Summary
Aquí, presentamos un protocolo de disociación celular para aislar eficazmente las células presentes en baja abundancia dentro del sistema visual de Drosophila mediante célula de fluorescencia activada (FACS) de clasificación.
Abstract
Recientes mejoras en la sensibilidad de la secuencia de la generación siguiente han facilitado la aplicación de análisis genómicos y transcriptómicos a una pequeña cantidad de células. Utilizando esta tecnología para estudiar el desarrollo en el sistema visual de Drosophila, que cuenta con una amplia variedad de herramientas genéticas de tipo específico de célula, ofrece un poderoso enfoque para abordar la base molecular del desarrollo con resolución celular precisa. Para que este enfoque ser factible, es crucial tener la capacidad para confiablemente y eficientemente purificar células presentes en baja abundancia en el cerebro. Aquí, presentamos un método que permite la purificación eficiente de clones celulares solo en experimentos de genética mosaico. Con este protocolo, consistentemente lograr un alto rendimiento celular después de purificación usando fluorescencia activada (FACS) (~ 25% de todas las células etiquetadas) de clasificación de la célula y realizado con éxito análisis de transcriptómica en clones de células individuales generados a través de Análisis de mosaico con un marcador de célula repressible (MARCM). Este protocolo es ideal para aplicar análisis genómicos y transcriptómicos a tipos celulares específicos en el sistema visual, a través de diferentes etapas de desarrollo y en el contexto de diferentes manipulaciones genéticas.
Introduction
El sistema visual de Drosophila es un excelente modelo para estudiar la base genética del desarrollo y del comportamiento. Se compone de una arquitectura celular estereotipados1 y un kit de herramientas genética avanzada para la manipulación específica de la célula tipo2,3. Una fuerza importante de este sistema es la capacidad de interrogar autónomamente funciones de los genes en los tipos de células de interés con una resolución de única célula, utilizando mosaico genético métodos4,5. Se intentó combinar estas herramientas genéticas con los avances recientes en la siguiente secuencia de generación para realizar transcriptómicos de tipo-específicas de la célula y análisis genómicos en célula única clones en experimentos de genética mosaico.
Para lograr esto, es esencial para desarrollar un método robusto y eficiente para aislar selectivamente poblaciones baja celular abundante en el cerebro. Previamente, hemos desarrollado un protocolo para aislamiento de tipos celulares específicos en el sistema visual durante el desarrollo pupal por FACS y determinar su transcriptomas usando RNA-seq6. En estos experimentos, la mayoría de las células de un tipo particular (p. ej. fotorreceptores de R7) fluorescencia fueron etiquetada. Usando este método, en experimentos de genética mosaico, en donde sólo un subconjunto de células del mismo tipo están marcados, no pudimos aislar suficientes células para obtener datos de calidad de la secuencia. Para abordar esto, intentamos aumentar el rendimiento celular mejorando el protocolo de disociación celular.
Nuestro enfoque fue disminuir la longitud total del protocolo para maximizar la salud de las células disociadas, mejorar la salud celular alterando búferes de disección y disociación y reducir la cantidad de interrupción mecánica para el tejido disecado. Probamos el protocolo mejorado7 usando análisis de mosaico con una célula repressible marcador5 (MARCM), que permite la generación de solo fluorescencia etiquetada clones particulares tipos de células, tipo salvaje y mutante para un gen de interés en un de lo contrario heterozigótico mosca. Donde, en condiciones idénticas, nuestro protocolo anterior ha podido generar suficiente material para RNA-seq, el protocolo de mejora era acertado. Reproducible, lograr un alto rendimiento celular (~ 25% de células marcadas) y obtener datos de RNA-seq de alta calidad de tan sólo 1.000 células7.
Un número de protocolos se ha descrito previamente para aislar a tipos de concreto celular en Drosophila6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. estos protocolos sirven sobre todo para aislar las células que son abundantes en el cerebro. Nuestro protocolo está optimizado para aislar poblaciones de células abundantes bajas (menos de 100 células por cerebro) en el sistema visual utilizando FACS para análisis genómicos y transcriptómicos posterior. Con este protocolo, nuestro objetivo es proporcionar una manera de aislar reproducible bajo abundantes células del sistema visual mosca FACS y obteniendo datos de alta calidad transcriptoma por RNA-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. la planificación antes del experimento
-
Antes de comenzar el experimento, realizar un experimento piloto en pequeña escala para confirmar si la genética funciona como se espera para etiquetar específicamente las células deseadas.
