Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um intrakranielle pharmakologische Experimente, gefolgt von Schmerzen Verhalten Assays bei Nagetieren durchführen. Dieses Protokoll erlaubt Forschern, molekularen und zellulären Ziele im Gehirn, für pharmakologische Wirkstoffe bei der Behandlung von Schmerzen zu liefern.
Abstract
Schmerz ist eine auffallende Sinneserfahrung mit affektiven und kognitiven Dimension. Allerdings bleiben zentrale Mechanismen für Schmerzen schlecht verstanden, die Entwicklung wirksamer Therapeutika behindern. Intrakranielle Pharmakologie stellt ein wichtiges Instrument für das Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen des Schmerzes im Gehirn, sowie für neuartige Therapien. Hier präsentieren wir eine Protokoll, die intrakranielle Pharmakologie mit Schmerzen Verhalten testen integriert werden kann. Insbesondere zeigen wir, wie mit Analgetika select Hirnregion, die für Schmerzen Modulation verantwortlich sein können. Darüber hinaus werden ermitteln, die Wirkung des Medikaments Kandidat in das zentrale Nervensystem, Schmerz-Assays intrakraniellen Nachbehandlung durchgeführt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass intrakranielle Verabreichung von Analgetika in einer gezielten Region Schmerzlinderung bei Nagern bieten kann. Unser Protokoll zeigt so erfolgreich, dass intrakranielle Pharmakologie, kombiniert mit Schmerzen Verhalten testen, ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Mechanismen der Schmerz im Gehirn sein kann.
Introduction
Das zentrale Nervensystem ist bekannt, spielen eine wichtige Rolle bei Schmerzen Regulation. Zum Beispiel hat Glutamat im Gehirn signalisieren eine regulierende Rolle im Zusammenhang mit Schmerzen1,2. Daher gibt es eine Notwendigkeit, zelluläre und molekulare Signalwege im Gehirn in Bezug auf Schmerzen zu untersuchen. Darüber hinaus gibt es ein Bedürfnis zu verstehen, wenn molekulare Targets in bestimmten Gehirnregionen geändert werden können, um Schmerzen zu behandeln. Aktuelle Studien des Schmerzes im Gehirn abhängig von in-vitro- Studien der Elektrophysiologie in Kombination mit systemischen (intraperitoneal) Lieferung von pharmakologischen Wirkstoffen. In-vitro- Studien haben offensichtliche Defizite bei der Enthüllung in Vivo Schmerzen Mechanismen. Unterdessen systemische Drug-Delivery nicht die genauen zellulären Zielen abzugrenzen. In Vivo intrakranielle Injektionen von chemischen und biologischen Arbeitsstoffen sind ein mächtiges Werkzeug, neurologische und molekulare Signalwege im Gehirn zu studieren geworden. In den letzten Jahren haben andere Felder in Vivo intrakraniellen Injektionen verwendet, sucht und Belohnung Verhaltensweisen und Schaltung Wege in Nagetieren3,4erfolgreich zu studieren. Im Rahmen des Schmerzes fehlt jedoch die Verwendung von in Vivo intrakraniellen Pharmakologie.
Intrakranielle Injektionen ermöglichen präzise Injektion eines Medikaments in einem bestimmten Bereich des Gehirns. Darüber hinaus können bestimmte Wege und Rezeptoren mit hochselektiver Drogen ausgerichtet werden. Die Kombination aus einer intrakraniellen Liefersystem medikamentös Präzision ermöglicht es uns auf molekularer und zellulärer Ziele für Schmerzen. Im Auslieferzustand intrakraniellen dieser Medikamente können die Forscher die unmittelbaren Auswirkungen des Verhaltens von Nagetieren beobachten. Aus gut durchgeführten Versuche können Nagetiere Verhaltensweisen mit Pharmakologie verknüpft werden.
