Summary
ここで齧歯動物の痛み行動の試金に続いて頭蓋の薬理学的実験を行うためのプロトコルを提案する.このプロトコルでは、痛みの治療の薬理学的薬剤の脳内の分子および細胞のターゲットを提供する研究者をことができます。
Abstract
痛みは、情意と認知の次元の顕著な感覚的な体験です。しかし、痛みの中枢機構は効果的な治療薬の開発を妨げ、よく理解されて残る。頭蓋の薬理学、脳での痛みの分子・細胞メカニズムを理解するためだけでなく、新しい治療法のための重要なツールが表示されます。痛みの動作テストと頭蓋内の薬理学を統合したプロトコルをご紹介します。具体的には、痛みの変調の可能性があります選択の頭脳の地域に鎮痛薬を注入する方法を示します。さらに、中枢神経系の候補薬の効果を決定する、ため痛みの試金、頭蓋治療後実行されます。頭蓋内対象地域での鎮痛薬投与が齧歯動物で痛みの軽減を提供できることを示した。したがって、我々 のプロトコルは正常に、痛み行動のテスト併用頭蓋の薬理学が脳での痛みのメカニズムの調査のための強力なツールをすることができますを示しています。
Introduction
中枢神経系は、痛みの調節に重要な役割を再生する知られています。たとえば、グルタミン酸が脳内の情報伝達では、痛み1,2のコンテキストが規制の役割。したがって、痛みに関して脳の細胞・分子のシグナル伝達経路を研究する必要があります。さらに、痛みを治療する特定の脳領域で分子標的を変更できるかどうかを理解する必要があります。脳における痛みの現在の研究は、生体外で研究の組み合わせで生理学と薬理学的エージェントの全身 (腹腔内) 配信依存しています。生体外で研究生体内で痛みのメカニズムを明らかに明らかな赤字があります。一方、全身性ドラッグデリバリー正確な細胞内標的の線引きはないです。生体内で化学および生物学的エージェントの頭蓋内注射脳の神経学的および分子経路を研究するための強力なツールとなっています。近年では、他のフィールドは正常に動作中毒と報酬と齧歯動物3,4回路経路を研究するため生体内で頭蓋内注射を使用しています。ただし、痛みの中では、頭蓋内の薬理学生体内での使用は欠けています。
頭蓋内注射薬の脳の特定の領域に精密成形を可能にします。さらに、特定の経路と受容体ターゲットにできます選択性の高い薬剤を使用します。精度薬と頭蓋内の配信システムの組み合わせにより、痛みの分子および細胞のターゲットをターゲットとします。これらの薬の頭蓋内配信後研究者は齧歯動物の行動の即時効果を確認できます。まあ実験から齧歯動物の行動薬理学とリンクできます。
このプロトコルでは、AMPAkine 注入の例の使用前頭前皮質 (PFC) の皮質のグルタミン酸痛み調節におけるシグナリング機構をデモンストレーションします。AMPAkines は、アロステリック変調器を知られている合成化合物です。彼らは急性を和らげる能力を示しているし、動物における慢性疼痛モデル5,6。以前の研究では、AMPAkines のアクションの可能性が高い部位は、脳の5,6をお勧めします。PFC は、トップダウンの気分と行動を調節する脳領域にコントロールを示す脳の領域です。これらの出力予測のいくつかは、痛み規制1,2,7のキーに示されています。具体的には、痛みを規制するグルタミン酸、PFC のシグナリングを示されています。したがって、PFC は、痛みの状態で AMPAkines の研究の対象となる脳領域として選ばれました。
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Protocol
この研究のすべてのプロシージャは、ケアと実験動物の使用のため、国立衛生研究所 (NIH) ガイドとの整合性などニューヨーク大学大学院の医学機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されました。
1. 脳定位固定装置カニューレ留置
- 10-12 週齢雄 Sprague-dawley ラットを使用します。
- 前述のよう、1.5-2% イソフルラン1,3、5からの動物を麻酔します。動物は鋭い鉗子で強力なピンチに応答しなくなります、一度手術を行います。すべての楽器のオートクレーブに必ず滅菌手術用手袋を使用し、損傷を防ぐため、動物の目に眼軟膏を追加します。
- てんかん座標 AP 12.5 度の角度で PFC に二国間の 26 ゲージ ガイド カニューレをインプラント: +2.9 mm;ML: +/−1.6 mmDV: −2.1 の mm。カニューレを挿入するために使用するカニューレのサイズに従って穴径と、目的の座標で頭蓋骨に穴をあけます。