- Como primer paso, uso de inmunohistoquímica y microscopía de luz para determinar si las células no deseadas están etiquetadas. Idealmente, los marcadores genéticos será específicos dentro de la retina y el lóbulo óptico (figura 3). Lóbulos de óptica sólo se utilizan para la disociación celular y así etiquetado en el cerebro central no es un problema. Al mismo tiempo, determinar cuántas células de interés están marcadas por el cerebro.
- Si las etiquetas genéticas tienen la especificidad deseada, realizar un experimento piloto de la FACS (figura 4) para determinar si una población pura de células puede ser reproducible aislado, y también evaluar cuántas células de interés puede ser aislado de cada cerebro. Si es necesario, evaluar la pureza de las células aisladas a través de PCR cuantitativa para determinar el enriquecimiento o enriquecimiento de genes específicos.
-
Determinar el número de cruces necesarios para obtener la cantidad deseada de material para el experimento.
Nota: Basado en la experiencia experimental, ~ 17 – 25% de células fluorescencia etiquetadas aíslan sistemáticamente con este protocolo, y se obtienen datos de la secuencia de RNA de alta calidad desde tan sólo 1.000 células FACS purificada (menos las células pueden ser suficientes).- Para obtener las 1.000 células para análisis de RNA-seq, asegúrese de que hay al menos 40 células de interés marcado fluorescente por cerebro (20 células por lóbulo óptico). Alrededor de ~ 10 células de interés deben ser purificadas por el cerebro, así que diseccionar 100 cerebros.
- Para obtener ~ 100 moscas en la etapa apropiada de desarrollo para disecar en cada experimento, use ~ 100 cruces si seleccionar contra balanceadores (esto variará dependiendo de los genotipos de los padres). Si las moscas son homocigóticas para los alelos/los transgenes de interés que pueden establecerse cruces menos.
- Límite de la ventana de disección 1 h para maximizar la salud celular y reducir al mínimo cambios no específicos de expresión génica y la organización de genoma que puede ocurrir después de cerebros se disecan, pero esto se puede ajustar. Determinar el número de disectores para diseccionar 100 cerebros en 1 h, que depende de la habilidad de los disectores.
2. trabajo de mosca
Nota: Las moscas son criadas a 25 ° C ~ 50% de humedad a menos que se indique lo contrario. A continuación el genotipo de las hembras está indicado como genotipo F y la de los machos como genotipo.
-
Expansión de las poblaciones
- Obtener ~ 30 frascos de genotipo M y ~ 100 frascos de moscas jóvenes (no más de una semana con genotipo F).
- El jueves de la semana 1, flip 100 frascos de genotipo F en alimentos frescos. A partir del viernes, tapa los frascos cada día a través del martes de la semana 2. Estos 6 tirones se utilizará para recoger a las vírgenes. También el miércoles de la semana 2, flip moscas de genotipo M en alimentos frescos y elimine los padres el viernes de la semana 2. Estos viales se utilizarán para recoger los machos para las cruces.
-
Vírgenes que recoge
- Del lunes de la semana 3, recopila a las vírgenes de los frascos del genotipo F. 2 - 3 veces al día de recoger y almacenar a las vírgenes a 18 ° C ~ 50% de humedad. Repetir este proceso cada día a través del martes de la semana 4. Se recomienda recoger tantas vírgenes como sea posible, ya que muchos de ellos mueren antes de las cruces. Por lo general, ~ 2.500 vírgenes deben ser recopiladas para establecer 100 cruces.
-
Establecer cruces
- El viernes de la semana 4, establecer el número deseado de cruces (típicamente 100-200 cruces por experimento) con 15 vírgenes del genotipo F y 7 machos de genotipo M para cada cruz. Es muy importante utilizar los machos jóvenes y sanos con alas intactas.
- Las cruces del tirón todos los días del domingo al sábado de la semana 5. Complementar las cruces con frescas vírgenes o los machos si se encuentran moscas muertas. Es esencial para evitar que los alimentos se sequen, así los frascos de agua según sea necesario. Alimento seco disminuirá significativamente el rendimiento.
