
2. in-vitro- Transkription von synthetischen mRNA
- Bereiten Sie die eGFP-Codierung mRNA nach dem Protokoll veröffentlicht früheren34.
- Verstärken die eGFP-Sequenz aus dem Plasmid mit 0,7 µM der vorn (5'-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3') und rückwärts (5'-T120 CTT CTT ACT CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3 ") Primer und die Polymerase kit mit PCR.
- Mischen Sie 20 µL einer kommerziellen Pufferlösung wechselndes das Schmelzverhalten von DNA (Table of Materials), sowie 20 µL des 5 X-Mix aus dem Polymerase-Kit. Fügen Sie 7 µL jedes Primers (vorwärts und rückwärts).
- Fügen Sie 25 ng des Plasmids eGFP, die Mischung und 2 µL der Polymerase von der Polymerase-Kit.
Hinweis: Halten Sie die Polymerase auf dem Eis vor zur Lösung pipettieren. - Fügen Sie Nuklease-freie H2O, die Mischung bis zu einem Volumen von 100 µL.
- Führen Sie die PCR-Zyklen in den Thermocycler nach dem Protokoll in Tabelle 1.
- Reinigen Sie die eGFP-Kodierung DNA-Sequenz mit dem PCR-Reinigung-Kit.
- Deshalb mischen Sie die PCR-Lösung mit 500 µL Bindung Puffer aus dem Kit und Reinigung Spalten füllen verwenden.
- Die Spalten mit maximaler Geschwindigkeit für 1 min Zentrifugieren und das Filtrat verwerfen.
- Fügen Sie 750 µL Waschpuffer ich auf die Spalte, Zentrifuge wieder auf die maximale Geschwindigkeit für 1 min, und das Filtrat verwerfen.
- Wiederholen Sie die Zentrifuge Schritt 1 X um den Puffer aus der Spaltenfilter zu entfernen.
- Übertragen Sie die Spalte auf ein frisch 1,5-mL-Tube.
- Fügen Sie 20 µL Nuklease-freie H2O auf die Spalte, inkubieren 1 min und Zentrifuge für 1 min bei maximaler Geschwindigkeit. Wiederholen Sie diesen Schritt.
- Messen Sie die Konzentration der DNA mit einem Photometer und speichern Sie es bei-20 ° C.
- Analysen der DNA-Qualität mit Gelelektrophorese. 0,5 g Agarose in Tris-Borat-EDTA (TBE) Puffer und erwärmen Sie es in der Mikrowelle auf hoher Hitze, bis die Agarose komplett aufgelöst ist.
- Die flüssige Agarose 5 µL Gel-Färbelösung hinzu, füllen Sie die Lösung in die Gel-Kammer, und warten Sie, bis das Gel polymerisiert wird.
- Mix 200 ng DNA mit 2 µL 6 x laden Farbstoff und füllen Sie es bis zu einem Ende Volumen von 12 µL Pipette ein DNA-Leiter sowie die DNA-Probe in die Gel-Brunnen und laufen die Elektrophorese für 1 h bei 100 V.
- Analysieren Sie das Gel mit einem Gel-Analyse Station unter UV-Licht.
- Führen Sie die in-vitro- Transkription um mRNA aus der DNA-Sequenz mit einem in-vitro- Transkription-Kit mit T7-Polymerase zu generieren und ersetzen Sie NUK UTP und CTP mit Ψ-UTP und Methyl-CTP zu.
- Mischen Sie für die in-vitro- Transkription die Zutaten nach Tabelle 2.
Hinweis: Ersetzen Sie 1,5 µL Methyl-CTP mit 01:10 Cy3-CTP verdünnt in Nuklease-freie H2O während der in-vitro- Transkription von eGFP mRNA Cy3-Kennzeichnung der mRNA zu erreichen. - Inkubieren Sie die IVT-Reaktion-Mischung für 4 h bei 37 ° c
- Fügen Sie 1 µL der DNase I von die T7-Polymerase kit und inkubieren 15 min von 37 ° C, das DNA-Template zu verdauen.
- Mischen Sie für die in-vitro- Transkription die Zutaten nach Tabelle 2.
- Die mRNA zu reinigen, verwenden Sie das RNA-Aufräumarbeiten-Kit.
- Füllen Sie die IVT-Mischung, um das Volumen von 100 µL mit Nuklease-freie H2O.