注: ここでは、PFC を調べた脳インプラントのための潜在的なターゲットとして研究1,2,7つ前までの数で示されている痛みの処理で重要な役割のため。その他の特定の脳の領域の機能を研究するには、研究者は脳アトラスによると異なる座標を使用できます。頭蓋内手術の実行の詳細については Gofferら(2013)3李ら (2015 年)1、および太陽ら(2017)10を参照してください。 - 少なくとも 1 週間の手術から回復するラットを許可します。術後では、代謝の要件をサポートするためにリカバリの前に皮下流体を注入し、たて閉鎖切開で局所ブピバカインを適用します。彼らは、目を覚ます、健康と適切な回復を確保するため 3 日間の動物のポスト操作の監視まで暖かいパッドに動物を配置します。
- 動物は、手術から完全に回復して、注射を開始 (次の手順)。
2. 頭蓋内・腹腔内注射
- 頭蓋内注射用 50 PE 管接続ハミルトン シリンジ注入ガイドを超えて 1.0 mm 33 ゲージ インジェクター カニューレ 10 μ L に一方の端に。
- 0.5 μ L を注入 (または必要な場合はより少ない) 研究薬剤またはこれらのラットの PFC で生理食塩水の。PFC がラットのより大きい地域のため、この金額は他の地域に広めることはできません。ただし、脳領域が小さい方やマウスの場合より小さいボリュームを使用します。注入量は脳と動物の種の地域によって異なります。
注意: DMSO は神経毒性ため、生理食塩水、DMSO ではなくコントロールとして使用する必要があります。8,9を DMSO (すなわち、この例のように、0.3 μ L の総ボリューム未満) 可能性があります動作を妨げない 50% 未満に研究研究が示したように、DMSO の非常に小さい量は注入のために安全かもしれません。 - このソリューションの遅い拡散を許可するように削除する追加 60 s 前の場所で 100 s しインジェクター カニューレの期間にわたって二国間ボリュームを挿入します。
- 相乗的な薬理効果の研究は、全身の方法で別の薬を共同管理します。この場合、頭蓋内目的薬物やコントロールを挿入して腹腔内すぐにその後、新たな薬物を管理します。本研究では、例としてモルヒネおよび添加剤の効果をテストする Ampakines の相乗的鎮痛効果を検討しました。我々 は頭蓋内、1 mg/kg (安全な全身線量) モルヒネ10腹腔内配信との組み合わせで、AMPAkine を注入します。
注: 彼らは腹腔内注射よりも難しく、まず、頭蓋内注射が行われることをお勧めします。
3. 鎮痛法と評価
- ラットにおける急性疼痛行動に対する頭蓋内注射の効果を研究、熱刺激に対する応答の撤退待機時間を計算する (ハーグリーブスのテスト) の足底のテストを使用します。ラットの足にガラス面を通して赤外線ビームがハーグリーブスの装置に焦点を当ててください。ラットは、立っている、ガラス面の上を自由に移動します。ハーグリーブスのテストを実行すると、ラットの足の足底の区域の下で赤外線ビームを集中します。
- ベースライン ハーグリーブスの注射、比較の基準値を確立する前にテストを実行して開始します。
- 基準値を設定する前に、任意の種類のすべての薬を挿入しません。5 分離れて 5 良い試験を実施します。良い治験は、すなわちラットの膝を曲げるし、上向き、体内にその足を持ち上げるとき、明確な撤退によって示されます。
注: 試験が 5 分離れてラットの増感を防ぐためにされていることを確認します。ハーグリーブスの装置は、赤外線ビームが壊れて一度撤退の時間を自動的に記録します。その結果、必ず歩行から試験を割引、割引のトライアルが発生して 5 分待って、裁判を繰り返す場合、重量などをシフトしてください。 - 5 試験の平均を取ることによって撤退のしきい値を計算します。
- ベースライン平均値を取得した後、薬の注入後撤退時間を得るための実験を開始します。ハーグリーブスのテストは、正確なタイミングは、特定のエージェントの薬物動態に依存が頭蓋内注射後実行される 20-30 分をすることができます。これはラットが薬物を吸収、その効果が発生していることを確認するためです。ステップ 3.1 と同じ方法でこの実験を行います。
- ステップ 3.2 で述べたように、撤退のしきい値を計算します。
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Representative Results