In diesem Protokoll haben wir das Beispiel der Ampakin Infusion im präfrontalen Kortex (PFC) um den Mechanismus der kortikalen Glutamat Signalisierung in Schmerzen Verordnung zu demonstrieren. Ampakine sind synthetische Verbindungen, die allosterische Modulatoren bekannt sind. Sie haben gezeigt, dass die Fähigkeit zur Linderung akuter und chronischer Schmerzen in der Tier-Modelle5,6. Frühere Studien deuten darauf hin, dass die wahrscheinlich Standorte des Handelns der Ampakine im Gehirn5,6. Der PFC ist eine Region im Gehirn, das Top-down-Steuerung zu subkortikalen Bereichen, Stimmung und Verhalten zu regulieren aufweist. Einige dieser Ausgabe Projektionen nachweislich Schmerzen Verordnung1,2,7sein. Genauer gesagt, Glutamat Signalisierung in der PFC nachweislich Schmerzen zu regulieren. So wurde die PFC als eine gezielte Gehirnregion für die Untersuchung der Ampakine in Schmerz Staaten gewählt.
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Protocol
Alle Verfahren in dieser Studie wurden von der New York Universität Schule von Medizin institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) im Einklang mit dem National Institute of Health (NIH) Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt.
(1) stereotaktischen Kanüle Implantation
- Verwenden Sie 10-12 Wochen alten männliche Sprague-Dawley Ratten.
- Wie zuvor beschrieben Tiere mit 1,5-2 % Isofluran1,3,5zu betäuben. Sobald das Tier nicht mehr zu einer starken Prise mit scharfen Zange reagiert, führen Sie die Operation. Achten Sie darauf, Autoklav alle Instrumente, verwenden Sie sterile OP-Handschuhe, und das Tier Augen zur Vermeidung von Schäden fügen Sie ophthalmologischen Salbe hinzu.
- Stereotaxically Implantat bilaterale 26-Gauge Anleitung Kanülen in der PFC um 12,5 Grad mit Koordinaten AP: +2,9 mm; ML: + / −1.6 mm; DV: −2.1 mm. Um die Kanülen einzufügen, Bohren Sie Löcher in den Schädel an den gewünschten Koordinaten mit Lochdurchmesser entsprechend der Größe der Kanülen verwendet.
Hinweis: Hier wurde die PFC als potenzielles Ziel für intrakranielle Implantate wegen seiner wichtigen Rolle bei der Schmerzverarbeitung, untersucht, die in einer Reihe von früheren Studien1,2,7nachgewiesen wurde. Um die Funktion der anderen bestimmte Hirnareale zu untersuchen, können die Forscher verschiedene Koordinaten nach der Gehirn-Atlas. Finden Sie für mehr Details über intrakranielle Chirurgie Goffer Et al. (2013)3, Lee Et al. (2015)1und Sun Et Al (2017)10. - Können Sie Ratten, die für mindestens 1 Woche von der Operation erholen. Nach der Operation subkutane Flüssigkeiten vor Wiederherstellung zur Unterstützung der metabolischen Anforderungen zu injizieren, und topische Bupivacain in der frisch geschlossenen Schnitt anwenden. Legen Sie das Tier auf einer warmen Unterlage, bis sie aufwachen und den tierischen Post-Vorgang für 3 Tage überwachen, um gute Gesundheit und eine richtige Erholung zu gewährleisten.
- Sobald die Tiere vollständig von der Operation erholt haben, beginnen Injektionen (nächster Schritt).
(2) intrakraniellen und intraperitoneale Injektionen
- Für intrakranielle Injektionen verwenden PE-50 Schlauch befestigt an einem Ende zu 10 μl Hamilton Spritzen mit 33-Gauge Injektor-Kanüle, die 1,0 mm über die implantierten Guides zu erweitern.
- 0,5 μl zu injizieren (oder weniger, wenn gewünscht) die Studienmedikation oder Kochsalzlösung in die PFC dieser Ratten. Da die PFC einer größeren Region bei Ratten ist, wird dieser Betrag nicht in andere Regionen verteilt werden. Jedoch für kleinere Hirnregionen oder Mäuse, verwenden Sie ein kleineres Volumen. Die Menge injiziert hängt von der Region des Gehirns und Tierarten.
