Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

استخدام الإلكترون الرنين باراماجنيتيك في العينات البيولوجية في درجة الحرارة المحيطة و 77 ك

doi: 10.3791/58461 Published: January 11, 2019

Summary

مطيافية إلكترون الرنين باراماجنيتيك (EPR) أسلوب لا لبس فيها لقياس الجذور الحرة. يسمح استخدام المسابير تدور الانتقائي للكشف عن الجذور الحرة في الأقسام الخلوية المختلفة. نحن نقدم طريقة عملية وفعالة لجمع العينات البيولوجية التي تسهل معالجة وتخزين ونقل عينات للقياسات الجيش الشعبي الثوري.

Abstract

كشف دقيقة ومحددة للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) في الأقسام المختلفة من الخلايا والأنسجة وضروري لدراسة تنظم الأكسدة والاختزال إشارة في إعدادات البيولوجية. مطيافية إلكترون الرنين باراماجنيتيك (EPR) هو الأسلوب المباشر الوحيد لتقييم الجذور الحرة لا لبس فيه. ميزته هي أن يكشف المستويات الفسيولوجية للأنواع المحددة مع خصوصية عالية، ولكنه يتطلب التكنولوجيا المتخصصة وإعداد نموذج دقيق وضوابط ملائمة لضمان التفسير الدقيق للبيانات. هيدروكسيلاميني دوري تدور تحقيقات تتفاعل بشكل انتقائي مع فائق أكسيد أو الجذور الأخرى لتوليد إشارة نيتروكسيدي التي يمكن قياسها كمياً بالتحليل الطيفي الجيش الشعبي الثوري. المسابر نفاذية الخلية تدور وتدور المسابر المصممة لتتراكم سريعاً في الميتوكوندريا تسمح لتحديد تركيز أكسيد فائق في الأقسام الخلوية المختلفة.

في الخلايا المستزرعة، واستخدام 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine نفاذية الخلية (غروهارلم) جنبا إلى جنب مع ودون الخلية كتيمة فائق أكسيد الفاءق (الأحمق) المعالجة المسبقة، أو استخدام الخلية نفاذية شماعة-الهيئة العامة للسدود، يسمح التفريق بين من خارج الخلية من فائق أكسيد سيتوسوليك. 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido المتقدرية] كلوريد بيبيريدينيوم (ميتو-الإيقاع-ح) تسمح بقياس روس المتقدرية (الغالب فائق أكسيد).

يمكن أيضا تطبيق المسابير تدور والتحليل الطيفي الجيش الشعبي الثوري في فيفو النماذج. يمكن الكشف عن أكسيد فائق في السوائل خارج الخلية مثل الدم والسوائل السنخية، فضلا عن الأنسجة مثل أنسجة الرئة. يتم عرض عدة أساليب لمعالجة وتخزين الأنسجة للقياسات الجيش الشعبي الثوري وتقديم زيادة ونقصان (CPH) 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine عن طريق الحقن الوريدي مسبار فيفو. بينما يمكن إجراء القياسات في درجة حرارة الغرفة، العينات التي تم الحصول عليها من نماذج في المختبر و في فيفو يمكن أيضا تخزين في-80 درجة مئوية وتحليلها من قبل الجيش الشعبي الثوري في 77 ك. يمكن تخزين مستقرة أنابيب المتخصصة في-80 درجة مئوية وتشغيل ك 77 لتمكين عملية، تتسم بكفاءة، واستنساخه بطريقة تسهل تخزين ونقل عينات العينات.

Introduction

بينما تكتسي تدابير للأنواع الأكسجين التفاعلية والأكسدة هامة لدراسة الأمراض المتنوعة عبر جميع نظم الجهاز، الكشف عن الأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) يمثل تحديا سبب نصف العمر القصير وتفاعلية عالية. أسلوب رنين باراماجنيتيك (EPR) إلكترون هو الأسلوب الأكثر لا لبس فيها للكشف عن الجذور الحرة. تحقيقات تدور لها مزايا أكثر من المسابر الفلورسنت الأكثر استخداماً. على الرغم من المسابر الفلورية غير مكلفة نسبيا وسهلة الاستخدام وتوفير الكشف السريع وحساسة من روس، لديهم قيود خطيرة بسبب إشارات artifactual، وعدم قدرة على حساب تركيزات روس، ونقص عام في خصوصية1 .

لتسهيل استخدام الجيش الشعبي الثوري للدراسات البيولوجية، دول متنوعة تدور قد تم توليفها المسابير التي يمكن قياس مجموعة من الأنواع ذات الصلة بيولوجيا الجزئيات الحرة، فضلا عن بو2ودرجة الحموضة والأكسدة والاختزال32،، 45،،،من67. كما تم وضع الفخاخ تدور لالتقاط الجذور لم تدم طويلاً و adducts النموذج الطويل غلاء المعيشة، مما يسهل الكشف عن الجيش الشعبي الثوري8. يكون كل من الفئات (تحقيقات تدور وتدور الفخاخ) مزايا وقيود. فئة استخداماً من المسابر تدور بدوري هيدروكسيلامينيس، وهي الجيش الشعبي الثوري-صامت وتتفاعل مع الجذور لم تدم طويلاً لتشكيل نيتروكسيدي مستقرة. هيدروكسيلامينيس دوري تتفاعل مع فائق أكسيد 100 مرة أسرع من الفخاخ تدور، وتمكينهم من التنافس مع المواد المضادة للأكسدة الخلوية، لكنها تفتقر إلى الدقة وتتطلب استخدام عناصر التحكم المناسبة ومثبطات التعرف على الأنواع المتطرفة أو مصدر مسؤولة عن إشارة نيتروكسيدي. بينما تدور الفخاخ خصوصية المعرض، مع مميزة الطيفية أنماط تبعاً للأنواع المحاصرين، لديهم حركية بطيئة لأكسيد فائق تدور محاصرة ومعرضة للتحلل الأحيائي الراديكالي adducts. وكانت طلبات تعويض تدور موثقة توثيقاً جيدا في البحوث الطبية الحيوية9،10،11،،من1213.

والهدف من هذا المشروع إظهار أساليب الجيش الشعبي الثوري العملي لتصميم التجارب وإعداد العينات للكشف عن فائق أكسيد استخدام تدور تحقيقات في مقصورات خلوية مختلفة في المختبر وفي أنسجة مختلفة المقصورات في فيفو. وقد نشر المخطوطات عدة البروتوكولات ذات الصلة لهذه الأهداف، باستخدام المسابر نفاذية الخلية والخلية كتيمة المتقدرية تدور المستهدفة للنسيج في المختبر وعملية مختلفة من المقصورات الخلوية المستهدف للتحليل في نماذج الماوس 14 , 15-نحن نبني على هذه الهيئة للأدب بالتحقق من نهج لقياس أكسيد فائق باستخدام مجس تدور (غروهارلم) 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine في مقصورات خلوية مختلفة في المختبر للتأكد من دقة القياسات، وتسليط الضوء على المشاكل التقنية المحتملة التي قد تحرف النتائج. نحن نقدم أيضا أساليب لإجراء قياسات الجيش الشعبي الثوري في الدم والسوائل الغسل للفيسيولوجيا وأنسجة الرئة باستخدام مسبار تدور غروهارلم. هذه الدراسات المقارنة بين أساليب مختلفة لمعالجة الأنسجة، فضلا عن تقديم أسلوب آخر تدور المسبار، CPH، بحقن الفئران قبل الحصاد الأنسجة. وأخيراً، يمكننا وضع طريقة عملية لتخزين العينات في أنابيب تترافلوروايثيلين (PTFE) للسماح بتخزين ونقل العينات قبل القياسات الجيش الشعبي الثوري في 77 ك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ووافقت جامعة كولورادو دنفر رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة جميع الدراسات الحيوانية.