-
Control negativo para la clasificación de FACS
- Incluir un control negativo sin las células deseadas ser rotuladas para la clasificación de FACS. Idealmente, el control negativo debe tener el reportero (por ejemplo, UAS-GFP) pero no el controlador (por ejemplo GAL4), para que la expresión basal de la reportera (UAS-construcciones pueden ser "agujereadas") puede ser determinado para establecer adecuada compuerta para la clasificación de FACS. Voltear las moscas para el control negativo al mismo tiempo con las moscas experimentales y etapa de la misma manera.
-
Pupas de la puesta en escena
- Para recoger las células en una etapa específica de desarrollo pupal (e.g. 40 h después de la formación del pupario [h APF]), etapa de las pupas en una ventana de tiempo de 1 h para que coincida con el período de 1 h asignan para disecciones (discutidas arriba). FACS debe realizarse inmediatamente después de la disociación celular, que ocurre después de las disecciones y tarda 40 minutos. Así, la hora exacta de la puesta en escena y disecciones es determinada por la disponibilidad de FACS.
- Para obtener crisálidas a 40 h APF, escenario el lunes de la semana 6 en un punto de tiempo específico (por ejemplo, 17:00) para disecar pupas 40 h más tarde (por ejemplo, 9:00 el miércoles). Utilizar un pincel mojado suavemente blanco pre pupas y colocarlos en la pared en frascos previamente calentados. Sólo recoger las pupas con el genotipo deseado.
-
Réplicas biológicas
- Hacer al menos 3 repeticiones biológicos para cada experimento. Como una forma simple, repite el experimento tres veces en la misma semana (semana 6) utilizando las mismas cruces. Por ejemplo, etapa de pupas para las segunda y terceros repeticiones el martes y el miércoles, respectivamente. Diseccionar estas pupas el jueves y el viernes, respectivamente.
3. preparación de la muestra
Nota: Todos los reactivos utilizados en el presente Protocolo se enumeran en la Tabla de materiales.
- Preparar soluciones para disecciones y disociación de tejidos
- Preparar la solución madre de mezcla de enzimas proteolíticas (véase Tabla de materiales) por reconstitución del liofilizado enzima con ddH2O a una concentración de 26 unidades Wünsch (Wu) / mL. Un frasco contiene 260 Wu (frasco grande), añadir 10 mL de ddH2O al frasco y hacer alícuotas de un solo uso (4.2 μl se requieren por disociación). Almacene la solución stock a-20 ° C. Cada experimento requiere la disociación de dos muestras (tejido experimental y control negativo).
- Preparar 10 x solución (RS de Rinaldini) y Media (CSM de Schneider completa) el día antes de la disección (lunes de la semana 6). Preparar 5 mL de CSM para cada disector y unos 5 mL de 1 x RS y 5 mL de CSM para la disociación de las 2 muestras (control negativo y experimental). Guarde el RS 10 x a 4 ° C hasta por un mes y CSM a 4 ° C por hasta una semana.
- Para preparar 100 mL de 10 x RS, disolver 8 g de NaCl, 200 mg de KCl, 50 mg de NaH2PO4, 1 g de NaHCO3 y 1 g de glucosa en 100 mL de ddH2O en un vaso de precipitados de 250 mL. Filtro de esterilización con un filtro de 0,22 mm.
- Añadir 20 mg de L-Glutatión a 1 mL de ddH2O en un microtubo.
- Para preparar 50 mL de CSM, añadir 5 mL de calor inactiva el suero bovino 0,1 mL de solución de insulina de 10 mg/mL, 5 mL de solución de L-glutamina de 200 mM, 12,5 μL de 20 mg/mL de L-Glutatión y 1 mL de solución de penicilina-estreptomicina (5.000 unidades de penicilina y 5 mg de estreptomicina / mL) a 38,9 mL de medio de Schneider. Filtro de esterilización con un filtro de 0,22 mm.
- Diluir 10 x RS con ddH2O para hacer 1 x solución de trabajo de RS. Preparar 500 μL de 1 x RS en microtubos no adhesiva para cada muestra.
- Gire en un baño de agua y ajustar la temperatura a 37 ° C. Asegúrese de que la temperatura es correcta mediante el uso de un termómetro. Debe ser el baño de agua a la temperatura adecuada antes de la activación de la papaína. Se recomienda ajustar la temperatura por la noche antes de una disección de la mañana.