Hinweis: Bitte beachten Sie, dass die Kochsalzlösung als ein Steuerelement statt DMSO verwendet werden soll, weil DMSO neurotoxisch ist. Jedoch kann eine sehr kleine Menge von DMSO für Infusion, sicher sein, wie Studien gezeigt haben, dass weniger als 50 % DMSO (d. h. weniger als ein Gesamtvolumen von 0,3 μL, wie in diesem Fall) nicht Verhalten beeinträchtigen8,9Studien. - Bilateral, Volumen über einen Zeitraum von 100 s und halten Injektor Kanülen in Platz für eine zusätzliche 60 s vor der Entfernung ermöglichen langsame Diffusion dieser Lösung zu injizieren.
- Für Studien der pharmakologischen Synergieeffekte, gemeinsam verabreichen Sie ein anderes Medikament, durch systemische Methoden. In diesem Fall das gewünschte Medikament oder die Kontrolle intracranially zu injizieren und intraperitoneale unmittelbar danach eine zusätzliche Medikament verabreichen. Als Beispiel haben wir in dieser Studie die synergistischen analgetischen Wirkungen von Morphin und Ampakine für eine additive Wirkung zu testen untersucht. Wir infundiert ein Ampakin intracranially, in Kombination mit intraperitonealer Lieferung von 1 mg/kg Morphin (eine sichere systemische Dosis)10.
Hinweis: Es wird empfohlen, dass intrakranielle Injektionen zuerst fertig sind, sind schwieriger als intraperitoneale Injektionen durchzuführen.
(3) Analgesie Assays und Bewertung
- Um die Wirkung von intrakraniellen Injektionen auf akute Schmerzen Verhalten bei Ratten zu studieren, verwenden Sie plantaren Test (Hargreaves' Tests) um die Rücknahme Latenz in Reaktion auf thermische Reize zu berechnen. Die Hargreaves Apparat konzentriert sich einen Infrarot-Strahl durch eine Glasplatte auf die Ratte Fuß; die Ratte steht und frei beweglich über die Glasplatte. Konzentrieren Sie Hargreaves' Test durchführen, der Infrarot-Strahl unter dem plantaren Bereich der Ratte Fuß.
- Beginnen Sie durch Grundlinie Hargreaves Tests vor Injektionen, um einen Ausgangswert für den Vergleich zu etablieren.
- Nicht injizieren Sie jedes Medikament jeglicher Art vor der Gründung von einem Ausgangswert. Durchführen Sie 5 gute Studien, 5 min auseinander. Eine gute Studie wird angezeigt durch eine klare Austritt, d.h., wenn die Ratte seine Knie beugt und den Fuß nach oben und in den Körper hebt.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Versuche sind 5 min auseinander, um zu verhindern, dass die Sensibilisierung der Ratte. Die Hargreaves Apparat speichert automatisch die Zeit des Rückzugs, sobald der Infrarotstrahl unterbrochen wird. Infolgedessen, achten Sie darauf, Studien von Fortbewegung Rabatt, Gewichtsverlagerung, etc. tritt eine vergünstigte Testversion, warten Sie 5 Minuten und wiederholen Sie den Versuch. - Berechnen Sie Auszahlung Schwellen, indem man den Durchschnitt der 5 Versuche.
- Nach Erhalt eines Grundlinie Durchschnitts, beginnt das Experiment um Auszahlungszeiten nach der Infusion von Medikamenten zu erhalten. Hargreaves' Tests können durchgeführt 20-30 min nach intrakraniellen Injektionen werden, obwohl der genaue Zeitpunkt auf die Pharmakokinetik von bestimmten Agenten angewiesen sein kann. Dies soll sicherstellen, dass die Ratte das Medikament absorbiert hat und seine Wirkung erfährt. Führen Sie dieses Experiment in der gleichen Weise wie Schritt 3.1.
- Auszahlung Schwellen zu berechnen, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
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Representative Results
Als Beispiel haben wir ein Ampakin in PFC über Kanülen (Abbildung 1) infundiert. Wir infundiert auch Morphium systematisch um die analgetische Synergieeffekte zwischen Ampakine und Morphin zu beurteilen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Ampakine und Morphin additive analgetische Wirkung haben. Es zeigt auch, dass intrakranielle Injektionen die Kraft zu entdecken, mindestens im Teil, einen Mechanismus für die Droge Aktivierung im Rahmen des Schmerzes.