1-إعداد الكواشف

  1. الأسهم حمض (دتبا) ديثيلينيتريامينبينتاسيتيك (150 مم)
    1. إضافة ز 2.95 من دتبا (393.35 g/mol) إلى 10 مل مياه.
    2. لحل دتبا وإضافة 1 م هيدروكسيد الصوديوم دروبويسي وتقديمهم للرقم الهيدروجيني 7.0.
    3. الحجم 50 مل بالماء لتركيز دتبا نهائي من 150 مم، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  2. المخزن المؤقت للفوسفات المالحة (PBS) (50 ملم، ودرجة الحموضة 7.4)
    1. إعداد 5 أمتار من كلوريد الصوديوم (NaCl) (58.44 g/mol؛ 29.22 غ/100 مل).
    2. تحضير 1 م من البوتاسيوم الفوسفات مائي هونج كونج2بو4 (174.18 g/mol؛ 17.42 غ/100 مل)
    3. تحضير 1 م بوتاسيوم فوسفات مونوباسيك خ2ص4 (136.1 g/mol؛ 13.61 غ/100 مل). خلط 3 مل من كلوريد الصوديوم م 5 مع 4.24 مل م 1 البوتاسيوم الفوسفات مائي ومل 0.760 البوتاسيوم م 1 فوسفات مونوباسيك. فحص درجة الحموضة.
    4. جعل الحجم 100 مل مع المياه.
    5. تخزين في درجة حرارة الغرفة (RT) لفترات قصيرة (أيام)، وعند 4 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل (أسابيع).
  3. هينسيليت كريبس المخزن المؤقت (KHB) التي تحتوي على 100 ميكرومتر دتبا
    1. في أنبوب 50 مل المخروطية أجهزة الطرد المركزي، وإضافة ميليلتر 33.3 من 150 مم دتبا الأسهم الحل.
    2. تجلب إلى وحدة تخزين 50 مل مع المخزن المؤقت كريبس-هينسيليت (KHB).
    3. إعداد المخزن المؤقت الطازجة مع دتبا كل يوم وإبقائه في الرايت
  4. تريس يدتا المخزن المؤقت الذي يحتوي على السكروز
    1. إعداد المخزون تريس 0.5 M: حل ز 15.14 قاعدة تريس (121.14 g/mol) في 150 مل مياه. استخدام HCl، ضبط درجة الحموضة إلى 7.8 وتقديمهم إلى وحدة تخزين نهائي 250 مل.
    2. حل ز 21.4 السكروز (342.29 g/mol؛ والتركيز النهائي = 0.25 مم) في 150 مل مياه.
    3. إضافة 5 مل أسهم تريس السكروز لتحقيق تركيز تريس نهائي 10 ملم.
    4. إضافة مل 0.5 م 0.5 يدتا المخزون إلى تريس-السكروز لتحقيق تركيز نهائي 1 مم.
    5. فحص درجة الحموضة وضبطه إلى 7.4.
    6. إلى وحدة تخزين نهائي 250 مل مع المياه وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  5. كرات الدم الحمراء البقري النحاس/الزنك دسموتاز الفاءق (الأحمق) الأسهم (30,000 U/mL)
    1. إعادة تشكيل 30,000 "يو الأحمق" في 1 مل من برنامج تلفزيوني (حوالي 5.7 ملغ، اعتماداً على النشاط من الهيئة العامة للسدود الكثير).
    2. مزيج جيد، قاسمة، وتخزينها في-20 درجة مئوية لفترات قصيرة (6-12 شهرا)، وفي-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  6. الهيئة العامة للسدود العامل الحل (1000 U/mL)
    1. نقل من قاسمة 30 ميليلتر 30,000 الأحمق يو/مليلتر المخزون في ميليلتر 870 من PBS العقيمة.
    2. يبقى الحل على الجليد، واستخدامها من جديد.
  7. Phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) الأسهم (5 ملم)
    1. حل 1 مغ من سلطة النقد الفلسطينية (616.83 g/mol) في 325 ميليلتر من [دمس] (تركيز النهائي = 5 ملم).
    2. قاسمة حل سلطة النقد الفلسطينية 5 مم وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  8. حل العامل سلطة النقد الفلسطينية (125 ميكرومتر)
    1. تضعف من قاسمة 10 ميليلتر من رصيد سلطة النقد الفلسطينية 5 مم إلى 390 ميليلتر من PBS العقيمة.
    2. يبقى الحل على الجليد واستخدامه من جديد.
    3. عنصر تحكم سيارة لسلطة النقد الفلسطينية، تستخدم 10 ميليلتر من [دمس] في ميليلتر 390 من برنامج تلفزيوني.
  9. كلوريد ديفينيليودونيوم (DIP) (2.5 مم)
    1. حل 3.2 ملليغرام من تراجع (316.57 g/mol) في مل 4 للحصول على أسهم 2.5 ملم.
    2. إعداد الحل واستخدامه من جديد.
  10. الملح mesylate ديفيروكسامين (DFO) (20 مم)
    1. حل ملغ 4.5 من DFO (ز 656.79/mol) في 340 ميليلتر للحصول على رصيد 20 مم.
    2. إعداد الحل واستخدامه من جديد.
  11. إعداد أنتيميسين A (أإ) الأسهم (5 ملم)
    1. حل 5.4 ملغ AA (532 g/mol) في 2 مل إيثانول (التركيز النهائي = 5 ملم).
    2. قاسمة المخزون في قارورة من الزجاج ومخزن في-20 درجة مئوية.
  12. إعداد تحقيقات تدور
    1. فقاعة 50 مم الفوسفات العازلة التي تحتوي على 100 ميكرومتر دتبا مع النيتروجين لمدة 30 دقيقة لإزالة الأوكسجين الذائب من المخزن المؤقت.
    2. إزالة المسبار تدور من الثلاجة-20 درجة مئوية والسماح للحاويات القادمة إلى RT (10-15 دقيقة).
    3. تزن من 2.4 ملغ 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (غروهارلم) (237.8 غ/مول)
    4. يذوب غروهارلم في 1 مل فوسفات deoxygenated المخزن المؤقت الخاص بتركيز نهائي 10 ملم.
    5. تزن من 5 ملغ كلوريد 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium (ميتو-الإيقاع-ح) (529.1 g/mol).
    6. يذوب ميتو-الإيقاع-ح في 1 مل فوسفات deoxygenated المخزن المؤقت الخاص بتركيز نهائي من 9.5 ملم.
    7. تزن من 4.9 مغ 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (CPH) (223.7 g/mol).
    8. حل CPH إلى 1 مل فوسفات deoxygenated المخزن المؤقت الخاص بتركيز نهائي من 22 ملم.
    9. مخزن في-80 درجة مئوية وقاسمه (لا ينصح بتجميد أذاب).