- Preparar la papaína y la enzima proteolítica de mezcla
Nota: Hacer solución de papaína fresca antes de cada disociación.- El martes de la semana 6 alrededor de 45 minutos antes de comenzar la disección, recuperar 1 frasco de polvo de papaína de 4 ° C e incubar a temperatura ambiente. También dejar de lado CSM en un tubo de Eppendorf a temperatura ambiente para luego añadir el polvo de papaína.
- minutos antes del inicio de las disecciones utilice una jeringa para agregar la temperatura CSM a la cubeta de la papaína (directamente a través de la tapa) para que la concentración es de 100 unidades/mL (la cantidad de polvo en cada frasco es ligeramente diferente, de un frasco que contiene 123 unidades añadir 1.23 m L de CSM). Para mezclar, en primer lugar, invertir el frasco para capturar todo el polvo pegado en el interior de la tapa y luego pipetee hacia arriba y hacia abajo.
- Añadir el frasco a un vaso de precipitados que contenga agua de 37 ° C en el baño de agua. Asegúrese de que el frasco de solución de papaína no es flotante. Activar la papaína durante 30 min a 37 ° C.
- Después de agregar la papaína en un vaso en el baño de agua, recuperar una alícuota de la mezcla de enzimas proteolíticas (26 Wu/mL) de-20 ° C e incubar a temperatura ambiente. Después de 30 minutos de activación, incubar la papaína a temperatura ambiente.
- Disecciones
- El martes de la semana 6, diseccionar el cerebro etapas pupal en frío CSM con pinzas limpias y corte los lóbulos ópticos pellizcando en el cruce del lóbulo óptico y el cerebro central.
- Añadir los lóbulos a la parte baja de un microtubo que contiene 500 μL de 1 x RS (un microtubo para el tejido experimental) y otro para el tejido de control negativo. Siempre mantener los tubos en hielo.
- Diseccionar tantos lóbulos como sea posible en 1 h. Para el tejido de control negativo, 10 lóbulos son suficientes. Piscina disecado lóbulos ópticos en un microtubo solo para eliminar la pérdida de tejido durante la transferencia entre los microtubos.
- Disociación celular
- Cuidadosamente saque el RS 1 x el microtubo con lóbulos de óptica disecados con una pipeta de P200, dejando suficiente para cubrir los lóbulos. Cuidadosamente Añadir 500 μL de RS 1 x al lado del tubo, con el fin de perturbar el cerebro lo menos posible. Siempre mantenga el tubo en hielo.
- Deje que los lóbulos se asentarán en la parte inferior. Sólo una vez, tome 200 μL y pipetee hacia fuera para mezclar (lóbulos deben moverse). Que los lóbulos establecerse otra vez.
- Para dos muestras (control experimental y negativo), alícuota 600 μL de temperatura activa papaína en un microtubo. Añadir 4.2 μL de mezcla de enzimas proteolíticas de temperatura ambiente en solución de papaína de 600 μL para obtener una concentración final de 0.18 Wu/mL. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Esta es la solución de disociación.
- Cuidadosamente retire el RS 1 x de cada muestra y agregar 300 μL de solución de disociación a los lóbulos. Incubar las muestras a 25 ° C, 1.000 rpm por 15 min en un microtubo Termomezcladores.
- En los 5 y 10 min puntos del tiempo, parar la Termomezcladores y deje que los lóbulos se hunden hasta el fondo del microtubo. Tomar 200 μL de la solución y pipetee hacia fuera para mezclar.
- Después de 15 minutos, dejar que los lóbulos asiente en el fondo y retire con cuidado la solución de la disociación de los lóbulos (trata de no molestar a los lóbulos).
- Lavar dos veces con 1 x RS. Para ello, agregue cuidadosamente 500 μL 1 x RS (trata de no molestar a los lóbulos). Mezcla, suavemente la pipeta hacia arriba de 200 μL y pipeta entonces hacia fuera en el microtubo. Permita que los lóbulos se hunden hasta el fondo y repita.
- Lave cada muestra dos veces con 500 μL de CSM (igual que el paso anterior).
- Cuidadosamente saque el CSM y añadir otro 200 μL del CSM al tubo. Utilizando una pipeta de P200, alterar el tejido mediante pipeteo arriba y abajo sin hacer espuma, hasta que la solución sea homogénea (es decir, ya no pueden ver cualquier remanente de tejido).
- Filtrar la suspensión de células a través de una tapa de malla de 30 μm en un tubo de 5 mL FACS sobre hielo (uso un P200 y asegúrese de que la suspensión entera va a través). Añadir otro 500 μL de CSM para enjuagar el microtubo de disociación y filtrar la solución en el tubo de FACS.
- Cuidadosamente saque la tapa del tubo de FACS, recoger la solución debajo del filtro de malla con un P200 y añadir al resto de la suspensión en el tubo de FACS. Las muestras están listas para FACS.
- Asegúrese de tener microtubos para recoger células FACS purificada preparada de antemano. Para RNA-seq, ordenar las células de cada muestra directamente en microtubos conteniendo 300 μL de tampón RLT (tampón de lisis) desde el kit de purificación de RNA (Añadir 1: 100 2–mercaptoetanol antes de usar).
- Clasificación de FACS
Nota: Después de la disociación, inmediatamente ordenar las celdas por FACS (máximo 1 h). Asegúrese de que en las sesiones de FACS libro por consiguiente al planear el experimento. Normalmente se utiliza un clasificador de células con tamaño de boquilla de 100 μm.- Comparar la distribución de células en el control negativo y la muestra experimental para configurar la sincronización para la clasificación. Lo ideal es establecer el control en el experimento piloto de la FACS, y la muestra control negativo proporcionará confirmación o ajuste fino de la compuerta de uso previamente establecido. Las células de interés deben estar bien separadas de las celdas de fondo que están presentes en la muestra experimental (figura 4) y el control negativo (prueba de esto en las experiencias piloto).
- Recoger las células ordenadas en los tubos preparados.
- Purificación de RNA
- Después de clasificar las células directamente en 300 μL de tampón RLT, pipeta hacia arriba y hacia abajo para lisar las células.
- Purificar RNA siguiendo el protocolo estándar de purificación de RNA Total de animales y células humanas mediante la purificación kit (véase Tabla de materiales) de digestión de DNA en la columna7. Eluir el RNA en 20 μL de agua libre de ARNasa.
- Congelar las muestras de RNA con nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C.
- Efectuar al menos 3 repeticiones para el control y las condiciones experimentales para cada experimento. Preparar las bibliotecas de cDNA para todas las muestras al mismo tiempo y ejecutan todas las muestras en la misma celda de flujo para controlar la variabilidad técnica. Una vez que se preparan todas las muestras de RNA, use una aspiradora de velocidad para reducir el volumen a 2 – 5 μL (cada muestra).
4. preparación de las bibliotecas de cDNA y secuenciación por Smart-Sec2
Nota: Para minimizar la variabilidad técnica, hacer todas las bibliotecas de cDNA al mismo tiempo y la secuencia sobre la misma célula de flujo.
- Utilizar una entrada de 1,5 μL de ARN concentrado para hacer cDNA bibliotecas siguiendo el protocolo estándar para Smart-Sec217 salvo las siguientes modificaciones: uso un diverso amo de PCR de alta fidelidad de la mezcla (véase Tabla de materiales) para PCR amplificación; utilizar una purificación en columna del PCR kit (véase Tabla de materiales) en lugar de bolas magnéticas para purificar productos de PCR.
- El protocolo Smart-Sec2 incluye un paso de la amplificación de PCR después de reversa de la transcripción, así como un paso de la polimerización en cadena de enriquecimiento final después de tagmentation. El número de ciclos en la amplificación de la polimerización en cadena depende de la abundancia de material de entrada. Con 1.000 células como entrada, suelen utilizar 15 ciclos en la etapa de pre amplificación de PCR y 12 ciclos para el paso de la polimerización en cadena de enriquecimiento final.
- Las bibliotecas de la piscina y secuencia en una celda de flujo único (por ejemplo, la plataforma de NextSeq).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Esquema general
Un esquema general del Protocolo se muestra en la figura 1. El protocolo se divide en tres partes principales: volar trabajo, preparación de la muestra, secuenciación y análisis de datos. La sesión del Protocolo de "Planificación antes del experimento" no está incluida en el esquema general para la simplicidad.
Línea de tiempo
Un calendario de las principales partes del Protocolo (mosca trabajo y preparación de la muestra) se muestra en la figura 2.
Verificación de etiquetado específico de célula mediante microscopía confocal
En un experimento representativo, fluorescencia fueron etiquetadas L3 neuronas monopolares de lámina (L3). L3 la neurona es una de las cinco neuronas de lámina homóloga (L1-L5) que reciban la señal de los fotorreceptores ampliamente atentos R1-R6 y transmitir la información al centro de alta por conectado a las neuronas de la blanco en la médula. En un experimento MARCM, clones celulares solo L3 son generados por la recombinación mitótica y fluorescencia marcados por dos marcadores, myr-tdTOM (membrana) y H2A-GFP (nucleares). Los genotipos de las moscas en las cruces se muestran en la tabla 1. Para verificar el etiquetado específico de célula, cerebros de mosca del genotipo deseado fueron disecados en la etapa de desarrollo de interés (40 h APF). Inmunotinción se realizó como se describió anteriormente7 utilizando anticuerpos específicos contra la dsRed y GFP (figura 3, magenta y verde), así como el anticuerpo de 24B10 como referencia para el neuropils lámina y médula (figura 3, azul). La microscopia confocal confirmó que el L3 es el único tipo de célula etiquetado dsRed y GFP en el lóbulo óptico.
Aislamiento de las células de la abundancia baja por FACS
Un FACS representante clasificación resultado se muestra en la figura 4. se registraron 100.000 eventos. 29.9% de todos los eventos son posibles camisetas, y el resto podría ser escombros o áridos. Dobletes y las células de diferentes tamaños fueron entonces cerradas basado en nivel de detalle y tamaño. De las restantes células (camisetas FSC, 27,3% de todos los eventos), las neuronas L3 aparecieron como un racimo estrecho en P1 (figura 4, muestra, magenta), que también fue separado de las células del fondo (figura 4, muestra, azul). El tamaño de las células en P1 fue similar consistente con una población celular homogénea. En particular, algunas células en P2 (figura 4, muestra, verde) con intensidad de fluorescencia intermedia de dsRed y GFP se distribuyeron entre el apretado grupo de células en P1 y el fondo. No estaba clara la identidad de estas células. Puesto que P2 células tenían un tamaño diferente que las células de P1, estas células eran propensos a ser inespecíficos. Para evitar la contaminación potencial de las células no específicas, solamente las células de P1 se recolectaron para el experimento. De 100.000 eventos, se obtienen 45 células de P1.
Figura 1: un esquema general del Protocolo de. El protocolo consta de tres partes: volar trabajo, preparación de la muestra, secuenciación y análisis de datos. Se indica el tiempo aproximado de cada parte. Pasos principales de cada parte aparecen también en las regiones correspondientes en caja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: línea de tiempo para volar trabajo y preparación de la muestra. El protocolo dura aproximadamente 6 semanas. Sincronización de los pasos principales se muestra en el calendario. Disección, disociación y purificación del ARN se realizan en el mismo día de la clasificación de la FACS y no se muestran en el calendario para la simplicidad. Tres réplicas biológicas se realizan secuencialmente en la misma semana con la misma cruza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: una imagen representativa de microscopía confocal mostrando el etiquetado selectivo de deseado a las células por marcadores fluorescentes. En experimentos MARCM, las neuronas monopolares de la lámina individuales de L3 hicieron myr-tdTOM y H2A-GFP usando un específico L3 GAL4 driver (9-9-GAL4)18. Cerebros de mosca del genotipo deseado fueron disecados en 40hr APF y teñidos con anticuerpos anti-dsRed, anti-GFP y 24B10 (como una referencia para el neuropils lámina y médula). Etiquetado fluorescente se evaluó mediante microscopía confocal. L3 neuronas nacen en las lámina y proyecto axones que terminan en el neuropilo médula. En cada cerebro, un subconjunto de neuronas L3 expresó ambos reporteros fluorescentes, y estas eran las células sólo en el lóbulo óptico expresan los marcadores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: purificación sola neurona de lámina L3 MARCM clones vía FACS: una parcela representativa del FACS. Puertas (por ejemplo, P1) fueron creados en base a células granularidad, tamaño y fluorescencia intensidad para aislar células individuales homogéneas. Se recolectaron de neuronas L3 expresando asimismo altos niveles de myr-tdTOM y H2A-GFP en P1 (magenta). Se observan algunas células con intensidad de fluorescencia intermedia en P2 (verde). Estos son diferentes en tamaño que las neuronas de la L3 en P1 y podrían representar no específicos de células. Estos no fueron recogidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Genotipo | Fuente |
| w; TubP-GAL80, FRT40, 27G 05-FLP::PEST/CyO, Kr-GAL4, UAS-GFP; 9-9-GAL4, UAS-myr::tdTOM/TM6B | Peng et al., 2018 |
| w; FRT40/CyO, Kr-GAL4, UAS-GFP; UAS-H2A-GFP/TM6B | Peng et al., 2018 |
Tabla 1: Genotipos de moscas en las cruces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo es simple y no es técnicamente difícil ejecutar, pero hay claves varios pasos que si se pasa por alto la voluntad de provocar una reducción considerable en el rendimiento celular. (Paso 2.3.2.) Es crucial que los cruces son saludables, y que los alimentos no se resequen. Riego regular de cruces es esencial para maximizar el número de moscas disponibles para la disección del genotipo adecuado y en la etapa correcta de desarrollo. Con qué frecuencia necesidad de cruces a regar variará dependiendo de los alimentos utilizados y las condiciones de vivienda de las moscas. Garantizar cruces no seco, examine los frascos de dos veces al día y añadir agua en consecuencia. (Paso 3.3). También es importante piscina cerebros disecados en un microtubo única que se utilizará para la disociación, en lugar de tener cada disector de utilizar su propio microtubo y luego posteriormente agrupación de las muestras. Esto eliminará cualquier cerebro perdido de transferir entre los microtubos, que pueden ser considerable. (Paso 3.4.9.) Cuando pipeteo arriba y abajo para interrumpir manualmente el tejido, es vital hacerlo hasta que no hay restos del tejido son visibles por el ojo en la suspensión. Interrupción incompleta del tejido, reducirá el número de células que puede ordenarse vía FACS y por lo tanto disminuir el rendimiento celular.
La limitación importante de rendimiento celular es material de partida. En este sentido, las disecciones son tasa de limitación por varias razones: (1) el protocolo de disociación requiere lóbulos ópticos para ser disecado de la cabeza y separados del cerebro central (2) para obtener tejido en momentos precisos durante el desarrollo del tiempo ventana para disecciones debe ser limitada, (3) más largo es el período entre las disecciones y FACS, mayor será la posibilidad de suboptimal celular salud y efectos no específicos de expresión génica y organización genómica (es decir, cuanto menor sea la disección período mejor). El tiempo de disección debe modificarse para obtener la cantidad deseada de material en la cantidad mínima de tiempo. La mayor parte de la solución de problemas se realiza en los experimentos piloto. Aquí es crucial para: optimizar genética etiquetado para el brillo y la especificidad (figura 3), evaluar si una población reproductiva de las células de interés son claramente separados de las células de fondo en parcelas de FACS (figura 4), determinar la número de cerebros que deben ser disecados para obtener una cantidad suficiente de material para aplicaciones posteriores (ver paso 1. Volar de trabajo) y determinar la cantidad mínima de tiempo necesario para diseccionar los números apropiados de cerebros.
El gran avance de este protocolo es que permite eficiente aislamiento de células abundantes bajas para aplicaciones genómicas, mejorar sensibilidad considerablemente sobre nuestra anterior método6y transcriptómicos. De acuerdo con nuestras estimaciones, fluorescencia etiquetada las poblaciones con menos de 100 células por lóbulo óptico pueden ser eficientemente aisladas por análisis de RNA-seq. Esto permite análisis genómicos para su aplicación en experimentos de genética mosaico, en subconjuntos de células de un tipo particular son manipulados genéticamente en un fondo normal y transcriptómicos. Esto representa un avance fundamental, como tales son esenciales para la determinación de funciones de genes autónomos y no autónomos de la célula en tejidos complejos experimentos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por el NINDS de los institutos nacionales de salud con el número de concesión K01NS094545, andgrants del centro para el estudio de enfermedades neurodegenerativas Lefler. Reconocemos Tan encalado y Jason McEwan para conversaciones valiosas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