Abbildung 1: Intrakranielle Injektion von Ampakine und systemische Injektion von Morphin bieten ergänzende Analgesie. Ein Graph Rückzug Latenzen von Hargreaves' Test nach intrakraniellen Injektionen entweder Kochsalzlösung, Ampakine oder Ampakine mit systemische Injektion von Morphin zu vergleichen. Fehlerbalken darzustellen mit SEM n = 8; p < 0,0001, **p = 0.0099, *p = 0.0124, ungepaarten des Student t-test. Diese Zahl wurde angepasst von Sun Et al. (2017) 10, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In dieser Studie haben wir gezeigt, dass intrakranielle Pharmakologie ein mächtiges Werkzeug ist um Schmerzen Mechanismen zu studieren und Potenzial als eine therapeutische Delivery-System hat. In unserem Protokoll wir lieferten Ampakine direkt in die PFC und festgestellt, dass durch Verbesserung der Glutamat-Signalisierung in der PFC Ampakine Schmerzlinderung zur Verfügung gestellt. Wir waren in der Lage, dies durch den Einsatz von intrakraniellen Injektionen kombiniert mit intraperitoneale Injektionen mit nachfolgenden Schmerzen Assays zu demonstrieren. Basierend auf den Nachweis der schmerzlindernde Wirkung bei Ampakine an der PFC, die aktuelle Studie legt nahe, dass die PFC als Ziel der Ampakine beteiligt sein kann. Dies ist ein wichtiger Vorteil der intrakraniellen pharmakologischen Ansatz, in Kombination mit Verhalten zu testen. Darüber hinaus die Möglichkeit, intrakranielle mit systemischen Lieferung von Medikamenten kombinieren ermöglicht es uns, die therapeutische Beziehung zwischen zwei verschiedene Medikamente und die möglichen pharmakologischen Interaktionen zu verstehen. Im Beispiel zeigt diese Studie zeigt die Verabreichung ein Ampakin in der PFC in Kombination mit Morphin eine erwartete additive Wirkung, was bedeutet, dass Ampakine und Morphin durch verschiedene molekulare Mechanismen zu betreiben.
Obwohl in Vivo Pharmakologie ein mächtiges Werkzeug ist, um Schmerzen zu studieren, hat es Einschränkungen werden. Erstens ist es möglich, dass in unerfahrenen Händen, das infundierte Medikament ins benachbarte Gehirnregionen diffundieren kann. Dies ist ein besonderes Problem mit Mäusen. Dies könnte mit dem Einsatz von Licht-aktivierte Drogen überwunden werden und Implantation von optischen Fasern, durch Messung der Droge Ebenen mit unterschiedlichen Entfernungen von der Injektionsstelle oder durch Injektion das Medikament bei schließen anatomische Websites. Zweite, intrakranielle Injektionen können kurzer Dauer, aber der Zeitraum der Wirkung ist nicht vollständig bekannt, aufgrund der Pharmakokinetik des Medikaments. Andere Techniken wie Optogenetik, ermöglichen sofortige Aktivierung oder Inaktivierung einer gewünschten Region des Gehirns; Diese Technik ist direkter und hat eine bekannte Periode des Effekts. Auf der anderen Seite kann in Vivo Pharmakologie gezielt bestimmte Rezeptoren oder Signalwege und bieten somit eine zusätzliche Ebene der molekularen Spezifität. In der Zukunft es wird also notwendig zu erkunden in Vivo Pharmakologie mit zusätzlichen Techniken, wie in Vivo Physiologie und Optogenetik kombinieren. Mit der Kombination dieser Tools neue Wege und spezifischen Rezeptor Signalwege können entdeckt und verwendet, um Schmerzen zu behandeln.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Institute of General Medical Sciences (GM102691, GM115384), National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall (NS100065), (Bethesda, MD, USA) unterstützt und die Anästhesie Fonds der New York University Forschungsabteilung Anästhesie (New York, NY, USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterotaxic Cannula | PlasticsOne | 8I26GA8MMKIT | |
| Digital Syringe | Hamilton | 8440 | |
| AMPAkine | Sigma Aldrich | C-271 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D4540 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37370 | |
| Male Sprague-Dawley rats | Taconic Farms | NTac:SD | |
| Sterile Surgical gloves | Dynarex | 6535 |
References
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