2-الكشف عن أكسيد فائق في المختبر

  1. الكشف عن فائق أكسيد الكامل وخارج الخلية وداخل الخلية في الخلايا 264.7 الخام حفز سلطة النقد الفلسطينية في الرايت
    1. وبعد الأسلوب العقيم السليم، إذابة الخلايا 264.7 الخام وممر لهم في وسائل الإعلام دميم وتستكمل مع 10% FBS (منخفضة خالية من الذيفان) و 1% فطري/الأمبيسلّين عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO.
    2. خلايا 264.7 الخام البذور في 1 × 106 خلايا/كذلك في لوحات 6-جيدا قبل العلاج بيوم واحد.
    3. بلطف قم بإزالة الوسائط وغسل الخلايا مرة واحدة مع 1 مل KHB المخزن المؤقت.
    4. إضافة KHB تحتوي على 100 ميكرومتر دتبا لكل بئر، وعلاج في إجمالي حجم 500 ميليلتر بما يلي:
    5. لآبار pretreated مع الهيئة العامة للسدود، إضافة 15 ميليلتر/جيدا لحل العمل الأحمق (1000 يو/مليلتر؛ والتركيز النهائي للهيئة العامة للسدود = 30 U/mL) واحتضانها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية قبل إضافة غروهارلم وسلطة النقد الفلسطينية.
    6. إضافة ميليلتر/جيدا 12.5 ملم 10 غروهارلم المخزون (التركيز النهائي = 0.25 مم).
    7. إضافة 40 ميكروليتر/جيدا من 125 ميكرومتر PMA العامل الحل (تركيز النهائية = 10 ميكرون) أو 40 مركبة ميليلتر (الأوراق المالية 10 ميليلتر من [دمس] في ميليلتر 390 من برنامج تلفزيوني).
    8. احتضان لمدة 50 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO.
    9. إزالة اللوحات من الحاضنة ووضعها مباشرة على الجليد.
    10. تجمع المخزن المؤقت من كل بئر منفصلة، مل 1.5، المسمى أنابيب. الحفاظ على الجليد في جميع أنحاء.
    11. إضافة 100 ميليلتر من جديد KHB مخزن يحتوي على 100 ميكرومتر دتبا ولطف كشط الخلايا وريسوسبيند من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات. الحفاظ على الجليد في جميع أنحاء استثارة الخلية.
    12. تحميل العينة التي جمعت في الخطوات 2.1.10 و 2.1.11 (50 ميليلتر) في كل من هذه الأنابيب الشعرية. ختم كلا طرفي وتشغيل الجيش الشعبي الثوري.
      ملاحظة: دائماً اختبار أنبوب أو جيدا (بدون خلايا) التي تتضمن التحقيق في المخزن المؤقت (نفس تركيز = 0.25 مم)، والمعالجة تحت نفس الشروط المطبقة على الخلايا (نفس الحضانة الوقت ودرجة الحرارة) كعنصر تحكم، نظراً لكثافة الخلفية للتحقيق هو درجة الحرارة- وتعتمد على الوقت.
    13. تعيين معلمات اقتناء الجيش الشعبي الثوري على ما يلي: تردد الموجات = 9.65 غيغاهرتز؛ مركز الحقل = 3432 ز؛ تعديل السعة = ز 2.0؛ اكتساح العرض = 80 ز؛ الميكروويف السلطة = 19.9 ميغاواط؛ العدد الإجمالي لعمليات التفحص = 10؛ اكتساح الوقت = 12.11 s; ووقت ثابت = 20.48 مرض التصلب العصبي المتعدد.
  2. الكشف عن فائق أكسيد الميتوكوندريا في الخلايا 264.7 الخام
    1. اتبع الخطوات 2.1.1 و 2.1.2 للبذور الخام 264.7 الخلايا قبل التجربة بيوم واحد.
    2. قم بإزالة الوسائط وغسل الخلايا مرة واحدة مع 1 مل KHB المخزن المؤقت.
    3. إضافة 200 ميليلتر من KHB التي تحتوي على 100 ميكرومتر دتبا لكل بئر.
    4. إضافة 5.3 ميليلتر/جيدا من الأسهم ميتو-الإيقاع-ح 9.5 مم (التركيز النهائي = 0.25 مم)
    5. احتضان لمدة 10 دقائق في الرايت
    6. أضف 1 ميليلتر/بئر أنتيميسين A (أإ)، حل الأسهم 5 ملم في الإيثانول (التركيز النهائي = 25 ميكرومتر).
    7. احتضان لمدة 50 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO.
    8. إزالة اللوحات من الحاضنة ووضعها مباشرة على الجليد.
    9. بلطف كشط الخلايا وريسوسبيند بيبيتينج صعودا وهبوطاً. الحفاظ على الجليد.
    10. تحميل العينة في أنبوب شعري. ختم كلا طرفي.
    11. راجع المقطع السابق لإعداد الجيش الشعبي الثوري.
  3. الكشف عن أكسيد فائق في زنزانات 264.7 الخام في ك 77
    1. مكان المخزن المؤقت التي تم جمعها في الخطوة 1.1.10 في المعدة مسبقاً PTFE أنابيب 1-2 بوصة في الطول (3/16 "OD x 1/8" معرف). تأكد من أنابيب PTFE مستقيم حتى أنه يمكن بسهولة إدراجها وإزالتها من الإصبع ديوار. استخدام سداده مطاطية لإغلاق واحدة من نهاية الأنبوب PTFE، "الماصة؛" المخزن المؤقت أو تعليق خلية (100 إلى 150 ميليلتر) في الأنبوب PTFE، وختم الأنبوب بسداده ثانية.
    2. فلاش تجميد العينة في نيتروجين سائل. يمكن تحويلها إلى أنبوب للواسمات مسمى للتخزين في-80 درجة مئوية العينة أو تشغيل فورا.
    3. ملء الإصبع ديوار مع النتروجين السائل وإدراج الأنبوب PTFE المحتوية على العينة في الإصبع ديوار. يجب التأكد من العينة تركزت في الفضاء النشطة من جهاز رنان وتشغيل الجيش الشعبي الثوري في 77 ك.
      ملاحظة: بدء تدفق غاز النيتروجين إلى جهاز مطياف 15-30 دقيقة قبل القياسات، وتواصل هذا التدفق في جميع أنحاء القياسات لمنع التكثيف الماء في جهاز رنان.
    4. تعيين معلمات اقتناء الجيش الشعبي الثوري على ما يلي: تردد الموجات = 9.65 غيغاهرتز؛ مركز الحقل = ز 3438؛ تعديل السعة = 4.0 ز؛ اكتساح العرض = 150 غ؛ الميكروويف السلطة = 0.316 ميغاواط؛ العدد الإجمالي لعمليات التفحص = 10؛ اكتساح الوقت = 60 ثانية؛ ووقت ثابت = 1.28 مرض التصلب العصبي المتعدد.

3-الجيش الشعبي الثوري القياسات في السوائل

  1. الدم كله
    1. علاج الفئران (8-12 أسابيع من العمر) مع جرعة واحدة لإعطاء بليوميسين (بلو؛ 100 ميليلتر في 1 يو/مليلتر) حله في برنامج تلفزيوني أو برنامج تلفزيوني وحدها كما هو موضح سابقا16،17.
    2. Euthanize الفئران بإدارة isoflurane المستنشقة (1.5-4 ٪) تليها اكسسانجوينيشن والتفكك عنق الرحم. نضح الدم عن طريق البطين الأيمن في محقن المغلفة مع الهيبارين (جامعة جنوب المحيط الهادئ 1000 مليلتر) التي تحتوي على 100 ميكرومتر دتبا ونقل إلى أنبوب 1.5 مل.
    3. في أنبوب منفصل 1.5 مل، إضافة 15 ميليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 100 ميكرومتر دتبا و 3 ميليلتر من غروهارلم (10 مم) إلى 132 ميليلتر من الدم لإجمالي حجم 150 ميليلتر وتركيز غروهارلم النهائي من 0.2 مم.
    4. احتضان الدم لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    5. إزالة الأنابيب من حوض ماء.
    6. تأخذ قاسمة بتحميل الدم في أنبوب شعري وتشغيل الجيش الشعبي الثوري في الرايت مع الجيش الشعبي الثوري الحصول على المعلمات التالية: الموجات التردد = 9.65 غيغاهرتز؛ مركز الحقل = 3432 ز؛ تعديل السعة = 1.0 ز؛ اكتساح العرض = 80 ز؛ الميكروويف السلطة = 19.9 ميغاواط؛ العدد الإجمالي لعمليات التفحص = 3؛ اكتساح الوقت = 12.11 s; ووقت ثابت = السيدة 20.48 بدلاً من ذلك، يمكن فلاش العينات المجمدة كما هو موضح في الخطوة 2، 3 للقياسات في 77 ك. الجيش الشعبي الثوري لبارامترات هي التالية: الموجات التردد = 9.65 غيغاهرتز؛ مركز الحقل = ز 3438؛ تعديل السعة = 4.0 ز؛ اكتساح العرض = 150 غ؛ الميكروويف السلطة = 0.316 ميغاواط؛ العدد الإجمالي لعمليات التفحص = 2؛ اكتساح الوقت = 60 ثانية؛ ووقت ثابت = 1.28 مرض التصلب العصبي المتعدد.
  2. للفيسيولوجيا الغسل السائل (بالف)
    1. بعد القتل الرحيم (راجع الخطوة 3.1.2)، جمع بالف بغرس ببطء وسحب 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 100 ميكرومتر دتبا ثلاث مرات في حقنه عن طريق وضع قنية في القصبة الهوائية.
    2. في أنبوب 1.5 مل، علاج 200 ميليلتر من بالف مع 4 ميليلتر من غروهارلم (10 مم) للحصول على تركيز نهائي من 0.2 مم.
    3. احتضان بالف لمدة 50 دقيقة في 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    4. أنابيب من حوض ماء ووضعها على الجليد.
    5. تحميل بالف في الأنبوبة الشعرية وتشغيل الجيش الشعبي الثوري في الرايت مع الجيش الثوري الشعبي نفس الإعدادات المستخدمة في الخطوة 1-1-13، أو تجميد فلاش في النتروجين السائل كما هو موضح في الخطوة 2، 3.
  3. قياسات الجيش الشعبي الثوري في الدم وبالف في ك 77
    1. اتبع البروتوكول أعلاه لجمع الدم (الخطوات 3.1.1. إلى 3.1.4) وبالف (خطوات 3.2.1 إلى 3.2.4).
    2. مكان 150 ميليلتر من الدم المعالجة أو بالف في PTFE أنابيب (في 1-2). استخدام سداده مطاطية لإغلاق واحدة من نهاية الأنبوب PTFE قبل إضافة العينة وسداده أخرى لإغلاق الأنبوب.
    3. فلاش تجميد العينة في نيتروجين سائل.
    4. انظر الفرع 2-3 للحصول على تفاصيل حول تشغيل الجيش الشعبي الثوري في العينات المجمدة في أنابيب PTFE استخدام الإصبع ديوار في 77 ك. تشغيل المجمدة غروهارلم تعامل مع عينات الدم في غضون أسبوع.

