Summary
Her beskriver vi en protokoll for generering av kationisk nanoliposomes, som er basert på metoden tørrfilm og kan brukes for trygg og effektiv levering av in vitro transkribert budbringer RNA.
Abstract
Utviklingen av budbringer RNA (mRNA)-basert therapeutics for behandling av ulike sykdommer blir stadig viktigere på grunn av positive egenskapene til i vitro transkribert (PES) mRNA. Med hjelp av IVT mRNA, kan de novo syntesen av et protein som ønsket indusert uten endring av fysiologiske status for målcellen. Videre kan protein biosyntesen kontrolleres nøyaktig på grunn av forbigående effekten av IVT mRNA.
For effektiv transfection celler, kan nanoliposomes (NLps) representere en sikker og effektiv levering kjøretøy for terapeutisk mRNA. Denne studien beskriver en protokoll for å generere sikker og effektiv kationisk NLps bestående av DC-kolesterol og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (dop) som en vektor for levering for IVT mRNA. NLps har en definert størrelse, en homogen distribusjon og en høy complexation kapasitet, og kan produseres med metoden tørrfilm. Videre vi presenterer ulike testsystemer å analysere sine complexation og hva efficacies bruker syntetiske forbedret grønne fluorescerende protein (eGFP) mRNA, samt deres innvirkning på celle levedyktighet. Samlet gir presentert protokollen en effektiv og trygg tilnærming for mRNA complexation, som kan fremme og forbedre administrasjonen av terapeutiske mRNA.
Introduction
Bruk av modifisert mRNA for terapeutiske programmer har vist stort potensial i de siste par årene. I hjerte, provoserende og monogenetic sykdommer og utvikle vaksiner, er mRNA en lovende terapeutisk agent1.
Protein erstatning terapi med mRNA tilbyr flere fordeler sammenlignet med den klassiske genterapi, som er basert på DNA hva til målet celler2. Funksjonen mRNA starter direkte i stoffer. Men plasmider DNA (pDNA), en konstruksjon av double-strandet, rund kan DNA som inneholder en promoter region og gene serie koding terapeutiske protein3, også handlinger i stoffer det bare inkluderes i celler som går gjennom mitose ved transfection. Dette reduserer antall transfekterte celler i vevet1,4. Hva av vev med svak mitose aktivitet, for eksempel hjerte celler, er spesielt vanskelig5. I motsetning til pDNA oppstår hva og oversettelse av mRNA i mitotisk og ikke-mitotisk celler i vevet1,6. Viral integrering av DNA i vert genomet kan komme med mutagene effekter eller immunreaksjoner7,8, men etter hva av celler med en protein-koding mRNA, ønsket protein syntese de novo starter selvstendig9,10. Videre kan proteinsyntese justeres til pasientens behov gjennom personlige doser, uten å forstyrre genomet og risikere mutagene effekter11. Aktivering av immun potensialet i syntetisk genererte mRNA kunne reduseres dramatisk med pseudo uridine og 5-methylcytidine i stedet for uridine og cytidine12. Pseudo uridine endret mRNA har også vist seg å ha en økt biologiske stabilitet og en betydelig høyere translasjonsforskning kapasitet13.
For å kunne dra nytte av de lovende egenskapene av mRNA-basert behandling av klinisk bruk, er det viktig å lage en passende bil for transport av mRNA inn i cellen. Dette kjøretøyet skal bære giftfri egenskaper i vitro og vivo, beskytte mRNA mot nuclease-degradering og gi tilstrekkelig mobilnettet opptak for en langvarig tilgjengelighet og oversettelse av de mRNA14.
Blant alle mulige transportør typer i vivo stoffet levering, som Karbonnanorør kvante prikker og liposomer, sistnevnte har vært studert de15,16. Liposomer er blemmer som består av en lipid bilayer10. De er amphiphilic med en hydrofobe og en hydrofile del, og selv hvordan disse molekylene, et sfærisk dobbelt lag er dannet17. I liposomer, kan terapeutiske agenter eller narkotika være innkapslet og dermed beskyttet enzymatisk degradering18. Liposomer inneholder N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propan] (DOTAP)20, og dioctadecylamidoglycylspermine (hunder)21, eller DC-kolesterol22, er vel preget og brukte for mobilnettet transfection med DNA eller RNA.