- Fügen Sie 350 µL der Lyse Puffer und Mix durch Pipettieren rauf und runter.
- Fügen Sie 250 µL 100 % Ethanol und nochmals mixen. Die Mischung in die Bereinigung Spalten Pipette.
- Zentrifuge für 15 s bei 8.000 x g und entsorgen das Filtrat.
- Fügen Sie 500 µL des Puffers waschen in einer Spalte, Zentrifuge wieder für 15 s bei 8.000 x g, und entfernen Sie das Filtrat.
- Waschen Sie die Spalte 1 X mit 500 µL Waschpuffer und Zentrifuge für 2 min bei 8.000 X g.
- Verschieben Sie die Spalte in eine frische 1,5 mL Reaktionsgefäß. Eluieren mRNA 2 X von einer 1-min Inkubation von 20 µL der Nuklease-freie H2O auf der Spalte Membran, gefolgt von einer 1-min Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit.
- Entfernen Sie die Phosphatgruppen aus der mRNA mit einem Dephosphorylation-Kit. Die mRNA 4,5 µL 10 X Phosphatase Puffer und 1 µL Phosphatase hinzufügen und 1 h bei 37 ° c inkubieren
- Reinigen Sie die mRNA wiederum folgende Schritte 2.5.1 - 2.5.7.
- Gemessen Sie die mRNA Konzertierung mit einem Photometer.
- Verwenden Sie Gelelektrophorese, um die Reinheit und die Größe der mRNA zu analysieren. Daher bereiten Sie eine Agarosegel wie 2.3.9 - 2.3.10 beschrieben.
- Mix-3.3 µL Formamid, 1 µL 37 % Formaldehyd, 1 µL 10 x Männer und 1,7 µL 6 x laden Farbstoff mit 200 ng der mRNA und füllen Sie ihn bis zu 10 µL mit Nuklease-freie H2O für jede Probe und RNA-Marker.
- Inkubieren Sie die Mischung für 10 min bei 65 ° C für mRNA Denaturierung. Laden Sie die Brunnen des Gels mit der mRNA und RNA-Marker und führen Sie das Gel für 1 h bei 100 V.
- Analysieren Sie das Gel mit einem Gel Doc Station mit UV-Licht.
(3) Komplexierung von synthetischen mRNA
- Tauen Sie die synthetischen mRNA auf Eis, Strudel, und Zentrifuge kurz vor dem Öffnen der Tube.
- Mischung 10 µL des synthetischen mRNA (mRNA-Konzentration ist 100 ng/µL) mit 1 µL, 2,5 µL, 5 µL, 10 µL oder 20 µL der NLp-Suspension (NLp-Konzentration beträgt 3 mg/mL). Zentrifugieren Sie kurz und inkubieren Sie für 20 min bei Raumtemperatur (RT) für Nanolipoplex Bildung.
Hinweis: Verwechseln Sie nicht durch pipettieren. Dies kann zum Verlust des Bandes führen. Vortex kurz für eine gute Durchmischung. - Die Nanolipoplexes 1 mL normale Zelle Medium hinzu und mischen Sie sie von oben und unten pipettieren.
4. Analyse der Kapselung Effizienz der Nanoliposomes
- Um die Kapselung Experimente durchzuführen, verwenden Sie das RNA Quantifizierung Kit.
- Bereiten Sie die Arbeitslösung durch Verdünnung der Fluoreszenzfarbstoff 1: 200 für Hochton- und 1:2,000 für einen Low-Range-Assay.
Hinweis: Tauen Sie Fluoreszenzfarbstoff auf Eis auf. Bereiten Sie die Arbeitslösung direkt vor dem Gebrauch. - Bereiten Sie die Hochton- und Low-Range Standardkurven mit 1 mL einer 2 µg/mL Stammlösung von eGFP mRNA in Nuklease-freie H2O.
Hinweis: Verwenden Sie für die standard Kurven die mRNA, die in die Kapselung Experimente verwendet werden. - Tabelle 3 für die Vorbereitung der Hochton-Standard (20 ng/mL - 1 µg/mL) verwenden.
- Verdünnen Sie für den Low-Range-Standard die 2 µg/mL eGFP mRNA-Stammlösung 01:20 um eine Endkonzentration von 100 ng/mL zu erreichen. Bereiten Sie einen Low-Range-Standard (1 ng/mL - 50 ng/mL), wie in Tabelle 4beschrieben.
- Kombinieren Sie 1 µg eGFP mRNA (10 µL) und 7,5 µg des NLps (2,5 µL) und 20 min bei RT inkubieren
Hinweis: Halten Sie die mRNA auf Eis um Verschlechterung zu vermeiden. - Fügen Sie 1 mL der Nuklease-freie H2O Form Nanolipoplexes und Mix von Pipettieren rauf und runter.
- Die gekapselte Proben und Standards 1 mL 1: 200 oder 1:2,000 RNA Fluoreszenzfarbstoff Arbeitslösung hinzufügen und 5 min bei RT im Dunkeln inkubieren.
- Pipette die Standards und Proben in Duplikate in einem schwarzen 96-Well-Platte und messen die Fluoreszenz bei 530 nm auf einer Mikrotestplatte Reader (Abbildung 3).
5. Vorbereitung der Zellen zur Transfektion
- Platte 1,5 x 105 A549 Zellen/gut von einem 12-Well-Platte 1 d vor Transfektion.
- 24 h vor Transfektion der Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2 in regelmäßige Zelle Medium (DMEM/hohe Glukose mit 10 % fötalen Rinderserum [FBS], 2 mM L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin) inkubieren.
6. die Transfektion von Zellen
- Waschen Sie die vorbereiteten Zellen 1 X mit 1 mL/PBS (ohne Ca2 + /Mg2 +).
- Fügen Sie 1 mL der vorbereiteten Nanolipoplex Mischung, mit 1 µg eGFP mRNA in 1 µL, 2.5 µL, 5 µL, 10 µL oder 20 µL NLps, eine gut vorbereitete Platte mit A549 Zellen gekapselt.
- Hinzufügen der Nanolipoplex Aussetzung zu den Zellen und inkubieren Sie bei normalen Bedingungen 24 Stunden Transfektion Wirksamkeit zu analysieren oder für 24 h und 72 h nach Transfektion der Zellviabilität analysieren.
Hinweis: Transfektion mit NLps erfordert keine mittlere Änderung.
7. Analyse der Zelle Transfection Wirksamkeit mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenz-Mikroskopie
- Den Überstand zu entfernen und waschen Sie die Zellen mit 1 mL/gut PBS (ohne Ca2 +/Mg2 +), um die restlichen NLps zu entfernen.
- Bereiten Sie die Zellen für die Durchflusszytometrie.
- Trypsinize der Zellen mit 500 µL/Well Trypsin/EDTA (0,05 %) bei 37 ° C für 3 min. Stop den Prozess und die Trypsin zu inaktivieren, indem man die gleiche Menge regelmäßige FBS-haltigen Medium (500 µL/Well).
- Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 400 X g und entfernen Sie vorsichtig den Überstand ohne Berührung der Zelle Pellet.
- Waschen Sie die Zellen mit 1 mL PBS (ohne Ca2 + /Mg2 +).
- Aufschwemmen der Zellen in 300 µL 1 X Fixierung Lösung und übernehmen die Zellen in Flow Cytometry Röhren.
- Analysieren Sie die Zellen bei 488 nm in einem Durchflusszytometer (Abb. 4A).
Hinweis: Vortex Zellen 1 x direkt vor der Messung.
- Bereiten Sie die Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie.
- Befestigen Sie die Zellen mit 1 mL/gut 100 % Methanol, die zuvor bei-20 ° c gelagert wurde
- Hinzufügen von 500 µL/Well 300 nM DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole) aufgelöst in PBS (ohne Ca2 +/Mg2 +) und 5 Minuten im Dunkeln inkubieren.
- Entfernen Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen wieder mit 100 % Methanol bei-20 ° c gelagert
- Analysieren Sie die Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop (Abb. 4 b).
Hinweis: Verwenden Sie die folgende Anregung/Emission Wellenlängen: eGFP 488/509 nm, DAPI 358/461 nm und Cy3 550/570 nm.
(8) Zelle Lebensfähigkeit Assay
- 5 mg MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid) in 1 mL RPMI (ohne Phenol rot) auflösen.
Hinweis: Die gelösten MTT muss weiter verwässerte 01:10 (Endkonzentration: 0,5 mg/mL) in RPMI vor Gebrauch. - Waschen Sie die transfizierten Zellen 3 X mit 1 mL/PBS (ohne Ca2 +/Mg2).
Hinweis: Die Überreste des Mediums regelmäßige Zelle sollte vollständig entfernt werden. - Hinzufügen von 500 µL/Well von 01:10 verdünnt MTT-Lösung für die Zellen und 4 h bei 37 ° c inkubieren
- Entfernen Sie die MTT-Lösung aus den Zellen nach Inkubation und fügen Sie 500 µL/Well DMSO (Dimethyl Sulfoxid hinzu). Erneut für 10 min bei 37 ° c inkubieren
- Pipette die DMSO-Lösung in Triolen in eine 96-Well Clear-Bodenplatte und messen die Adsorption bei 540 nm mit einer Mikrotestplatte Reader.
- Die Lebensfähigkeit der unbehandelte Zelle auf 100 % gesetzt und berechnen die Zellviabilität der anderen Fraktionen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen (Abbildung 5).
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Representative Results
Unter Verwendung des Protokolls wie beschrieben, wurden NLps bestehend aus den Lipiden DC-Cholesterin und Schmiere vorbereitet mit der trocken-Film-Methode (Abbildung 1). Während der Vorbereitung zeigt die Nanoliposome Lösung verschiedene Stufen der Trübung (Abbildung 2).
Die Kapselung Wirksamkeit des NLps kann dann nach der Kapselung von 1 µg eGFP-Codierung mRNA analysiert werden, durch die Analyse der Freibetrag von mRNA, die nicht eingekapselt wurde, mit dem RNA Quantifizierung Kit (Abbildung 3).
Nachdem die Verkapselung von eGFP mRNA in unterschiedlichen Mengen des NLps, die gebildeten Nanolipoplexes mit Zellen inkubiert werden kann können in Vitro und der Anteil der eGFP exprimierenden Zellen mit analysiert werden Flow Cytometry 24 h Posttransfection (Abb. 4A) . Noch 1 µL der Nanoliposome Lösung ist ausreichend, um eine hohe Transfektion von Zellen in Vitrozu erreichen. Wenn die Zellen sind mit NLps mit Cy3 gekennzeichnet eGFP transfiziert mRNA, das Vorhandensein von die mRNA in das Zytoplasma (rote Fluoreszenz) sowie das bereits produzierte eGFP Protein (grüne Fluoreszenz) kann sein eGFP visualisiert (Abbildung 4 b).
Da die Transfektion von Zellen mit Nanolipoplexes nachteilige Auswirkungen auf die Zellen haben kann, wurde die Lebensfähigkeit der Zellen 24 h (Abb. 5A) getestet und 72 h (Abb. 5 b) Posttransfection. Keine Auswirkungen auf die Zellviabilität konnte nachgewiesen werden, wenn die Zellen mit 2,5 oder 5 µL des NLps oder Nanolipoplexes, bzw. behandelt wurden.
Abbildung 1: Schematische Übersicht über den Herstellungsprozess der kationischen Nanoliposomes. Erstens sollten die gelösten Lipide DC-Cholesterin und Schmiere in einem Glaskolben zusammengemischt werden. Zweitens die sichtbaren Chloroform Flüssigkeit sollte unter Argon verdampft oder Stickstoff Gas Flow und Chloroform Reste darf über Nacht im Vakuum verdampfen. Drittens sollten die gebildeten Lipid-Film auf der Unterseite der Glaskolben mit Nuklease-freie H rehydriert werden2O, gefolgt von vortexen multilamellar Liposomen bilden. Durch die Beschallung und Extrusion der Liposomen-Lösung die Ready-to-Use Unilamellar NLps entstehen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: die Nanoliposome-Lösung in verschiedenen Stadien während der Herstellung. (A) Diese Abbildung zeigt die Liposomen-Lösung direkt nach Rehydrierung der Lipid-Film und vortexen für 15 min, sowie (B) nach 1 h in einer Beschallung Bad (C) von 25 Zyklen der Extrusion gefolgt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Kapselung Wirksamkeit von der Nanoliposomes. Dieses Fenster zeigt die Quantifizierung der freien eGFP mRNA nach Kapselung in NLps. Die Ergebnisse werden als ± SEM bedeutet (n = 3). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Transfektion Wirksamkeit von der Nanolipoplexes. (A) dieses Panel zeigt die Ermittlung des besten mRNA/Nanoliposome-Verhältnis zur Transfektion mit unterschiedlichen Mengen des NLps 1 µg eGFP mRNA 24 h Posttransfection zu Kapseln. (B) dieses Panel zeigt die Erkennung von Cy3 beschriftet synthetische mRNA in 2,5 µL gekapselt NLps und eGFP Ausdruck in den Zellen 24 h Posttransfection (die Maßstabsleiste = 50 µm). Die Ergebnisse werden als ± SEM bedeutet (n = 3). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Zelle Überleben nach der Transfektion mit Nanoliposomes und gekapselte mRNA. Dieses Fenster zeigt die Messung der Zellviabilität mit einem MTT-Assay (A) 24 h und (B) 72 h Posttransfection. Die Ergebnisse werden als ± SEM bedeutet (n = 3). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Schritt | Temperatur in ° C | Dauer |
| 1 | 95 | 5 min |
| 2 | 94 | 15 s |
| 3 | 55 | 1 min |
| 4 | 72 | 1 min |
| 5 | Gehen Sie zu 2 30 X | |
| 6 | 72 | 10 min |
| 7 | 4 | halten |
Tabelle 1: PCR Zyklus Protokoll für DNA Verstärkung.
| Konzentration | Betrag | |
| ATP | 7,5 mM | 4 ΜL |
| GTP | 1.875 mM | 1 ΜL |
| 5'-Methylcytidin | 7,5 mM | 3 ΜL |
| Ψ | 7,5 mM | 3 ΜL |
| ARCA | 2,5 mM | 10 ΜL |
| DNA-Vorlage | 1,5 µg | |
| Puffer-mix | 1 x | 4 ΜL |
| T7-Enzym-mix | 4ΜL | |
| RNase-Inhibitor | 1 ΜL | |
| Nuklease-freies Wasser | Füllen Sie bis zu 40 µL | |
Tabelle 2: Mix für die in-vitro- Transkription von DNA zu mRNA.
| Volumen der Nuklease-freie H2O (µL) | Volumen von eGFP mRNA Hochton-Stammlösung (µL) | Volumen von 1: 200 Fluoreszenzfarbstoff (µL) | Endkonzentration (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 1000 |
| 50 | 50 | 100 | 500 |
| 90 | 10 | 100 | 100 |
| 98 | 2 | 100 | 20 |
| 100 | 0 | 100 | leere |
Tabelle 3: Protokoll für ein Hochton-Standardkurve.
| Volumen der Nuklease-freie H2O (µL) | Volumen von eGFP mRNA Low-Range-Stammlösung (µL) | Volumen von 1: 2000 Fluoreszenzfarbstoff (µL) | Endkonzentration (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 50 |
| 50 | 50 | 100 | 25 |
| 90 | 10 | 100 | 5 |
| 98 | 2 | 100 | 1 |
| 100 | 0 | 100 | leere |
Tabelle 4: Protokoll für eine Low-Range-Standardkurve.
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Discussion
Die vorgestellte Protokoll beschreibt die Generation des NLps mit hohen Kapselung Wirksamkeit für synthetisch veränderte mRNA, sowie die zuverlässige Transfektion von Zellen in Vitro. Darüber hinaus garantieren die NLps die Freisetzung von mRNA, die wiederum in ein funktionsfähiges Protein in der Zelle übersetzt ist. Zusätzlich die Transfektionen mit NLps in regelmäßige Zelle Medium durchgeführt werden kann, was zu hohen Zelle künstliche während Transfektion, und dauern bis zu drei Tage nach Transfektion.
Um mRNA als eine therapeutische verwenden, ist es bevorzugt, selbst Montage-System für ihre Lieferung. Die häufigste Transfektion Reagenzien enthalten kationische Lipide, einschließlich Liposomen. Wie Liposomen positiv geladen sind, können negativ geladenen Nukleinsäuren, gekapselt werden, wodurch die elektrostatische Abstoßung der Zellmembranen überwinden35sein. Die kationischen Lipid DC-Cholesterin bereits in früheren Studien als eine stabile und biokompatible Fahrzeug36wurde beschrieben. Die Zugabe von neutral Lipid führt zu einer verstärkten Transfektion Wirksamkeit37Schmiere. Angesichts der beschriebenen Vorteile erwähnt, diese Lipide für die Vorbereitung des NLps ausgewählt wurden. Darüber hinaus haben frühere Studien gezeigt, dass die Verwendung von diesen zwei Lipide infolge einer erhöhten zellulären Transfektion mit negativ geladenen Nukleinsäuren38gegenüber anderen vorzuziehen ist.
Für die erfolgreiche Generierung des NLps und Nanolipoplexes ist es wichtig, besonderes Augenmerk auf einige der Schritte zu zahlen. Das Verfahren der Nanoliposome Generation sollte durchgeführt werden, unter O2-freien Bedingungen. Das Vorhandensein von O2 während der NLp-Generierung kann zum Abbau der Phospholipide und reduzierte Reproduzierbarkeit39führen. Darüber hinaus ist trotz Änderungen mRNA sehr empfindlich in Bezug auf Abbau durch Nukleasen. Daher ist die Verwendung von RNase-freie H2O für die Rehydratation des Lipid-Film, dringend empfohlen, mRNA Abbau während der Komplexierung zu verhindern. Darüber hinaus sollte RNase-freie Bedingungen für die Lagerung von Nanolipoplexes sichergestellt werden.
Darüber hinaus können NLps Aggregate im Laufe der Zeit wegen der instabilen thermodynamische System bilden. Die Einfluss-Parameter umfassen Speichertemperatur und Oberflächenladung der Liposomen-40. NLp-Aggregation kann die Destabilisierung der Liposomenmembran und das Risiko von unerwünschten mRNA release41, führt zu schlechten Transfektion Wirksamkeit und mRNA Abbau in den Extrazellulärraum führen. Aber, wie bereits gezeigt, Nanolipoplexes kann bis zu sechs Monate ohne Aggregation oder Verlust der Transfektion Wirksamkeit35bei 4 ° C gelagert werden.
Durch die Verwendung von Liposomen als Medikament Trägersystem, sind zwei der wichtigsten Probleme der Drug-Delivery lösbar. Liposomen die gekapselte Droge vor Abbau schützen und passiv Zielgeweben, die eine diskontinuierliche Endothel, wie z. B. der Leber oder des Knochenmarks16haben können. Für die Lieferung von therapeutischen Nukleinsäuren, Parameter wie z. B. Partikelgröße und Kapselung Kapazität sind entscheidend für die Bewertung und zelluläre Aufnahme von liposomalen Fahrzeuge. Besonders die Größe die Liposomen in der Nanometerskala ermöglicht eine Interaktion mit der Zellmembran42 und ist dabei wichtig, dass die in Vivo späteren Verwendung. Erstens sollte die Liposomen klein genug, um das Spiel durch die renale und hepatische System43zu vermeiden. Zweitens sollte die Liposomen Größe helfen, die Blutgefäße Barriere um die Zellen des gewünschten Organs Ziel zu überwinden. Es wurde berichtet, dass Liposomen in der Größenordnung von 100-300 nm effizient Hepatozyten44transfizieren konnten; jedoch groß dimensionierten Liposomen (z.B.400 nm) waren nicht in der Lage, die endotheliale Barriere45zu überwinden.
Obwohl das beschriebene Verfahren für die Lieferung der mRNA hergestellt wurde, kann es auch für andere Nukleinsäure-Therapeutika, wie z. B. MicroRNA implementiert werden. In einer aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass MicroRNA 126 selektiv ausgerichtet sein kann und daher die Entwicklung der abdominalen Aortenaneurysmen kann effektiv verhindert46vorhanden sein. DNA/RNA-Therapeutika kann Nebenwirkungen wie Thrombozyten Aktivierung, verursachen, wenn sie in direkten Kontakt mit Zellen kommen, kann dies zu Verpackung innerhalb von Liposomen vermeiden, wodurch es weitere vorteilhafte47. Daher die hier vorgestellte Methode ist vielseitig einsetzbar und kann für die Gestaltung von Drug-Delivery für viele Krankheiten verwendet werden. Das etablierte Protokoll ermöglicht nicht nur die schnelle und kostengünstige Erzeugung von einen effizienten mRNA-Träger mit einer definierten Größe, sondern bietet auch die Möglichkeit zum Anpassen der Lipid-Formulierung nach den Bedürfnissen einer bestimmten Anwendung: (1) die Größe der Liposomen können leicht verändert werden, indem Sie die Filter ändern; (2) die Oberfläche der positiv geladenen Liposomen konnte durch die Verwendung, z. B. Polyethylenglykol, Erhöhung der Stabilität und Verzögerung Blut-Clearance bei in Vivo Anwendung48geändert werden. Die Bindung von spezifischen Antikörpern gegen die Liposomen ermöglicht die gezielte Bereitstellung von gekapselten Medikament49. Mit weiteren Untersuchung und einen detaillierteren Einblick in die physikalischen Eigenschaften kann das Protokoll noch verbessert werden.
Für die Generation von Liposomen, drei gängige Methoden stehen zur Verfügung: der trocken-Film, die Ethanol-Injektion und die Reverse-Phase-Verdunstung. Im Yang Et Al. Studie, diese drei Herstellungstechniken wurden35verglichen. Es wurde festgestellt, dass Liposomen mit einer definierten Größe und eine gleichmäßige Verteilung in der Lösung mit der trocken-Film-Methode generiert werden können. Darüber hinaus das trocken-Film-Verfahren durchgeführt, dieser Studie wurde bei der Herstellung von NLps mit einer definierten Größe von 200 nm, eine homogene Verteilung und eine hohe Kapselung-Kapazität.
Auf der einen Seite die positive Ladung des Liposomen führt zu einer erhöhten Kapselung Kapazität und bessere Zelle Oberfläche Fusion50,51,52, aber auf der anderen Seite kann es die Zellmembran zu destabilisieren und zu aktivieren verschiedenen Immunaktivierung Wege und Zelle Tod27,53. Jedoch können die apoptotischen Eigenschaften der kationischen Lipide minimiert werden, durch den Einsatz der Helfer Lipid Schmiere54,55. In der Studie von Zhang Et Al.wurde festgestellt, dass ein Verhältnis von 1:2 DC-Cholesterin und Schmiere während Liposomen-Generation zu den effizientesten zellulären Transfektion mit Nukleinsäuren38führt. In der Methode, die in der vorliegenden Studie umgesetzt, diente das Lipid-Verhältnis von 1:2 DC-Cholesterin und Schmiere in der gemischten Lipid-Suspension während der Lipid-Film-Vorbereitung, und die vorbereiteten Liposomen führte zu hohen Transfektion Wirksamkeit und, gleichzeitig, hoch Zelle Lebensfähigkeit. Ähnliche Ergebnisse wurden auch von anderen Forschern, wie z. B. Ciani56 und Farhood37gefunden.
Insgesamt haben seit Jahren in klinischen Studien zeigen gute Biokompatibilität und geringe Toxizität in VivoLiposomen eingesetzt. In Kombination mit mRNA NLps für die effiziente Bereitstellung von mRNA, Zellen oder Organen in Vitro und in Vivo, ließe sich um de-Novo -Synthese des gewünschten Proteins zu induzieren. Im Hinblick auf therapeutische Anwendungen könnte Nanolipoplexes, z. B. in Wunde heilende Patches für transdermale mRNA Lieferung57 Zellregeneration aktiviert oder als Spray für die Vernebelung von mRNA58 für die Heilung von Lungenkrebs verwendet werden Krankheiten59,60 wie z.B. zystische Fibrose.
Die vorgestellte Protokoll garantiert eine einfache und zugängliche Weise zur Erzeugung von NLps mit der trocken-Film-Methode, die dann für die effiziente Kapselung von in-vitro- verwendet werden kann mRNA und die sichere Transfektion von Zellen transkribiert.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Keine
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
| (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
| 4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
| BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
| Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
| Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
| Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
| Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
| Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
| RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
| Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
| Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
| GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
| peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
| Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |
References
- Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don't shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
- Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
- Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
- Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
- Youn, H., Chung, J. -K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8 (2014).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
- Michel, T., Wendel, H. -P., Krajewski, S. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. Kormann, M. , IntechOpen. 3-20 (2016).
- Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
- Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
- Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
- Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
- Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
- Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
- Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
- Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
- Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
- Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
- Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
- Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
- Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
- Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497 (2011).
- Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
- Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
- Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943 (2014).
- Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
- Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
- Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
- Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
- Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
- Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
- Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
- Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
- Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H.
- Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. "In vivo" distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
- Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
- Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
- Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
- Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
- Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
- Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
- Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
- Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
- Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
- Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
- Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
- Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
- Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
- Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504 (2015).
- Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