4-الجيش الشعبي الثوري القياسات في أنسجة الرئة

  1. فلاش أنسجة الرئة المجمدة
    1. بعد جمع بالف في الخطوة 3.2.1، يتم فتح الصدر والرئتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة عن طريق مسح البطين الأيمن لإزالة الدم. فلاش تجميد أنسجة الرئة في نيتروجين سائل. ويمكن تخزين أنسجة الرئة المجمدة في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر حتى استخدام للقياسات الجيش الشعبي الثوري.
    2. تثبيت أنسجة الرئة على الثلج الجاف بملاقط وقطع قطع صغيرة متعددة (5-15 ملغ) من أنسجة الرئة باستخدام شفرة حافة واحدة.
    3. وزن الأنسجة في أنبوب 1.5 مل ووضع الأنبوب بالمقياس والفارغة في الجدول، ثم إضافة قطع الأنسجة وتسجيل الوزن.
    4. للنسيج في أنبوب 1.5 مل، إضافة 196 ميليلتر من KHB المحتوية على دتبا و 4 ميليلتر من غروهارلم (0.2 مم) لتحقيق إجمالي 200 ميليلتر.
    5. احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    6. تدور إلى أسفل (لثوان قليلة) في ميكروسينتريفوجي في 3,884 س ز.
    7. على الجليد و "الماصة؛" 150 ميليلتر من المادة طافية في الأنبوب PTFE وتجميد للقياسات ك 77 كما هو موضح في الفرع 2-3.
      ملاحظة: لاستخدام هذا الأسلوب، إلى التباين في الضرر الذي يلزم النظر فيها. من إصابة في الرئة الناجمة عن بليوميسين، نظراً لأن ذلك إصابة شديدة غير متجانسة، من المستحسن قطع عدة قطع الأنسجة من أجزاء مختلفة من الرئة من كل الماوس. وبدلاً من ذلك، يمكن تجانس أكبر قطعة من النسيج في KHB المخزن المؤقت الذي يحتوي على 100 ميكرومتر دتبا على نسبة الوزن إلى حجم 1:6 (ملغم/ميليلتر) كما هو موضح أدناه.
  2. أنسجة الرئة الطازجة تحفظ في المخزن المؤقت السكروز
    1. مسح الرئتين لافاجيد مع برنامج تلفزيوني الباردة لإزالة الدم كما فعلت في الخطوة 3.1.2.
    2. مجانسة أنسجة الرئة الطازجة في تريس يدتا المخزن المؤقت الذي يحتوي على السكروز 0.25 م بنسبة 1:6 الرئة/المخزن مؤقت (ملغم/ميليلتر) استخدام طاحونة الأنسجة دونس مع الزجاج أو مدقة PTFE.
    3. إضافة 50 ميليلتر من هوموجيناتي الرئة إلى 450 ميليلتر من KHB التي تحتوي على 100 ميكرومتر دتبا.
    4. في أنبوب 1.5 مل (في إجمالي حجم 100 ميليلتر)، إلى 98 ميليلتر من الرئة هوموجيناتي في KHB، إضافة 2 ميليلتر من غروهارلم رصيد 10 ملم للحصول على تركيز نهائي من 0.2 مم.
    5. احتضان لمدة 20 دقيقة 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    6. وضع العينات في الثلج وتحميلها في أنبوب شعري. تشغيل الجيش الشعبي الثوري في الرايت (الإعدادات المستخدمة في الخطوة 2.1.13).
    7. لاختبار مساهمة محددة الأنواع والمصادر باستخدام مثبطات مختلفة، قبل علاج ميليلتر 88 من الرئة هوموجيناتي +/-مثبط، ضبط مع KHB لتحقيق وحدة تخزين نهائي من 98 ميليلتر. وفي هذه التجربة، شملت مثبطات 10 ميليلتر من الهيئة العامة للسدود (100 U/mL)، 4 ميليلتر من ديفيروكسامين (DFO؛ التركيز النهائي = 800 ميكرون)، أو 4 ميليلتر من كلوريد ديفينيليودونيوم (DIP؛ والتركيز النهائي = 100 ميكرومتر). احتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    8. إضافة 2 ميليلتر من غروهارلم واحتضانها لآخر 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، تليها القياسات الجيش الشعبي الثوري كما هو موضح أعلاه. وتشمل عينة فارغة مطابقة مرة واحدة مع KHB غروهارلم تحتوي على السكروز المخزن المؤقت. وبدلاً من ذلك، تخزن مختبرين homogenates الرئة المتبقية (الخطوة 3.1.2) في-80 درجة مئوية للقياسات المقبلة.
      ملاحظة: يمكن تغيير الحجم الإجمالي حسب الحاجة.
  3. قياسات الجيش الشعبي الثوري في أنسجة الرئة من الفئران حقن تدور تحقيقات في فيفو (باستخدام خلايا الأنسجة RT)
    1. تحضير حل الأسهم CPH بإذابة 4.9 مغ CPH في 1 مل من المخزن المؤقت للفوسفات التي تمت تصفيتها و deoxygenated 50 مم.
    2. تخدير الفئران مع isoflurane المستنشقة (1.5-4%) لمدة 20-30 ثانية حتى لا يستجيب إلى أخمص القدمين قرصه. حقن الفئران عبر الطريق ريتروربيتال مع 100 ميليلتر CPH تدور المسبار لوزن جسم ماوس ز 25 (الجرعة النهائية = 20 مغ/كغ)، وتسمح بالتحقيق معه لتعميم حاء 1 فورا بعد الحقن ريتروربيتال، أضف قطره واحدة من بروباراكيني 0.5% HCl على منطقة العين إلى بريف ألم nt في العين وجفاف. رصد الفئران ح 1 والشروع في قطع الأنسجة.
    3. حصاد أنسجة الرئة كما هو موضح أعلاه وفلاش تجميد الرئتين.
    4. قص 20-30 ملغ أنسجة المجمدة في الثلج الجاف وتسجيل الوزن الدقيق.
    5. امسح برفق الأنسجة مع التنظيف مناديل ﻻستيعاب أي المياه السطحية.
    6. ضع الأنسجة داخل إطار الخلية الأنسجة (ملحق يسمح قياسات الجيش الشعبي الثوري لعينات الأنسجة) وتشغيل الجيش الشعبي الثوري لتحديد مجموع يدور. ويمكن التعبير عن البيانات كمجموع يدور كل مغ أنسجة.