Kationisk liposomer utgjør en positivt ladet lipid og en uncharged phospholipid23. Hva via kationisk liposomer er en av de vanligste metodene for transport av nukleinsyrer til celler24,25. Kationisk lipid partikler danner komplekser med negativt ladde fosfat grupper i ryggraden i nukleinsyre molekyler26. Disse såkalte lipoplexes legge til overflaten av cellemembranen og angi cellen gjennom endocytose eller endocytose-lignende-mekanismer27.
I 1989, Malone et al. vellykket beskrevet kationisk lipid-formidlet mRNA transfection28. Men fant bruker en blanding av DOTMA og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (dop), gruppen at DOTMA manifestert cytotoksiske effekter28. I tillegg viste Zohra et al. at DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-propan klorid) kan brukes som en mRNA transfection reagens29. Men for den effektive transfection celler, bør DOTAP brukes i kombinasjon med andre reagenser, som fibronectin29 eller DOPE30. Så langt var DOTMA den første kationisk lipid på markedet brukes for gen levering31. Andre lipider brukes som terapeutiske bærere eller blir testet i ulike stadier av kliniske forsøk, (f.eks EndoTAG-I, som inneholder DOTAP som en lipid bærer), undersøkes for tiden i en fase II kliniske prøve32.
Dette verket beskriver en protokoll for generering av NLps som inneholder DC-kolesterol og dop. Denne metoden er enkel å utføre og tillater generering av NLps av forskjellige størrelser. Vårt generelle mål om NLp generasjon med metoden tørrfilm er å skape liposomer for mRNA complexation, dermed gir effektiv og biokompatible celle transfection i vitro14,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generasjon av kationisk Nanoliposomes (figur 1)
- Oppløse lipider DC-kolesterol (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] kolesterol hydroklorid) og dop (dioleoyl phosphatidylethanolamine), som et pulver i kloroform å oppnå en siste konsentrasjon av 25 mg/mL.
Merk: Oppbevar de oppløste lipider på 20 ° C. - Arbeide med 25 mg/mL lagerløsning av både lipider. Mix 40 µL av oppløst DC-kolesterol og 80 µL av oppløst dop i en glass kolbe.
Merk: Totalt lipid beløpet er 3 mg. For å unngå rask fordampning av kloroform, sted av lipider på is under pipettering. - Fordampe kloroform i 15 min under en argon gass flyt. Deretter fylle en desiccator med silica gel, plassere åpent glass kolbe inne og bruke et vakuum over natten for å sikre at den gjenværende kloroform er fordampet, og en lipid film dannes i glass kolbe.
Merk: Jobbe raskt og unngå unødvendig O2 kontakt. - Rehydrate dannet lipid filmen med 1 mL av nuclease-fritt vann og vortex suspensjon i 15 min (figur 2A). Etterpå plass suspensjon i et sonication bad 1t (figur 2B).
Merk: Suspensjon vil være litt skyet. - Montere mini extruder i henhold til produsentens instruksjoner, fylle en sprøyte med lipid suspensjon og plasser fylt sprøyten og en tom sprøyte på begge sider av extruder. Trykk lipid suspensjon gjennom membranen fra en sprøyte til den andre, 20 x-25 x, ekstrudere suspensjon (figur 2C).
Merk: Størrelsen på NLps bestemmes av porestørrelse av membranen brukes. - Lagre NLps i en glass bolle på 4 ° C til fremme bruk.
Merk: Etter langvarig lagringstid, NLps plasseres i sonication badekaret igjen i 15 min av 35 kHz å omgå komplekse formasjon.
2. i Vitro transkripsjon av syntetiske mRNA
- Forberede eGFP-koding mRNA følger protokollen publisert tidligere34.
- Forsterke eGFP sekvensen fra plasmider med 0,7 µM forover (5'-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3) og bakover (5'-T120 CTT CTT ACT CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3 ") primere og polymerase kit med PCR.