例として、我々 はカニューレ (図 1) 経由で PFC に、AMPAkine を注入しました。我々 はまた全身 AMPAkines とモルヒネ鎮痛相乗の効果を評価するためにモルヒネを注入しました。これらの結果は、AMPAkines とモルヒネ鎮痛効果があることを示します。また、頭蓋内注射が発見、少なくとも部分では、痛みのコンテキストで薬物の活性化のためのメカニズム力を持っていることを示します。
図 1。AMPAkines の頭蓋内注入とモルヒネの全身投与は相補的な鎮痛を提供します。モルヒネの全身投与と生食、AMPAkines、または AMPAkines の頭蓋内注射後ハーグリーヴスのテストから撤退の待ち時間を比較したグラフ。誤差範囲を表す SEM. n 平均 = 8;p < 0.0001 * *p = 0.0099、*p = 0.0124、対になっていない学生のt-テストします。この図は太陽らから適応されています。(2017)10、エルゼビアから権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本研究で我々 は頭蓋内薬理痛みのメカニズムを勉強する強力なツールです、治療配信システムとしての可能性を実証しました。我々 のプロトコルで、PFC に直接 AMPAkines を配信し、グルタミン酸シグナリング、PFC の AMPAkines は、痛みの軽減を提供を強化してわかった。頭蓋内注射後の痛みアッセイでの腹腔内注射の併用を使用してこれを実証することができました。鎮痛効果の証拠に基づいて、PFC に AMPAkines が配布されて、現在の研究は、PFC が AMPAkines のターゲットとして関与することが示唆しています。動作テストと組み合わせると、これは頭蓋内の薬理学的アプローチの重要な利点です。さらに、薬の全身納期頭蓋結合する能力は私たち 2 つの異なる薬と潜在的な薬理学的相互作用と治療の関係を理解することができます。本研究で示されている例では、モルヒネとの組み合わせで PFC に、AMPAkine を管理する AMPAkines とモルヒネが異なる分子メカニズムで動作することを示します予想される添加剤の効果を示しています。
薬理学生体内で痛みを勉強する強力なツールですが、制限があります。まず、経験の浅い手で注入された薬物は脳領域を隣接する拡散が可能です。これは、マウスに特定の問題です。これは光活性化薬の使用で克服できるし、光ファイバー、注射部位から異なる距離に薬物濃度測定で薬を注入することにより注入は解剖学的サイトを閉じます。第二に、頭蓋内の注射は短い持続することができますが、効果の期間は、薬物の体内動態のため知られていない完全。オプトジェネティクスなどの他の技術は、瞬時の活性化または不活性化脳の目的の地域のこの手法より直接的であり効果の知られている期間。その一方で、体内薬理学は特定の受容体やシグナル伝達経路をターゲットし、分子構造特異性の追加レベルを提供できます。したがって、将来的に必要がありますを探索する、生体内の生理学や研究などの追加テクニック体内薬理学を組み合わせること。これらのツールを組み合わせて、新しい経路と受容体の特定経路発見でき痛みを治療するために使用します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、国立医学研究所の一般的な (GM102691、GM115384)、国立神経疾患や脳卒中 (NS100065) (ベセスダ、MD、米国) によって支えられた麻酔研究基金のニューヨーク大学の部麻酔 (ニューヨーク、NY、米国)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterotaxic Cannula | PlasticsOne | 8I26GA8MMKIT | |
| Digital Syringe | Hamilton | 8440 | |
| AMPAkine | Sigma Aldrich | C-271 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D4540 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37370 | |
| Male Sprague-Dawley rats | Taconic Farms | NTac:SD | |
| Sterile Surgical gloves | Dynarex | 6535 |
References
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