5-بيانات التحليل

  1. محاكاة الأطياف المنتجين استخدام الوحدة النمطية سبينفيت إدراجها في برامج زينون من مطياف امكسنانو الجيش الشعبي الثوري في مقاعد البدلاء-أعلى. تحديد تركيز نيتروكسيدي من قبل الوحدة النمطية سبينكونت. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء منحنى معايرة من نيتروكسيدي مستقرة مثل 4-هيدروكسي-الإيقاع أو تيمبول، والتركيز يمكن الحصول عليها عن طريق مقارنة كثافة إشارة بعينه ومعيار.
  2. للبيانات التي تم جمعها في ك 77، استخدام التكامل المزدوج متبوعاً سبينكونت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم التحقق من صحة الكشف عن فائق أكسيد استخدام غروهارلم استخدام X/إكس فائق أكسيد توليد نظام لإثبات أن كان تماما تحول دون إشارة نيتروكسيدي (سم.) من الهيئة العامة للسدود، بينما حدث ليس له أي أثر (الشكل 1A). ثم تم تقييم دِيسمُوتاز المجموع، خارج الخلية في الخلايا 264.7 الخام قبل تحضين الخلايا مع التحقيق تدور غروهارلم نفاذية الخلية +/-المعالجة المسبقة الأحمق. وتم قياس تركيز نيتروكسيدي في تعليق خلية والعازلة، مما يدل على أن القيم الموجودة في نموذج نوعي متشابهة نظراً للطبيعة المسامية والموازنة السريعة للتحقيق زيادة ونقصان (الشكل 1B). إشارة جذرية نيتروكسيدي زيادة في الخلايا 264.7 الخام حفز مع سلطة النقد الفلسطينية بالمقارنة مع خلايا المراقبة. كان يخفف هذا الإشارة إلى حد كبير في الخلايا pretreated مع أبله خلية كتيمة (الشكل 1). يمثل كل لون الآبار اختبارها في أيام مختلفة، مما يدل على اتساق البيانات التي تم جمعها في أيام محددة وإمكانية تكرار نتائج النتائج عبر الزمن. وتقرر تركيز أكسيد فائق خارج الخلية بطرح الإشارات في الخلايا PMA pretreated مع الهيئة العامة للسدود من الإشارة بعد سلطة النقد الفلسطينية في الغياب من "الهيئة العامة للسدود" (T). إشارة الباقية تعزى إلى أكسيد فائق داخل الخلايا (الشكل 1). ويوضح الشكل 1 حساب المجموع وخارج الخلية فائق أكسيد. (ه وأكد الإشارات داخل الخلايا) في الخلايا المعالجة بسلطة النقد الفلسطينية بعد إزالة وسائط الإعلام، وتأثير شماعة-الهيئة العامة للسدود على الإشارة. في هذا الرسم البياني، وعلى النقيض من (ج)، عدم طرح غروهارلم فارغة من القياسات، ويتم عرض البيانات الخام.

فائق أكسيد الميتوكوندريا في الخلايا 264.7 الخام تم الكشف عن استخدام الجيش الشعبي الثوري تدور مسبار ميتو-الإيقاع-H، التي تتراكم في ميتوتشونديا. (أ) ممثل الجيش الشعبي الثوري الأطياف لإشارة ميتو-الإيقاع-ح خط الأساس في المخزن المؤقت، إشارة ميتو-الإيقاع-ح زيادة في الخلايا التحكم (Con)، وكذلك الإشارات المعززة في خلايا حفز مع مثبطات الميتوكوندريا A أنتيميسين (أإ). كانت تعزى الزيادة في الإشارة إلى فائق أكسيد المتقدرية استناداً إلى دراستنا السابقة تبين أن overexpression SOD2 قياسات الموهن إلى حد كبير مع ميتو-الإيقاع-ح10. في الشكل 2، تقرر تركيز نيتروكسيدي الميتوكوندريا بطرح إشارة ميتو-الإيقاع-ح في المخزن المؤقت لمطابقة الوقت من قياسات خلية. إشارة سم. التي تم الحصول عليها في درجات حرارة منخفضة في الخلايا 264.7 الخام بعد التحفيز مع سلطة النقد الفلسطينية في وجود وغياب الهيئة العامة للسدود. (الشكل 3 أ) وكان يخفف إشارة سم. حضور الهيئة العامة للسدود، متسقة مع بيانات درجة حرارة الغرفة (الشكل 1). ويبين الشكل 3B صورة PTFE أنابيب مع سدادات المستخدمة لجمع البيانات في ك 77 للخلايا و في فيفو عينات. تم الكشف عن إنتاج أكسيد فائق في الدم واستخدام المسبار تدور غروهارلم بالف. وجمعت من برنامج تلفزيوني وبليو يعامل الفئران عينات الدم أو بالف والمحتضنة فورا مع غروهارلم. نقل العينات إلى PTFE أنابيب وفلاش مجمدة، وتم جمع بيانات الجيش الشعبي الثوري في 77 ك. تركيز نيتروكسيدي (سم.) المتراكمة في الدم المحتضنة مع غروهارلم (0.2 مم) عند 37 درجة لمدة 10 دقائق (الشكل 4 أ). تركيز نيتروكسيدي (سم.) من بالف المحتضنة لمدة 50 دقيقة (الشكل 4 باء). يمثل تركيز نيتروكسيدي التركيز (سم.) المتراكمة في حجم الدم أو بالف المستخدمة في التجربة.

واختبرت ثلاثة أساليب لتقييم تقنيات نشر عدة للحفاظ على النسيج وإدارة تدور تحقيقات السابقين فيفو مقابل. المجراة في. لإجراء قياسات الجيش الشعبي الثوري على أنسجة الرئة، ونحن أولاً استخدام أنسجة الرئة المجمدة فلاش من عنصر التحكم أو إصابة الفئران. ويبين الشكل 5A إشارة سم. المجموع في المادة طافية من قطعة صغيرة من أنسجة الرئة المحتضنة في 37 درجة مئوية مع غروهارلم في برنامج تلفزيوني وبليو يعامل الفئران، على التوالي. نظراً لعدم تجانس إصابة الرئة بعد العلاج بليو، ينصح بقص قطعة من مختلف المناطق في الرئة ومتوسط قياسات عدة لتوفير قيمة أكثر تمثيلاً. بدلاً من ذلك، يمكن للمرء تجانسه الرئة كاملة واستخدام عينة واحدة من هذا هوموجيناتي. جمع البيانات في 77 ك استخدام أنابيب PTFE والإصبع ديوار. 5B الرقم يظهر أطياف الممثل إشارات نيتروكسيدي (سم.) من برنامج تلفزيوني وبليو يعامل الفئران، على التوالي.

حد واحد لعلاج الرئة الأنسجة السابقين فيفو هو أنه من غير الممكن التمييز موثوق خارج الخلية من أكسيد فائق داخل الخلايا بسبب تجهيز الأنسجة التي يعطل أغشية الخلية. إذا كانت هذه المعلومات هامة لمسألة تجريبية، فإنه يمكن الوصول إليها باستخدام في فيفو CPH تقطير الطريقة الموضحة أدناه. لا يمكن استخدام الأنسجة المجمدة تقدير فائق أكسيد المتقدرية؛ على الرغم من البروتوكول لهذا القياس، ويمكن تكييفها لاستخدام ميتو-الإيقاع-ح في الأنسجة أو الميتوكوندريا المعزولة حديثا.

كطريقة ثانية للقياسات الجيش الشعبي الثوري في أنسجة الرئة، وكان تجانس الأنسجة الطازجة في المخزن المؤقت السكروز. وكان المحتضنة هوموجيناتي الرئة مع المسبار غروهارلم KHB المخزن المؤقت الذي يحتوي على دتبا. أجريت قياسات المنتجين خارج في الرايت 6A الشكل يوضح الزيادة في سم. مع بلو. وقد عرضنا إجراء اختبارات إضافية باستخدام الموانع المختلفة التي يمكن استخدامها لتحديد الأنواع التي تسهم في سم. إشارة. توضيح أصل سم. الإشارات المتولدة من أنسجة الرئة، ونحن pretreated homogenates الرئة مع العديد من عمال النظافة ومثبطات الإنزيمات. المحتضنة homogenates الرئة مع غروهارلم في الغياب أو وجود كلوريد الأحمق، ديفيروكسامين (DFO)، وديفينيليودونيوم (DIP) الحساب (على التوالي) للمساهمات من فائق أكسيد الحديد أو أكسيد فائق المتولدة من المحتوية على فلافين الإنزيمات (الشكل 6B). وهذا النهج يمكن تكييفها لتقييم الأنواع متطرفة معينة التي تم إنشاؤها في نظام أو توضيح مساهمة أخرى مصادر الانزيمية (مثلاً.، أكاسيد النيتروجين أو انوش زانتيني أوكسيديز).