- Bland 20 µL av en kommersiell buffer løsning som endrer smeltende atferden til DNA (Tabell for materiale), samt 20 µL av 5 x mix fra polymerase kit. Legge til 7 µL av hver (forover og bakover) primer.
- Legge til 25 ng av eGFP plasmider blandingen og 2 µL av utvalg fra polymerase kit.
Merk: Holde utvalg på is før pipettering den løsningen. - Legge til nuclease-fri H2O til blanding, opp til et volum på 100 µL.
- Kjøre PCR sykluser i thermocycler følger protokollen i tabell 1.
- Rense eGFP-koding DNA sekvensen i PCR rensing kit.
- Derfor bland PCR løsningen med 500 µL bindende bufferen fra kit og bruke den til å fylle rensing kolonner.
- Sentrifuge kolonnene med maksimal hastighet for 1 min og kast filtratet.
- Legge til 750 µL av vaskebuffer jeg til kolonnen sentrifuge igjen på maksimal hastighet for 1 min, og forkaste filtratet.
- Gjenta sentrifuge trinn 1 x fjerne bufferen fra kolonnen filteret.
- Overføre kolonnen til en frisk 1.5-mL tube.
- Legge til 20 µL nuclease-gratis t2O til kolonnen ruge for 1 min og sentrifuge for 1 min for topphastigheten. Gjenta dette trinnet.
- Måle konsentrasjonen av DNA med et fotometer og lagre den på 20 ° C.
- Utføre DNA kvalitets analyser bruker gel geleelektroforese. Legg til 0,5 g agarose Tris Borate EDTA (TBE) buffer og varme den opp i mikrobølgeovn på høy varme før agarose er fullstendig oppløst.
- Legge til 5 µL av gel-flekk løsning av flytende agarose fylle løsningen i gel kammeret og vente til gel er polymerized.
- Mix 200 ng DNA med 2 µL av 6 x lasting fargestoff og fyll den opp til en slutt volum på 12 µL. Pipetter en DNA stige, samt DNA-prøve i gel brønnene og kjøre geleelektroforese 1t 100 V.
- Analysere gel med en gel-analysere stasjon under UV-lys.
- Kjør i vitro transkripsjon for å generere mRNA fra DNA sekvensen med en i vitro transkripsjon kit som inneholder T7-utvalg og erstatte de endrede nukleotider UTP og CTP med Ψ-UTP og metyl-CTP.
- I vitro transkripsjon, blande ingrediensene følgende tabell 2.
Note Ombytte 1.5 µL av methyl-CTP med 1:10 Cy3-CTP fortynnet i nuclease-fri H2O under i vitro transkripsjon av eGFP mRNA å oppnå Cy3-merking av mRNA. - Inkuber IVT reaksjonen blanding 4 h på 37 ° C.
- Legge 1 µL av DNase I fra T7 polymerase kit og Inkuber det i 15 min med 37 ° C å fordøye malen DNA.
- I vitro transkripsjon, blande ingrediensene følgende tabell 2.
- For å rense mRNA, bruk RNA oppryddingen kit.
- Fylle opp IVT mix volumet av 100 µL med nuclease-gratis H2O.
- Legge til 350 µL av lyseringsbuffer og blanding av pipettering opp og ned.
- Legg 250 µL av 100% etanol og bland igjen. Pipetter blandingen i kolonnene opprydding.
- Sentrifuger 15 s på 8000 x g og kast filtratet.
- Legge til 500 µL vaske bufferen i en kolonne, sentrifuge for 15 s på 8000 x gog fjern filtratet.
- Vask kolonnen 1 x med 500 µL av vaskebuffer og sentrifuger i 2 minutter på 8000 x g.
- Flytte kolonnen til en frisk 1.5-mL reaksjon rør. Elute mRNA 2 x av en 1-min inkubasjonstiden for 20 µL nuclease-gratis t2O på kolonnen membranen, etterfulgt av en 1-min sentrifugering med maksimal hastighet.
- Fjern fosfat gruppene fra mRNA bruker en dephosphorylation kit. Legge til 4,5 µL 10 x fosfatase bufferen og 1 µL av fosfatase mRNA og Inkuber 1t på 37 ° C.
- Rense mRNA igjen, følgende 2.5.1 - 2.5.7.
- Måle mRNA concertation med et fotometer.
- Bruke gel geleelektroforese for å analysere renhet og størrelsen på mRNA. Derfor forberede en agarose gel som beskrevet i trinn 2.3.9 - 2.3.10.
- Mix 3.3 µL formamide, 1 µL av 37% formaldehyd, 1 µL av 10 x menn og 1,7 µL av 6 x lasting fargestoff med 200 ng av mRNA og fylle den opp til 10 µL med nuclease-gratis H2O for hver utvalget og RNA markør.
- Inkuber en miks for 10 min ved 65 ° C i mRNA rødsprit. Last brønnene i gel med mRNA og RNA markør og kjøre gel 1t 100 V.
- Analysere gel med en gel doc stasjon med UV-lyset.
3. complexation av syntetiske mRNA
- Tine den syntetiske mRNA på is, vortex det og sentrifuger kort tid før røret.
- Bland 10 µL av syntetiske mRNA (mRNA konsentrasjon er 100 ng/µL) med 1 µL, 2,5 µL, 5 µL, 10 µL eller 20 µL av NLp suspensjon (NLp konsentrasjon er 3 mg/mL). Sentrifuge kort og ruge for 20 min ved romtemperatur (RT) for nanolipoplex-formasjonen.
Merk: Ikke bland av pipettering. Dette kan føre til tap av volumet. Vortex kort tid for en grundig blande. - Legg 1 mL av vanlig celle medium til nanolipoplexes og bland dem av pipettering opp og ned.
4. analyse av innkapsling effektiviteten av Nanoliposomes
- Bruke RNA kvantifisering kit for å utføre innkapsling eksperimenter.
- Klargjør fungerende løsning ved å fortynne fluorescerende fargestoff-1:200 for en høy-range og 1:2,000 for en lav-område analysen.
Merk: Tine fluorescerende fargestoff på is. Forbered arbeidet løsningen direkte før bruk. - Forberede de høy-range og lav-område standard kurvene med 1 mL av en 2 µg/mL lager løsning av eGFP mRNA i nuclease-fri H2O.
Merk: Standard kurvene, bruke mRNA som skal brukes i innkapsling eksperimenter. - Bruk tabell 3 forberedelse til høy-range standard (20 ng/mL - 1 µg/mL).
- Lav-område standard, fortynne 2 µg/mL eGFP mRNA lager løsning 1:20 for å oppnå en siste konsentrasjon 100 ng/ml. Forberede en lav-område standard (1 ng/mL - 50 ng/mL) som beskrevet i Tabell 4.
- Kombiner 1 µg av eGFP mRNA (10 µL) og 7,5 µg av NLps (2,5 µL) og Inkuber etter 20 min på RT.
Merk: Holde mRNA på isen for å unngå degradering. - Legge 1 mL av nuclease-fri H2O skjemaet nanolipoplexes og blanding av pipettering opp og ned.
- Legg til 1 mL av 1:200 eller 1:2,000 RNA fluorescerende farge fungerende løsning til innkapslet prøver og standarder og Inkuber i 5 min på RT i mørket.
- Pipetter standardene og prøver duplikater i en svart 96-brønns plate og måle fluorescens på 530 nm på en microplate leser (Figur 3).
5. forberedelse av cellene til Transfection
- Plate 1,5 x 105 A549 celler/vel av en 12-vel plate 1 d før transfection.
- Inkuber cellene på 37 ° C og 5% CO2 i vanlig celle medium (DMEM/høy glukose med 10% fosterets bovin serum [FBS], 2 mM L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin) for 24 timer før transfection.
6. hva cellene
- Vask det forberedt celler 1 x med 1 mL/godt PBS (uten Ca2 /Mg2 +).
- Legg 1 mL av forberedt nanolipoplex blanding, som inneholder 1 µg av eGFP mRNA innkapslet i 1-µL, 2.5-µL, 5-µL, 10-µL eller 20 µL NLps, en brønn av forberedt plate med A549 celler.
- Legg nanolipoplex suspensjon til cellene og ruge på vanlige betingelser for 24 timer å analysere hva effekten eller for 24 h og 72 h å analysere celle levedyktigheten etter hva.
Merk: Hva med NLps krever ikke en medium endring.
7. analyse for celle Transfection effekt ved hjelp av flowcytometri og fluorescens mikroskopi
- Fjerne nedbryting og vaske cellene med 1 mL/vel PBS (uten Ca2 +/Mg2 +) for å fjerne de gjenværende NLps.
- Forberede cellene flowcytometri.
- Trypsinize cellene med 500 µL/vel trypsin/EDTA (0,05%) ved 37 ° C i 3 min. stopp prosessen og deaktivere trypsin ved å legge det samme beløpet (500 µL/vel) regulært FBS inneholder medium.
- Sentrifuge celler for 5 min på 400 x g og fjern forsiktig nedbryting uten å berøre celle pellets.
- Vask cellene med 1 mL av PBS (uten Ca2 /Mg2 +).
- Resuspend cellene i 300 µL av 1 x fiksering løsning og overføre cellene i flyt cytometri rør.
- Analysere cellene på 488 nm i en flyt cytometer (figur 4A).
Merk: Vortex cellene 1 x direkte før måling.
- Forberede cellene fluorescens mikroskopi.
- Fastsette cellene med 1 mL/vel 100% metanol, som tidligere ble lagret på 20 ° C.
- Legger til 500 µL/vel 300 nM DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole) oppløst i PBS (uten Ca2 +/Mg2 +) og Inkuber i 5 min i mørket.
- Fjerne DAPI løsningen og vask cellene igjen med 100% metanol lagret på 20 ° C.
- Analysere cellene med fluorescens mikroskop (figur 4B).
Merk: Bruk følgende eksitasjon/utslipp bølgelengdene: eGFP 488/509 nm og DAPI 358/461 nm Cy3 550/570 nm.
8. celle levedyktighet analysen
- Oppløse 5 mg MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) i 1 mL av RPMI (uten fenol rød).
Merk: Oppløst Flerbordsturneringen må være ytterligere fortynnes 1:10 (siste konsentrasjon: 0,5 mg/mL) i RPMI før bruk. - Vask transfekterte cellene 3 x med 1 mL/godt PBS (uten Ca2 +/Mg2).
Merk: Restene av vanlig celle medium bør fjernes helt. - Legge til 500 µL/vel 1:10 utvannet MTT løsning til cellene og ruge 4 h på 37 ° C.
- Fjern MTT løsningen fra cellene etter inkubasjon og legge 500 µL/vel DMSO (dimethyl sulfoxide). Inkuber igjen i 10 min på 37 ° C.
- Pipetter DMSO løsningen i trillinger i en klar 96-brønnen-bunnplaten og mål av adsorpsjon på 540 nm likner en microplate.
- Angi levedyktigheten til ubehandlet cellen på 100% og beregne celle gjennomførbarheten av de andre gruppene i forhold til ubehandlet kontroll cellene (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av protokollen som beskrevet, var NLps bestående av lipider DC-kolesterol og dop forberedt med metoden tørrfilm (figur 1). Under utarbeidelse viser den nanoliposome løsningen ulike stadier i turbiditet (figur 2).
Innkapsling effekten av NLps kan deretter analyseres etter innkapsling av 1 µg av eGFP-koding mRNA ved å analysere gratis mengden mRNA, som ikke var innkapslet, ved hjelp av RNA kvantifisering kit (Figur 3).
Etter innkapsling av eGFP mRNA i forskjellige mengder NLps, dannet nanolipoplexes kan være inkubert med celler kan i vitro og andelen av eGFP-uttrykke celler analyseres ved hjelp av flyt cytometri 24 h posttransfection (figur 4A) . Selv 1 µL nanoliposome løsningen er tilstrekkelig for å oppnå en høy transfection av celler i vitro. Når cellene er transfekterte med NLps som inneholder Cy3-merket eGFP mRNA, tilstedeværelse av eGFP mRNA i cytoplasma (rød fluorescens), i tillegg til allerede produsert eGFP protein (grønt fluorescens) kan bli visualisert (figur 4B).
Siden transfection av celler ved hjelp av nanolipoplexes kan ha negative effekter på celler, levedyktigheten til cellene ble testet 24 h (figur 5A) og 72 h (figur 5B) posttransfection. Ingen effekter på cellen levedyktighet kan oppdages når cellene ble behandlet med 2,5 eller 5 µL av NLps eller nanolipoplexes, henholdsvis.
Figur 1: skjematisk oversikt over produksjonen av kationisk nanoliposomes. Først skal de oppløste lipider DC-kolesterol og dop blandes sammen i en glass kolbe. Andre synlige kloroform væsken skal være fordampet under argon eller nitrogen gasstrømmen og kloroform matrester skal tillates å fordampe overnatting i vakuum. Tredje dannet lipid filmen nederst på glass kolbe bør bli utvannet med nuclease-gratis H2O, etterfulgt av vortexing å danne multilamellar liposomer. Gjennom sonication og ekstrudering liposome løsningen produseres av klar-å-bruke unilamellar NLps. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: nanoliposome løsningen i ulike stadier under produksjon. (A) denne illustrasjonen viser liposome løsningen direkte etter utvanning av lipid filmen og vortexing for 15 min, samt (B) etter 1 time i et sonication bad (C) etterfulgt av 25 sykluser av ekstrudering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: innkapsling effekten av nanoliposomes. Dette panelet viser kvantifisering av gratis eGFP mRNA etter innkapsling i NLps. Resultatene presenteres som betyr ± SEM (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: hva effekten av nanolipoplexes. (A) dette panelet viser fastsettelse av det beste mRNA/nanoliposome forholdet til hva bruke ulike mengder NLps for å kapsle 1 µg av eGFP mRNA 24 h posttransfection. (B) dette panelet viser gjenkjenning av Cy3-merket syntetiske mRNA innkapslet i 2,5 µL NLps og det eGFP uttrykket i celler 24 h posttransfection (baren skala = 50 µm). Resultatene presenteres som betyr ± SEM (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: celle levedyktighet etter hva med nanoliposomes og innkapslet mRNA. Dette panelet viser måling av cellen levedyktighet bruke MTT analysen (A) 24 h og (B) 72 h posttransfection. Resultatene presenteres som betyr ± SEM (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Trinn | Temperaturen i ° C | Varighet |
| 1 | 95 | 5 min |
| 2 | 94 | 15 s |
| 3 | 55 | 1 min |
| 4 | 72 | 1 min |
| 5 | Gå til 2 30 x | |
| 6 | 72 | 10 min |
| 7 | 4 | Hold |
Tabell 1: PCR syklus protokoll for DNA amplifikasjon.
| Konsentrasjon | Beløp | |
| ATP | 7,5 mM | 4 ΜL |
| GTP | 1,875 mM | 1 ΜL |
| 5-Methylcytidin | 7,5 mM | 3 ΜL |
| Ψ | 7,5 mM | 3 ΜL |
| ARCA | 2,5 mM | 10 ΜL |
| DNA mal | 1,5 µg | |
| Buffer blanding | 1 x | 4 ΜL |
| T7 enzym blanding | 4ΜL | |
| RNase-hemmer | 1 ΜL | |
| Nuclease-fritt vann | Fyll opp til 40 µL | |
Tabell 2: Blander for den i vitro transkripsjon av DNA å mRNA.
| Antall nuclease-fri H2O (µL) | Volumet av eGFP mRNA høy-range lagerløsning (µL) | Volumet av 1:200 fluorescerende farge (µL) | Siste konsentrasjonen (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 1000 |
| 50 | 50 | 100 | 500 |
| 90 | 10 | 100 | 100 |
| 98 | 2 | 100 | 20 |
| 100 | 0 | 100 | tomme |
Tabell 3: Protokoll for en høy-range standardkurve.
| Antall nuclease-fri H2O (µL) | Volum av eGFP mRNA lav-område lager løsning (µL) | Volumet av 1:2000 fluorescerende farge (µL) | Siste konsentrasjonen (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 50 |
| 50 | 50 | 100 | 25 |
| 90 | 10 | 100 | 5 |
| 98 | 2 | 100 | 1 |
| 100 | 0 | 100 | tomme |
Tabell 4: Protokoll for en lav-område standardkurve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Presentert protokollen beskriver generasjonen av NLps med høy innkapsling virkningen for syntetisk endret mRNA og pålitelig transfection celler i vitro. Videre garanterer NLps utgivelsen av mRNA, som igjen oversettes til en funksjonell protein i cellene. I tillegg transfections ved hjelp av NLps kan utføres i vanlig celle medium, som resulterer i høy celle viabilities under transfection og sist opp til tre dager etter hva.
For å bruke mRNA som en terapeutisk, foretrekkes selvstendig montering system for dens levering. Vanligste transfection reagensene inkluderer kationisk lipider, inkludert liposomer. Som liposomer belastes positivt, kan negativt ladde nukleinsyrer være innkapslet i dem, og dermed slik at elektrostatisk skuldre frastøting cellemembraner skal overvinne35. Kationisk lipid DC-kolesterol har allerede blitt beskrevet i tidligere studier som en stabil og biokompatible kjøretøy36. Tillegg av den nøytrale lipid DOPE fører til en bedre hva effekten37. Vurderer disponerte fordelene nevnt ovenfor, disse lipider ble valgt for utarbeidelsen av NLps. I tillegg har tidligere studier vist at bruken av disse to lipider skyldes å foretrekke fremfor en økt mobilnettet transfection hastighet med negativt ladde nukleinsyrer38.
For vellykket generering av NLps og nanolipoplexes er det avgjørende å ta ekstra hensyn til noen av trinnene. Prosedyren for nanoliposome generasjon skal utføres under O2-gratis forhold. Tilstedeværelsen av O2 ved generering av NLp kan føre til nedbrytning av fosfolipider og redusert reproduserbarhet39. Videre tross endringer er mRNA svært følsom med hensyn til nedbrytning gjennom nucleases. Derfor for utvanning av lipid filmen anbefales bruk av RNase-fri H2O å hindre mRNA fornedrelse i løpet av complexation. RNase-gratis forhold bør også sikres for lagring av nanolipoplexes.
Videre kan NLps danne aggregater over tid på grunn av det ustabile termodynamisk systemet. Innflytelse parametere inkluderer Lagringstemperatur overflaten ansvaret for liposomer40. NLp aggregering kan medføre destabilisering av liposome membranen og risikoen for uønskede mRNA løslate41, fører til dårlig transfection effekt og mRNA fornedrelse i ekstracellulære plass. Men som tidligere vist, nanolipoplexes kan lagres på 4 ° C i opptil seks måneder uten aggregasjon eller tap av hva effekten35.
Ved hjelp av tilsatte utskilte fettstoffer som narkotika operatør system, kan to av de viktigste problemene med narkotika-leveranser bli løst. Liposomer beskytte innkapslede stoffet fra fornedrelse og kan passivt målet vev som har en usammenhengende endotelet, som lever eller benmarg16. For levering av terapeutiske nucleic syrer, for eksempel partikkelstørrelse innkapsling kapasitet er avgjørende for evaluering og cellular opptaket av liposomal kjøretøy. Spesielt størrelsen på liposomer i nanometer omfanget gir et samspill med cellemembranen42 og er dermed viktig i vivo bruk senere. Først bør liposomer være liten nok til å unngå klaring gjennom nyre- og leverfunksjon systemet43. Andre skal liposome størrelsen bidra til å overvinne den blodkar barriere å målrette cellene i ønsket orgel. Det ble rapportert at liposomer i størrelse rekke 100-300 nm kunne effektivt transfect hepatocytter44; men store liposomer (f.eks400 nm) klarte ikke å overvinne endothelial barriere45.
Selv om metoden beskrevet er etablert for mRNA levering, kan det også være implementert for andre nukleinsyre therapeutics, som microRNA. I en fersk studie viste vi at microRNA 126 kan målrettes selektivt, og derfor utviklingen av abdominal aorta aneurismer kan være effektivt hindret46. DNA/RNA therapeutics kan forårsake sideeffekter, for eksempel Platederivert aktivisering, når de kommer i direkte kontakt med celler, kan emballasje i liposomer unngå dette, dermed gjengi den ytterligere fordelaktig47. Derfor metoden presenteres her er svært allsidig og kan brukes til å utforme narkotika-leveranser for mange sykdommer. Etablerte protokollen ikke bare tillater rask og økonomisk generering av en effektiv mRNA carrier med en definert størrelse, men tilbyr også muligheten til å tilpasse lipid formulering behovene til et bestemt program: (1) størrelsen på den liposomer kan enkelt endres ved å endre filtrene; (2) på overflaten av de positivt ladede liposomer kan endres ved hjelp av, for eksempel polyetylenglykol, for å øke stabilitet og forsinkelse blod klaring under i vivo programmet48. Binding av spesifikke antistoffer mot liposomer lar målrettet levering av de innkapslede narkotika49. Videre undersøkelse og en mer detaljert innblikk i fysiske egenskaper, kan protokollen fortsatt forbedres.
Generasjonen av liposomer, tre er tilgjengelig: tørr-filmen, etanol injeksjon og omvendt-fase fordampning. I Yang et al. studien, disse tre produksjonsteknikker ble sammenlignet35. Det ble funnet at liposomer med en definert størrelse og en lik fordeling av løsningen kan genereres ved hjelp av metoden tørrfilm. Videre tørrfilm prosedyren ble utført i denne studien resulterte i produksjon av NLps med en definert størrelse 200 nm, en homogen distribusjon og høy innkapsling kapasitet.
På den ene siden den positive ladningen av liposomer fører til økt innkapsling kapasitet og bedre cellen overflaten fusion50,51,52, men på den annen side, det kan destabilisere cellemembranen og aktivere forskjellige immun aktivisering stier og celle død27,53. Men kan apoptotisk egenskapene til kationisk lipider minimeres ved å bruke de hjelper lipid DOPE54,55. I studien av Zhang et al., ble det funnet at 1:2 forholdet DC-kolesterol og dop under liposome generasjon fører til de mest effektive mobilnettet transfection bruker nukleinsyrer38. I metoden som er implementert i denne studien, lipid forholdet 1:2 DC-kolesterol og dop ble brukt i blandet lipid suspensjon under lipid filmen utarbeidelsen og forberedt liposomer førte til høy transfection effekt og samtidig, høy celle levedyktighet. Lignende resultater ble også funnet av andre forskere, som Ciani56 og Farhood37.
Samlet har liposomer vært brukt i år i kliniske forsøk, viser stor biocompatibility og lav toksisitet i vivo. I kombinasjon med mRNA, kan NLps brukes for effektiv levering av mRNA til celler eller organer i vitro og i vivo, for å indusere de novo syntesen av et protein som ønsket. Med hensyn til terapeutiske programmer, kan nanolipoplexes brukes, for eksempel i såret helbredende patcher transdermal mRNA levering57 aktivere celle regenerering, eller som en spray for tåke av mRNA58 for herding av lunge sykdommer59,60 som cystisk fibrose.
Presentert protokollen garanterer en enkel og tilgjengelig måte for generering av NLps med metoden tørrfilm, som kan brukes for effektiv innkapsling av in vitro transkribert mRNA og trygt transfection celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
| (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
| 4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
| BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
| Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
| Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
| Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
| Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
| Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
| RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
| Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
| Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
| GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
| peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
| Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |
References
- Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don't shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
- Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
- Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
- Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
- Youn, H., Chung, J. -K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8 (2014).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
- Michel, T., Wendel, H. -P., Krajewski, S. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. Kormann, M. , IntechOpen. 3-20 (2016).
- Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
- Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
- Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
- Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
- Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
- Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
- Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
- Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
- Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
- Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
- Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
- Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
- Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
- Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497 (2011).
- Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
- Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
- Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943 (2014).
- Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
- Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
- Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
- Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
- Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
- Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
- Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
- Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
- Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H.
- Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. "In vivo" distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
- Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
- Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
- Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
- Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
- Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
- Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
- Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
- Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
- Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
- Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
- Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
- Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
- Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
- Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504 (2015).
- Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