تم حقن الفئران ب CPH تدور المسابر (20 مغ/كغ) عبر الطريق ريتروربيتال لإجراء قياسات الجيش الشعبي الثوري في فيفو. أنه لا يعرف ما إذا كان غروهارلم يمكن بأمان إدارة للحيوانات، في حين تم الإبلاغ عن التحقيق CPH تكون غير سامة؛ وهكذا، اخترنا CPH للتجارب في فيفو . وكانت أنسجة الرئة المقطوع وفلاش المجمدة في النتروجين السائل ح 1 بعد تداول المسابير CPH. ويمكن علاج الفئران في نفس الوقت مع مضادات الأكسدة محددة للتمييز بين الأنواع المسؤولة عن الإشارة. ويبين الشكل 7 ألف حزب المحافظين أعلى. إشارة في الفئران المعالجة بليو مقارنة بالفئران التحكم. أطياف الممثل أنسجة الرئة من التحكم والفئران المعالجة بلو مبينة في الشكل 7B. أطياف الجيش الشعبي الثوري مختلطة من CP. وقد لوحظ الراديكالي حمض الأسكوربيك. تكون القيم المبلغ عنها في الشكل 7 ألف تركيزات CP. مكونات. تم جمع البيانات في الرايت استخدام خلايا الأنسجة.

Figure 1
رقم 1: الكشف عن أكسيد فائق في المقصورات خلية مختلفة. (A) أطياف الجيش الشعبي الثوري إنشاؤها بواسطة 0.25 مم غروهارلم في 0.5 مم هيبوكسانثيني/زانتيني أوكسيديز (8 mU/mL) مع أو بدون أبله (30 U/mL). (ب) الخام 264.7 الخلايا (1 × 106 خلايا/جيد) حفز مع 10 ميكرون سلطة النقد الفلسطينية حضور غروهارلم 50 دقيقة بتركيز 37 درجة مئوية ونيتروكسيدي (ميكرومتر) اكتشف في تعليق خلية (خلايا + المخزن المؤقت) والمخزن المؤقت التي تم جمعها من الخلايا المعالجة. (ج) الخام 264.7 خلايا حفز مع سلطة النقد الفلسطينية مقابل. أداة التحكم (Con). مجموعة واحدة من الخلايا كانت pretreated لمدة 10 دقائق مع 30 خلية كتيمة الأحمق يو/مليلتر (سلطة النقد الفلسطينية + الهيئة العامة للسدود). يمثل كل لون البيانات من أيام تجريبية مختلفة وكل نقطة تمثل الخلايا من فرد أيضا. إشارة نيتروكسيدي في فراغ وقت المطابقة مع غروهارلم في KHB طرح من كل إشارة الحصول على القيم النهائية. (د) حساب فائق أكسيد المجموع وخارج الخلية في سلطة النقد الفلسطينية وحفز الخلايا؛ T = مجموع أكسيد فائق، EC = دِيسمُوتاز خارج الخلية (إشارة إينهيبيتابل الهيئة العامة للسدود). (ه) لتقييم إشارة فائق أكسيد داخل الخلايا (IC)، كان الإشارة في المخزن المؤقت بعد PMA + الهيئة العامة للسدود مقارنة بالخلايا المعالجة بسلطة النقد الفلسطينية بعد إزالة المخزن المؤقت. لتأكيد، الآبار كانت pretreated مع 60 يو/مليلتر نفاذية الخلية شماعة-الهيئة العامة للسدود لساعة ونصف لتحديد أبله داخل الخلايا إينهيبيتابل. تظهر فارغة غروهارلم المطابقة وقت، وتعكس البيانات إشارة نيتروكسيدي المطلق. بيانات معبراً عنها يعني ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الكشف عن فائق أكسيد الميتوكوندريا في الخلايا الخام حفز مع أنتيميسين أ (A) الممثل أطياف تدور الجيش الشعبي الثوري المتقدرية الخاصة بالتحقيق، 0.25 مم ميتو-الإيقاع-ح في الخلايا 264.7 الخام دون (Con) أو مع 25 ميكرومتر أنتيميسين A (أإ) لمدة 50 دقيقة عند 37 درجة مئوية. (ب) سم. تركيز (ميكرومتر) في الخلايا تعامل مع AA مقارنة بعنصر التحكم. إشارة نيتروكسيدي في فارغة ميتو-الإيقاع-ح المطابقة وقت طرح من مجموع الإشارات للحصول على القيم النهائية. بيانات معبراً عنها يعني ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: الكشف عن أكسيد فائق في 264.7 الخام الخلايا في 77 ك. (أ) الخام 264.7 خلايا حفز مع 10 ميكرون سلطة النقد الفلسطينية والجيش الثوري الشعبي تدور المسبار غروهارلم 0.25 مم (50 دقيقة عند 37 درجة مئوية) مع (أسود) أو بدون المعالجة (أحمر) مع 30 U/mL الأحمق. تم تحميل 100 ميليلتر من المادة طافية في 1 بوصة في قطعة طول الأنابيب PTFE، ثم فلاش تجميدها في نيتروجين سائل. أزيلت السدادات، والمجمدة PTFE أنابيب وضعت في الإصبع ديوار للحصول على البيانات في 77 "ك." (ب) صور من PTFE أنابيب والسدادات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: قياسات الجيش الشعبي الثوري في الدم وبالف من التحكم والفئران المعالجة بليوميسين. كانت تعالج الفئران بجرعة واحدة لإعطاء بليوميسين (بلو تكنولوجيا المعلومات) (100 ميليلتر في 1 يو/مليلتر) أو المركبات PBS. في 7 أيام، تم تخديره من الفئران و euthanized. وكان الدم التي تم جمعها عن طريق ثقب البطين الأيمن في محقن المغلفة مع 1000 الهيبارين USP/ملليلتر تحتوي على 100 ميكرومتر دتبا. للفيسيولوجيا الغسل السائل (بالف) وقد جمعتها لافاجينج الرئتين مع 1 مل من 100 ميكرومتر دتبا في برنامج تلفزيوني. الدم وبالف كانت المحتضنة ل 10 أو 50 دقيقة، على التوالي، مع 0.2 مم غروهارلم عند 37 درجة مئوية. تم تحميل 150 ميليلتر من الدم أو بالف في PTFE أنابيب فلاش المجمدة في النتروجين السائل، والجيش الشعبي الثوري البيانات التي تم جمعها في 77 ك استخدام إصبع ديوار. إظهار بيانات تركيزات نيتروكسيدي في الدم (A) و (ب) بالف من برنامج تلفزيوني وبليو يعامل الفئران (n = 4-6). بيانات أعرب يعني ± sem. (ج) الممثل أطياف نيتروكسيدي في الدم من برنامج تلفزيوني وبلو يعامل الفئران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: قياسات الجيش الشعبي الثوري في أنسجة الرئة المجمدة فلاش. الفئران تعامل مع جرعة واحدة لإعطاء بليوميسين (بليو تكنولوجيا المعلومات) (100 ميليلتر في 1 يو/مليلتر) أو المركبات PBS. في 7 أيام، تم مسح الرئتين مع برنامج تلفزيوني الباردة لإزالة الدم وفلاش تجميدها في نيتروجين سائل. 5-15 ملغ أنسجة الرئة المجمدة فلاش المحتضنة مع 0.2 مم غروهارلم في KHB التي تحتوي على 100 ميكرومتر في 200 ميليلتر من الحجم الإجمالي ح 1 في 37 درجة المادة طافية جيم تم جمعها ووضعها في PTFE أنابيب وتشغيلها في ك 77 في الإصبع ديوار. (أ) نيتروكسيدي تركيز (ميكرومتر نيتروكسيدي تطبيع 1 ملغ من الأنسجة). وتمثل البيانات متوسط القياسات 2-3 لكل الرئة. البيانات معبراً عنها يعني ± "sem." (ب) الأطياف ممثلة من نيتروكسيدي في أنسجة الرئة من برنامج تلفزيوني وبلو يعامل الفئران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: قياسات الجيش الشعبي الثوري في أنسجة الرئة الحفاظ عليها في المخزن المؤقت السكروز. وعولج الفئران بجرعة واحدة لإعطاء بليوميسين (100 ميليلتر في 1 يو/مليلتر). في 7 أيام بعد العلاج، تم مسح الرئتين مع برنامج تلفزيوني الباردة لإزالة الدم، وكان تجانس أنسجة الرئة الطازجة في تريس يدتا المخزن المؤقت الذي يحتوي على السكروز 0.25 مم إلى نسبة 1:6 الرئة وزن/المخزن مؤقت حجم (ملغم/ميليلتر). 50 ميليلتر من الرئة هوموجيناتي وكان برينكوباتيد مع KHB مع أو بدون موانع التالية لمدة 20 دقيقة في 37 ° "c: أبله" (100 U/mL)، ديفيروكسامين (DFO؛ 800 ميكرون)، وكلوريد ديفينيليودونيوم (DIP؛ 100 ميكرومتر) تليها الحضانة مع 0.2 مم غروهارلم في KHB التي تحتوي على 100 ميكرومتر دتبا لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم الحصول على البيانات في الرايت استخدام الأنابيب الشعرية الجيش الشعبي الثوري. (أ) نيتروكسيدي التركز في الرئتين من برنامج تلفزيوني وبلو يعامل الفئران. (ب) نيتروكسيدي التركز في الرئتين بلو في الغياب أو وجود مثبطات (n = 3). بيانات معبراً عنها يعني ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: قياسات الجيش الشعبي الثوري في أنسجة الرئة من الفئران حقن بمسبار تدور CPH. وكان 100 ميليلتر من CPH التي تدار عن طريق ريتروربيتال حقن لتركيز نهائي من 20 ملغ CPH كل كغم من وزن الجسم. بعد 1 ساعة تداول، كانت euthanized الفئران، تم مسح الرئتين مع 10 مل من البرد برنامج تلفزيوني عن طريق البطين الأيمن، وكان فلاش أنسجة الرئة المجمدة. وضعت 20 إلى 30 ملغ أنسجة الرئة في خلايا الأنسجة وإجراء القياسات الجيش الشعبي الثوري في الرايت (أ) بيانات معبراً عنها يدور/ملغ الأطياف (ب) ممثل من نيتروكسيدي إشارة في برنامج تلفزيوني وبليو أنسجة الرئة (* يشير إلى التداخل مع حمض الأسكوربيك الراديكالي). بيانات معبراً عنها يعني ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

مثبطات الأنواع
فائق أكسيد الفاءق (الأحمق) فائق أكسيد خارج الخلية
فائق أكسيد الفاءق – البولي إيثيلين غليكول (شماعة-الهيئة العامة للسدود) فائق أكسيد داخل الخلايا
الكاتلاز فوق أكسيد الهيدروجين على أساس الجذور
راتي بيروكسينيتراتي
إيثانول و [دمس] هيدروكسيل متطرفة
تشيلاتورس معدنية أيونات المعادن (الحديد والنحاس)

الجدول 1. مثبطات الشائعة المستخدمة للتمييز بين الأنواع المسؤولة عن الأكسدة مسبار تدور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تقييم الإنتاج الحرة الراديكالية في إعدادات البيولوجية مهم في فهم الأكسدة ينظم الإشارات في الصحة والمرض، ولكن هذه الأنواع صعبة نظراً لأن نصف العمر القصير للأنواع الحرة الراديكالية والتقنية العالية قيود مع الأساليب استخداماً. الجيش الثوري الشعبي أداة قيمة وقوية في مجال البيولوجيا الأكسدة والاختزال، كما هو الأسلوب فقط لا لبس فيها للكشف عن الجذور الحرة. في هذا المشروع، ونظهر أساليب الجيش الشعبي الثوري العملي لتصميم التجارب وإعداد العينات للكشف عن روس استخدام تدور تحقيقات في مقصورات خلوية مختلفة في المختبر والمقصورات أنسجة مختلفة المجراة في. كما أننا نقدم أساليب عملية التعامل مع العينات البيولوجية وتخزين عينات لتحسين الكفاءة.

تحقيقات تدور الرد بكفاءة مع روس وإنتاج مستقر نيتروكسيدي جذرية يمكن الكشف عنها مع الجيش الشعبي الثوري. وقد تم توليف مشتقات عدة من التحقيق زيادة ونقصان (دوري هيدروكسيلاميني) مع خصائص النفاذية المختلفة، مما يجعلها مناسبة للكشف عن إنتاج الجذور الحرة في مقصورات خلوية مختلفة10. هذا البروتوكول يستخدم التحقيق تدور نفاذية الخلية غروهارلم؛ رغم ذلك، يمكن استخدام كلوريد 1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium مسبار تدور كتيمة HCl (CAT1H) للكشف عن فائق أكسيد خارج الخلية. مشابهة لدراستنا السابقة في ليمفوبلاست البشرية الخلية خطوط18، تمكنا من التحقق من صحة استخدام المسبار تدور غروهارلم نفاذية مع الهيئة العامة للسدود كتيمة وخلية نفاذية شماعة-الهيئة العامة للسدود في الخلايا RAW264.7 (ماوس الرئة بلعم خلية خط) حفز مع سلطة النقد الفلسطينية إلى التفريق بين أكسيد فائق خارج الخلية وداخل الخلية.

ونحن أيضا التحقق من صحة الموازنة السريعة غروهارلم بين الأقسام داخل وخارج الخلايا، ووجدنا أيضا أن الإشارات أكسيد فائق في الخلايا قطرات كبيرة بعد غسل الخلايا مرة واحدة فقط مع KHB (البيانات لا تظهر). نحن أكدت جدوى تدور محددة المتقدرية مسبار ميتو-الإيقاع-H في الخلايا 264.7 الخام لقياس دسموتاز المتقدرية زيادة المتولدة عند التحفيز مع المتقدرية الإلكترون النقل سلسلة مثبط أنتيميسين أ وقد ثبت سابقا المساهمة المحددة لإنتاج أكسيد فائق المتقدرية لميتو-الإيقاع-ح ويمكن التحقق من صحتها في تجارب باستخدام الميتوكوندريا جديدة معزولة أو نظم مع الفاءق دسموتاز الميتوكوندريا منسود (SOD2) أوفيريكسبريسيون10.

تقييم روس الإنتاج في فيفو يشكل تحديا كبيرا، ولكن القدرة على الكشف عن إنتاج روس محدد يوفر معلومات هامة عند استجواب دور الأكسدة والاختزال أو الأكسدة وينظم الإشارات في البيولوجية إعدادات. المعالجة المناسبة للأنسجة عند استخدام تدور تحقيقات والجيش الثوري الشعبي ضروري لتوليد النتائج استنساخه وذات مغزى. استخدام المسابير تدور مع الأنسجة لن يقدم الجذور دسموتاز التدبير المحتمل في وقت الحصاد الأنسجة بسبب نصف عمر قصيرة، ولكن بدلاً من ذلك فإنه يكشف تنتجها الإنزيمات مثل نابده أوكسيديز، أونكوبليد بطانية أكسيد النيتريك synthase أكسيد فائق ، أو أوكسيديز زانتيني عندما يتم المحتضنة أنسجة الرئة أو هوموجيناتيس مع التحقيق تدور في 37 درجة مئوية. لن تتضمن استخدام الأنسجة المجمدة فائق أكسيد المتولدة عن الميتوكوندريا، منذ تجميد تعويضات المتقدرية الإلكترون النقل سلسلة النشاط. لاختبار فائق أكسيد المتقدرية، حاجة المحققين إلى عزل الميتوكوندريا جديدة أو استخدام المسابير محددة المتقدرية في فيفو أو في أنسجة جديدة.

وصدرت عدة بروتوكولات مختلفة للحفاظ على النسيج في14،الأدب15. قارنا ثلاثة أساليب المنشورة للقياسات الجيش الشعبي الثوري في أنسجة الرئة: 1) فلاش تجميد الأنسجة في النتروجين السائل و 2) المجانسة الأنسجة في المخزن المؤقت السكروز 3) علاج الفئران في فيفو مع تدور التحقيق 1 ساعة قبل الحصاد الأنسجة. أننا بالمقارنة مع الفئران السيطرة على الفئران مع التهاب الرئة الحاد والأكسدة الناجمة عن بليوميسين لاختبار قدرة كل طريقة لإظهار الاختلافات متسقة في إشارات نيتروكسيدي في الرئتين المصابين. وأظهر كل ثلاثة أساليب زيادة نسبية مماثلة في إشارة نيتروكسيدي في رئات الفئران المعالجة بليوميسين. استخدام الأنسجة المجمدة فلاش يرجح أن النهج أسهل لجمع الأنسجة لمعظم مختبرات، ويلغي الحاجة إلى تجهيز الأنسجة في المخزن المؤقت السكروز في وقت الحصاد. حقن CPH التقاط الجذور الحرة في فيفو قوية، ولكن للتأكد من أن الأنواع المحددة، وهذا يتطلب مجموعة علاج بما في ذلك مضادات الأكسدة المناسبة.

أحد التحديات لاستخدام المسابير تدور أن أكسدة المسابير تدور على نيتروكسيدي ينشئ طائفة المنتجين ثلاثة أسطر مماثلة بغض النظر عن الأنواع المسؤولة عن الأكسدة؛ وهكذا، فإنه لا يميز بين الأنواع المختلفة من روس. كما أفيد أن هناك ردود فعل محتملة من المسابر هيدروكسيلاميني مع التمثيل الضوئي الإلكترون النقل سلسلة والفسفره التأكسدية19،20. وينبغي أن تعتبر هذه الملاحظات عند تفسير النتائج. في هذا البروتوكول، غير موجود النظام الضوئي، وإدراج دتبا مع المخزن المؤقت الذي يمنع التلوث المحتملة من أيونات الحديديك و cuprous مجاناً10 . ونحن تبين كيفية استخدام مجموعة من إنزيمات معينة أو تشيلاتورس في أنسجة الرئة لتأسيس مساهمة خاصة روس أو مثبطات الإنزيم تحديد مصدر روس. هذا النهج قد استخدمت سابقا من الجيش الثوري الشعبي لتحديد مساهمة روس سبب انوش أونكوبليد13،15. نحن نقدم قائمة بمثبطات الشائعة المستخدمة للتمييز بين الأنواع المسؤولة عن الأكسدة مسبار تدور (الجدول 1).

كما دللنا على أهمية الاستفادة المثلى من فترة الحضانة لكل حالة تجريبية. عند مقارنة تدور تحقيقات تدور الفخاخ، تدور الفخاخ تولد أطياف فريدة من نوعها تبعاً لمادة التفاعل الذي يسمح لخصوصية الأنواع الراديكالية الحرة؛ ومع ذلك، يحمل حركية بطيئة لتدور فائق أكسيد محاصرة أيضا وعرضه للتحلل الأحيائي. علاج أنسجة الرئة مع الجيش الشعبي الثوري مسبار السابقين فيفو محدودة أيضا بعدم قدرة على تميز على نحو كاف خارج الخلية من أكسيد فائق داخل الخلايا بسبب تعطل أغشية الخلية أثناء تجهيز الأنسجة (تجميد أو المجانسة). استخدام حقن تدور المسبار في فيفو بالاشتراك مع الهيئة العامة للسدود أو نفاذية الخلية شماعة-الهيئة العامة للسدود يمكن أن يعالج هذه المشكلة.

وكان هدف واحد وضع بروتوكول لجمع العينات وتخزينها في-80 درجة مئوية قبل القياسات الجيش الشعبي الثوري بكفاءة. ولذلك قمنا بتطوير أسلوب عملي لاستخدام أنابيب PTFE للاحتفاظ العينات. يتم وضع هذه الأنابيب مباشرة إلى الإصبع ديوار لتحليل الجيش الشعبي الثوري في ك 77 دون الحاجة إلى تنظيف ديوار بين العينات. وهذا بديل لطريقة نشر مؤخرا التي تشمل تجميد عينات في المحاقن 1 مل. القياسات في العينات المجمدة مخزنة في PTFE أنابيب يمكن أن تتكرر على مدى عدة أيام لإثبات استقرار الإشارة. هذا النهج يسمح بتجميع القياسات الجيش الشعبي الثوري، ويسهل نقل العينات بين المختبرات حيث يمكن تشغيل منشأة للجيش الثوري الشعبي بعيد عينات.

إجمالاً، توفر هذه البروتوكولات نهجاً واضحة لإعداد الخلايا والأنسجة للقياسات الجيش الشعبي الثوري في النظم البيولوجية. البروتوكولات يمكن تكييفها للنماذج الأخرى المرتبطة بالاكسدة، ومع استخدام المسابير تدور الأخرى. توقيت وتركيز التحقيق تدور ستحتاج إلى ضبط لكل حالة تجريبية. ويوفر قدرة المنتجين على تحديد وجود وإنتاج الأنواع الحرة الراديكالية لا لبس فيه الصرامة للنهج التجريبي في مجال البيولوجيا الأكسدة والاختزال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل جامعة كولورادو مدرسة الطب عميد جائزة "الهياكل الأساسية للبحوث الاستراتيجية"، R01 HL086680-09 و 1R35HL139726-01، على جائزة الزمالة E.N.G. وكفريت كلية جامعة دبلن (أنه). يشكر المؤلفون الدكتورة ساندرا إيتون والدكتور جيرالد روزين الدكتور غاريث إيتون (جامعة دنفر)، والدكتور جوزيف ب. كاو (جامعة ميريلاند)، والدكتور المفارق إهداء (جامعة كولورادو دنفر) لإجراء مناقشات مفيدة وجوان مالتزاهن، أشلي ترومبي واللبلاب ماكدرموت (جامعة كولورادو دنفر) لتقديم الدعم التقني.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM LifeTech 10566-016 cell culture media
Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) Sigma Aldrich D6518-5G
sodium chloride (NaCl)  Fisher Scientific   BP358-212 used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) Fisher Scientific   BP363-500 used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) Sigma Aldrich P-5379 used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
Krebs-Henseleit buffer (KHB)  (Alfa Aesar, Hill) J67820
Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) Sigma Aldrich  S7571-30KU
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Sigma Aldrich P1585-1MG Dissolve in DMSO
Antimycin A (AA) Sigma Aldrich A8674-25MG Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)
1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) Enzo Life Sciences ALX-430-117-M050
1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) Enzo Life Sciences ALX-430-078-M250
1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) Enzo Life Sciences ALX-430-171-M005
1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) Enzo Life Sciences ALX-430-131-M250
Heparin  Sagent Pharmaceuticals NDC 25021-400-10
Diphenyliodonium chloride  Sigma Aldrich 43088
Deferoxamin mesylate salt Sigma Aldrich D9533-1G
Critoseal Leica 39215003
BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark Sigma Aldrich 708733 Capillaries
PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING
3/16” OD x 1/8” ID
NORELL 1598774A Teflon tubing 
SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES  FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR NORELL 94987
EMXnano Bench-Top EPR spectrometer  Bruker BioSpin GmbH E7004002
EMX NANO TISSUE CELL Bruker BioSpin GmbH E7004542

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52, (1), 1-6 (2012).
  2. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67, (6), 1827-1836 (2012).
  3. Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53, (4), 280-284 (2015).
  4. Elajaili, H., et al. Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status. Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).
  5. Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (26), 13047-13051 (1994).
  6. Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
  7. Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. Biochemistry. 54, (47), 6973-6982 (2015).
  8. Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49, (9), 1122-1128 (2015).
  9. Dikalov, S. I., et al. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production. Free Radical Biology and Medicine. 45, (9), 1340-1351 (2008).
  10. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45, (4), 417-430 (2011).
  11. Dikalova, A. E., et al. Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension. Circulation Research. 107, (1), 106-116 (2010).
  12. Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes. Antioxidants & Redox Signaling. (2017).
  13. Sharma, S., et al. L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow. Pediatric Research. 74, (1), 39-47 (2013).
  14. Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies. PloS One. 9, (3), (2014).
  15. Kozlov, A. V., et al. EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species. Free Radical Biology and Medicine. 34, (12), 1555-1562 (2003).
  16. Van Rheen, Z., et al. Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44, (4), 500-508 (2011).
  17. Mouradian, G. C., et al. Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56, (3), 362-371 (2017).
  18. Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay. Biochem Pharmacol. 73, (7), 972-980 (2007).
  19. Kozuleva, M., et al. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).
  20. Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970, (3), 270-277 (1988).
استخدام الإلكترون الرنين باراماجنيتيك في العينات البيولوجية في درجة الحرارة المحيطة و 77 ك
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Elajaili, H. B., Hernandez-Lagunas, L., Ranguelova, K., Dikalov, S., Nozik-Grayck, E. Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K. J. Vis. Exp. (143), e58461, doi:10.3791/58461 (2019).More

Elajaili, H. B., Hernandez-Lagunas, L., Ranguelova, K., Dikalov, S., Nozik-Grayck, E. Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K. J. Vis. Exp. (143), e58461, doi:10.3791/58461 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter