Summary
Hier präsentieren wir eine Zelle Dissoziation Protokoll für effizient bei geringen Fülle innerhalb des visuellen Systems der Drosophila durch Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortieren (FACS) Zellen zu isolieren.
Abstract
Verbesserungen in der Empfindlichkeit der Sequenzierung der nächsten Generation haben die Anwendung von transkriptomischen und genomische Analysen auf eine kleine Anzahl von Zellen erleichtert. Nutzt diese Technologie, um die Entwicklung in dem visuellen System von Drosophila zu untersuchen, die eine Fülle von Zelle-spezifischen genetischen Werkzeuge bietet, liefert einen leistungsfähigen Ansatz für die Bewältigung der molekularen Grundlagen der Entwicklung mit genauen zellulären Auflösung. Für einen solchen Ansatz realisierbar ist es wichtig in der Lage, zuverlässig und effizient bei geringen Fülle im Gehirn Zellen zu reinigen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, die effiziente Reinigung von einzelnen zellklonen im genetischen Mosaik Experimente ermöglicht. Mit diesem Protokoll erreichen wir konsequent einen hohen zellulären Ertrag nach der Reinigung mit Fluoreszenz Zelle Sortieren (FACS) (~ 25 % aller markierten Zellen) aktiviert, und erfolgreich Transkriptom-Analysen auf einzelne zellklonen erzeugt durch Mosaik-Analyse mit einem tragen Zelle Marker (MARCM). Dieses Protokoll ist ideal für die Anwendung von transkriptomischen und genomische Analysen zu spezifischen Zelltypen im visuellen System in verschiedenen Stadien der Entwicklung und im Zusammenhang mit verschiedenen genetischen Manipulationen.
Introduction
Das visuelle System von Drosophila ist ein hervorragendes Modell für die Erforschung der genetischen Grundlagen von Entwicklung und Verhalten. Es umfasst eine stereotype zellulären Architektur1 und eine erweiterte genetische Toolkit zur Bearbeitung von bestimmten Zelle Arten2,3. Die große Stärke dieses Systems ist die Fähigkeit, selbstständig zu verhören Genfunktion in Zelltypen des Interesses mit einzelligen Auflösung, mit genetischen Mosaik Methoden4,5. Wollten wir diese genetische Werkzeuge mit den jüngsten Fortschritten in der nächsten Generation Sequenzierung durchzuführen Zelle typspezifischen transkriptomischen kombinieren und genomische Analysen in einzelne Zelle Klone in genetischen Mosaik Experimente.
Um dies zu erreichen, ist es wichtig, eine robuste und effiziente Methode, um niedrige reichlich Zellpopulationen im Gehirn selektiv isolieren zu entwickeln. Zuvor haben wir ein Protokoll für bestimmte Zelltypen im visuellen System während pupal Entwicklung durch FACS zu isolieren und bestimmen ihre Transkriptom mittels RNA-Seq6entwickelt. In diesen Experimenten wurden die überwiegende Mehrheit der Zellen eines bestimmten Typs (z. B. R7 Photorezeptoren) eindringmittel beschriftet. Mit dieser Methode in genetischen Mosaik-Experimente, wobei nur eine Teilmenge von Zellen des gleichen Typs sind beschriftet, konnten wir genügend Zellen zur Sequenzierung Qualitätsdaten erhalten zu isolieren. Um dieses Problem anzugehen, haben wir versucht, den zellulären Ertrag zu steigern, durch die Verbesserung der Zelle Dissoziation Protokoll.
Unser Ansatz war es, die Gesamtlänge des Protokolls zum Maximieren der Gesundheit der dissoziierten Zellen, Verbesserung der zellulären Gesundheit durch Veränderung der Dissektion und Dissoziation Puffer zu verringern, und reduzieren die Menge der mechanischen Störung des sezierten Gewebes. Wir testeten die verbesserte Protokoll7 mit Mosaik-Analyse mit einem tragen Zelle Marker5 (MARCM), wodurch Generation Single eindringmittel beschriftet Klone von bestimmten Zelltypen, die Wildtyp oder Mutant für ein Gen des Interesses an einer Ansonsten heterozygot fliegen. Wo unter identischen Bedingungen unserer früheren Protokoll konnte nicht genügend Material für RNA-Seq generiert, war das verbesserte Protokoll erfolgreich. Wir reproduzierbar zellulären ertragreich (~ 25 % der markierten Zellen) und hohe Datenqualität RNA-Seq von weniger als 1.000 Zellen7erhalten.
Eine Reihe von Protokollen sind bisher beschrieben worden, um bestimmte Zelltypen in Drosophila6,8,9,10,11,12,13 isolieren , 14 , 15 , 16. diese Protokolle sind vor allem gedacht für die Isolierung von Zellen, die reichlich im Gehirn sind. Unser Protokoll ist optimiert für geringe reichlich Zell-Populationen (weniger als 100 Zellen pro Gehirn) im visuellen System mit FACS für nachfolgende transkriptomischen und genomische Analysen zu isolieren. Mit diesem Protokoll wollen wir bieten eine Möglichkeit, niedrige reichliche Zellen aus dem Fliegen visuelle System indem Sie FACS und hohe Datenqualität durch RNA-FF Transkriptom reproduzierbar zu isolieren
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Protocol
1. Planung vor dem Experiment
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Führen Sie vor Beginn des Experiments einen kleinen Pilotversuch um sicherzustellen, dass die Genetik erwartungsgemäß, speziell die gewünschten Zellen zu kennzeichnen.
- Als ersten Durchgang, Gebrauch Immunohistochemistry und Lichtmikroskopie zu ermitteln, ob sind unerwünschte Zellen gekennzeichnet. Im Idealfall werden genetische Marker spezifische innerhalb der Netzhaut und Optik Lappen (Abbildung 3). Nur Sehlappen dienen zur Zelle Dissoziation und so in das zentrale Gehirn Kennzeichnung ist kein Problem. Zum gleichen Zeitpunkt bestimmen Sie, wie viele Zellen des Interesses pro Gehirn gekennzeichnet sind.
- Wenn die genetische Etikett(en) die gewünschten Spezifität, ein pilot FACS-Experiment (Abbildung 4) um festzustellen, ob eine reine Population von Zellen durchführen haben reproduzierbar isoliert werden können und auch zu beurteilen, wie viele Zellen von Interesse kann isoliert werden aus jedem Gehirn. Wenn nötig, beurteilen Sie die Reinheit der isolierten Zellen durch quantitative PCR zu bestimmen, die Anreicherung oder de-Anreicherung bestimmter Gene.
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Bestimmen Sie die Anzahl der Kreuze erforderlich, um die gewünschte Menge an Material für das Experiment.
Hinweis: Basierend auf experimentellen Erfahrungen, ~ 17 – 25 % der fluoreszent markierten Zellen werden mit diesem Protokoll konsequent isoliert und qualitativ hochwertige RNA-Sequenzierung Daten stammen aus so wenig wie 1.000 FACS gereinigt-Zellen (weniger Zellen können ausreichend sein).- Um 1.000 Zellen für RNA-Seq-Analysen zu erhalten, sicherzustellen Sie, dass es mindestens 40 Zellen von Interesse eindringmittel pro Gehirn (20 Zellen pro Optik Lappen) beschriftet. Sezieren Sie um ~ 10, die Zellen von Interesse pro Gehirn, gereinigt zu werden also 100 Köpfe.
- Um ~ 100 fliegen in die entsprechenden Entwicklungsstadium in jedem Experiment sezieren zu erhalten, verwenden Sie ~ 100 Kreuze wenn gegen Balancer auswählen (Dies variiert je nach die Genotypen der Eltern). Wenn fliegen homozygot für die Allele/transgene von Interesse sind weniger Kreuze einstellbar.
- Begrenzen der Dissektion Fenster bis 1 h zelluläre Gesundheit maximieren und minimieren unspezifische Änderungen der Genexpression und Genom-Organisation, die auftreten können, nachdem Gehirne seziert, aber dies eingestellt werden kann. Bestimmen Sie die Anzahl der Dissectors, 100 Köpfe in 1 h zu zergliedern, die abhängig von der Fähigkeit der Dissectors erforderlich.
2. fliegen Arbeit
Hinweis: Fliegen sind bei 25 ° C mit ca. 50 % Luftfeuchtigkeit ausgelöst, sofern nicht anders angegeben. Unterhalb der Genotyp der Weibchen ist als Genotyp F, und das Männchen als Genotyp M angegeben.
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Wachsenden Bestände
- Erhalten Sie ~ 100 Durchstechflaschen mit jungen fliegen (nicht mehr als eine Woche alt mit Genotyp F) und ~ 30 Fläschchen mit Genotyp M.
- Drehen Sie am Donnerstag der Woche 1 100 Durchstechflaschen mit Genotyp F auf frische Lebensmittel. Ab Freitag, spiegeln Sie die Fläschchen jeden Tag bis Dienstag der Woche 2. Diese 6 Flips werden verwendet werden, um die Jungfrauen zu sammeln. Auch am Mittwoch der Woche 2 flip fliegen von Genotyp M auf frische Lebensmittel und löschen Sie die Eltern am Freitag der Woche 2. Diese Fläschchen werden verwendet werden, um Männer für die Kreuze zu sammeln.
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Sammeln von Jungfrauen
- Montags von Woche 3 sammeln Sie Jungfrauen aus den Genotyp F-Fläschchen. Sammeln Sie 2 - 3 Mal pro Tag und speichern Sie die Jungfrauen bei 18 ° C mit ca. 50 % Luftfeuchtigkeit. Wiederholen Sie diesen Vorgang täglich bis Dienstag der 4. Woche. Es wird dringend empfohlen, möglichst viele Jungfrauen wie möglich zu sammeln, da viele von ihnen sterben bevor die Kreuze gesetzt werden. In der Regel kreuzt ~ 2.500, die Jungfrauen gesammelt werden sollten, um 100 zu setzen.
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Einstellung der Kreuze
- Am Freitag der 4. Woche legen Sie die gewünschten Nummern der Kreuze (in der Regel 100-200 Kreuze pro Experiment) mit 15 Jungfrauen der Genotyp F und 7 Rüden von Genotyp M für jedes Kreuz. Es ist sehr wichtig, junge und gesunde Männer mit intakten Flügel einzusetzen.
- Drehen Sie die Kreuze täglich von Sonntag bis Samstag der Woche 5. Ergänzen Sie die Kreuze mit frischen Jungfrauen oder Männchen, wenn Tote fliegen gefunden werden. Es gilt zu verhindern, dass die Speisen austrocknen, also die Fläschchen Wasser, je nach Bedarf. Trockenfutter wird die Rendite deutlich schmälern.
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Negativ-Kontrolle für die Sortierung von FACS
- Unter anderem eine negative Kontrolle ohne die gewünschten Zellen, beschriftet für die FACS-Sortierung. Idealerweise sollten die negative-Kontrolle der Reporter (z.B. FH-GFP) aber nicht der Fahrer (z.B. GAL4) haben, so dass basale Ausdruck des Reporters (FH-Konstrukte können "undicht" sein) bestimmt werden kann, geeignete Anspritzung für die FACS Sortierung festlegen. Flip die fliegen für die negativ-Kontrolle zur gleichen Zeit mit den experimentellen fliegen, und in der gleichen Weise zu inszenieren.
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Staging-Puppen
- Zellen in einem bestimmten Stadium der pupal Entwicklung (z. B. 40 h nach puppenkammer Bildung [h APF]), Bühne gesammelt die Puppen in einem Zeitfenster von 1 h mit 1 h Zeit für Sezierungen (siehe oben) zugeteilt. FACS sollte direkt nach Zelle Dissoziation, tritt nach Sezierungen und dauert ~ 40 min durchgeführt werden. Also, ist der genaue Zeitpunkt der Inszenierung und Sezierungen durch FACS Verfügbarkeit bestimmt.
- Um Puppen bei 40 h APF zu erhalten, am Montag der Woche 6 zu inszenieren, zu einem bestimmten Zeitpunkt (z. B. 17:00), Puppen 40 h später zu zergliedern (z. B. 09:00 am Mittwoch). Verwenden Sie einen nassen Pinsel sanft weißen Pre-Puppen und legen Sie sie an der Wand in vorgewärmten Fläschchen. Wählen Sie nur die Puppen mit gewünschten Genotyp.
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Biologischer Replikate
- Mindestens 3 biologische Wiederholungen für jedes Experiment zu tun. Als eine einfache Möglichkeit wiederhole das Experiment dreimal in der Woche (Woche 6) mit der gleichen Kreuze. Z. B. Bühne Puppen für die zweiten und dritten Wiederholungen am Dienstag und Mittwoch, jeweils. Diese Puppen jeweils am Donnerstag und Freitag zu sezieren.
3. die Probenvorbereitung
Hinweis: Alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
- Lösungen für Sezierungen und Gewebe Dissoziation vorbereiten
- Vorbereiten der proteolytischen Enzym Mischung Stammlösung (siehe Tabelle der Materialien) durch Neuaufbau der gefriergetrockneten Enzyms mit DdH2O zu einer Konzentration von 26 Wünsch Einheiten (Wu) / mL. Für ein Fläschchen mit 260 Wu (große Flasche) das Fläschchen 10 mL DdH2O hinzu, und machen Sie Einweg-Aliquote (4.2 µL pro sind Dissoziation). Shop-Stammlösung bei-20 ° C. Jedes Experiment erfordert Dissoziation von zwei Proben (Negativkontrolle und experimentelle Gewebe).
- Bereiten Sie 10 x Rinaldini Lösung (RS) und komplette Schneider Media (CSM) am Vortag der Dissektion (Montag der Woche 6). 5 mL CSM für jedes Sezierer und etwa 5 mL 1 x RS und 5 mL des Richterrates für die Dissoziation von 2 Proben vorbereiten (negative Kontrolle und experimentell). 10 X RS bei 4 ° C für bis zu einem Monat und CSM bei 4 ° C bis zu einer Woche aufbewahren.
- Lösen Sie um 100 mL 10 X RS vorzubereiten, 8 g NaCl, KCl, 50 mg von NaH2PO4, 1 g Nahco33 und 1 g Glucose in 100 mL DdH2O in einem 250-mL-Becherglas 200 mg. Filter zu sterilisieren mit 0,22 mm Filter.
- 20 mg L-Glutathion zu 1 mL DdH2O in einer reaktionscup hinzufügen.
- Um 50 mL CSM vorzubereiten, fügen Sie 5 mL Hitze inaktiviert Rinderserum, 0,1 mL Insulin-Lösung 10 mg/mL, 5 mL 200 mM L-Glutamin Lösung, 12,5 μl von 20 mg/mL L-Glutathion und 1 mL Penicillin-Streptomycin-Lösung (5.000 Einheiten des Penicillins und 5 mg von streptomycin / mL) bis 38,9 mL Schneiders Medien. Filter zu sterilisieren mit 0,22 mm Filter.
- 10 X RS mit DdH2O 1 x RS funktionierende Lösung zu verdünnen. Jede Probe 500 μl 1 X RS in nichtklebenden mikroröhrchen vorbereiten.
- Schalten Sie ein Wasserbad und stellen Sie die Temperatur bei 37 ° C. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur korrekt ist, mithilfe eines Thermometers. Das Wasserbad darf bei der korrekten Temperatur vor Papain-Aktivierung. Es wird empfohlen, zum Einstellen der Temperatur am Vorabend eine Morgen-Dissektion.
- Bereiten Sie Papain und proteolytischen Enzym Mischung
Hinweis: Machen Sie Papain Lösung vor jeder Dissoziation frisch.- Am Dienstag der Woche 6 ca. 45 min vor dem Start die Sezierungen rufen Sie 1 Durchstechflasche mit Papain Pulver von 4 ° C ab und bei Raumtemperatur inkubieren. Auch beiseite CSM in ein Eppendorf-Röhrchen bei Raumtemperatur das Papain-Pulver später hinzu.
- min vor Beginn der Dissektionen der Durchstechflasche mit Papain (direkt über die GAP) die Raumtemperatur CSM hinzu, so dass die Konzentration 100 Einheiten/mL ist eine Spritze verwenden (die Menge des Pulvers in jedes Fläschchen ist etwas anders, für ein Fläschchen mit 123 Einheiten hinzufügen 1,23 m L der CSM). Mischen, zuerst das Fläschchen Pulver auf der Innenseite der Kappe fest erfassen invertieren und dann pipette rauf und runter.
- Hinzu kommt das Fläschchen einen Becher mit Wasser von 37 ° C im Wasserbad. Sicherstellen Sie, dass das Fläschchen Papain-Lösung nicht schwimmt. Aktivieren Sie das Papain für 30 min bei 37 ° C.
- Nach dem Hinzufügen der Papain, ein Becherglas im Wasserbad, rufen Sie eine Aliquote proteolytischen Enzym Mischung (26 Wu/mL) von-20 ° C und bei Raumtemperatur inkubieren. Inkubieren Sie nach 30 min der Aktivierung Papain bei Raumtemperatur.
- Sezierungen
- Am Dienstag der Woche 6 inszenierten pupal Gehirne in kalten CSM mit sauberen Pinzette zu sezieren, und die Sehlappen durch Kneifen an der Kreuzung von der Optik-Lappen und dem zentralen Gehirn abgeschnitten.
- Fügen Sie die Lappen am unteren Rand einer reaktionscup mit 500 μl 1 X RS (ein reaktionscup für das experimentelle Gewebe) und eine für die Negativkontrolle Gewebe. Halten Sie die Rohre auf dem Eis.
- So viele Lappen möglichst in 1 h zu sezieren. Für die negative kontrollgewebe genügen 10 Lappen. Pool seziert Sehlappen in einem einzigen reaktionscup Gewebeverlust während der Übertragung zwischen mikroröhrchen zu beseitigen.
- Zelle Dissoziation
- Entfernen Sie vorsichtig die 1 X RS aus die reaktionscup mit seziert Sehlappen mit einer P200-Pipette, verlassen die Lappen abdecken. Fügen Sie 500 μl 1 X RS sorgfältig auf die Seite des Rohres, um das Gehirn so wenig wie möglich stören. Halten Sie das Rohr auf dem Eis.
- Lassen Sie die Lappen nach unten zu begleichen. Gerade einmal 200 μL aufgreifen und pipette heraus um zu mischen (Lappen soll sich bewegen). Lassen Sie die Lappen wieder zu begleichen.
- Für zwei Proben (experimentelle und eine negative Kontrolle) aktiviert aliquoten 600 μL der Raumtemperatur Papain in eine reaktionscup. Fügen Sie 4.2 μL der Raumtemperatur proteolytischen Enzym Mischung in 600 μL Papain Lösung um eine Endkonzentration von 0,18 Wu/mL zu erhalten. Mischen von pipettieren rauf und runter. Dies ist die Dissoziation-Lösung.
- Sorgfältig entfernen Sie 1 X RS von jeder Probe und 300 μL der Dissoziation-Lösung in die Lappen. Inkubieren Sie die Proben bei 25 ° C, 1.000 u/min für 15 min in ein reaktionscup Thermomixer.
- Stoppen Sie zu den 5 und 10 min Zeitpunkten den Thermomixer und lassen Sie die Lappen an der Unterseite des die reaktionscup sinken. Dauern Sie bis 200 μl der Lösung und pipettieren, mischen.
- Lassen Sie nach 15 min die Lappen niederlassen nach unten und entfernen Sie vorsichtig die Dissoziation-Lösung von den Lappen (versuchen Sie nicht, die Lappen zu stören).
- Waschen Sie sich zweimal mit 1 X RS. Um dies zu tun, fügen Sie sorgfältig 500 μl 1 x RS (versuchen Sie nicht, die Lappen zu stören). Zu mischen, vorsichtig pipettieren bis 200 μL und dann pipettieren in die reaktionscup. Lassen Sie die Lappen auf den Boden sinken und wiederholen.
- Jede Probe zweimal mit 500 μL des CSM (identisch mit vorherigen Schritt) zu waschen.
- Sorgfältig Entfernen der CSM und eine weitere 200 μL des CSM in die Röhre. Mit einer Pipette P200 stören das Gewebe von oben und unten ohne Schaumbildung, pipettieren, bis die Lösung homogen ist (d.h., alle Reste des Gewebes nicht mehr sichtbar).
- Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 30 μm Mesh Cap in einer 5 mL FACS-Rohr auf dem Eis (ein P200 verwenden und sicherstellen, dass die gesamte Federung durchläuft). Fügen Sie eine weitere 500 μL des CSM, die Dissoziation reaktionscup zu spülen, und Filtern Sie die Lösung in der FACS-Röhre.
- Vorsichtig nehmen Sie die Kappe der FACS-Röhre, sammeln Sie die Lösung unter den Siebfilter mit einem P200 und fügen Sie es mit dem Rest der Suspension in der FACS-Röhre. Die Proben sind bereit für FACS.
- Achten Sie darauf, mikroröhrchen für das Sammeln von FACS gereinigt Zellen bereit im Voraus haben. Für RNA-Seq, Sortieren Sie Zellen von jeder Probe direkt in mikroröhrchen mit 300 μL der RLT-Puffer (Lyse Puffer) von der RNA-Reinigung-Bausatz (1: 100 2–Mercaptoethanol vor Gebrauch hinzufügen).
- FACS sortieren
Hinweis: Nach der Dissoziation, sofort sortieren Sie die Zellen durch FACS (max. 1 h). Stellen Sie sicher, Buch FACS Sitzungen entsprechend bei der Planung für das Experiment. Ein Zelle Sorter mit 100 μm Düsengröße wird normalerweise verwendet.- Vergleichen Sie die Zelle Verteilung in die negativ-Kontrolle und die experimentelle Probe gating für die Sortierung einzurichten. Im Idealfall zu etablieren, die Anspritzung in FACS-Pilotversuch wird, und die negative Kontrollprobe Bestätigung oder fine-tuning des vorher festgelegten gating. Die Zellen von Interesse aus den hintergrundzellen, die in die negativ-Kontrolle und die experimentelle Probe (Abbildung 4) sind, gut getrennt werden sollten (dies testen in den Pilotversuchen).
- Sammeln Sie die sortierten Zellen in die vorbereitete Röhrchen.
- RNA-Reinigung
- Nach der Sortierung der Zellen direkt in 300 μl Puffer RLT, pipettieren rauf und runter zu die Zellen zu lösen.
- RNA nach dem Standardprotokoll Reinigung des Gesamt-RNS aus tierischen und menschlichen Zellen, die mit der Reinigung Reinigen auf Spalte DNA Verdauung7kit (siehe Tabelle der Materialien). Eluieren Sie die RNA in 20 μl RNase-freies Wasser.
- Einfrieren der RNA-Proben mit flüssigem Stickstoff und Store bei-80 ° C.
- Führen Sie für jedes Experiment mindestens 3 Wiederholungen für Kontrolle und experimentellen Bedingungen. Vorbereiten der cDNA-Bibliotheken für alle Proben zur gleichen Zeit und führen Sie alle Proben auf dieselbe Zelle, für technische Variabilität zu kontrollieren. Sobald alle RNA-Proben vorbereitet sind, verwenden Sie eine Speed-Vac, um das Volumen auf 2 – 5 μL (jede Probe) zu reduzieren.
4. Vorbereitung cDNA-Bibliotheken und Sequenzierung von Smart-seq2
Hinweis: Zur Minimierung von technischen Variabilität machen die cDNA-Bibliotheken zur gleichen Zeit, und sie auf die gleichen Durchflusszelle Sequenz.
- Verwenden Sie eine Eingabe von 1,5 μL konzentrierte RNA cDNA-Bibliotheken zu machen, indem Sie die folgenden des Standardprotokolls für Smart-seq217 bis auf folgenden Änderungen: Verwendung ein anderen HiFi-PCR Master mix (siehe Tabelle der Materialien) für PCR Verstärkung; verwendet eine auf Spalte PCR Reinigung kit (siehe Tabelle der Materialien), anstelle von magnetischen Beads, PCR-Produkte zu reinigen.
- Die Smart-seq2 Protokoll beinhaltet einen PCR Vorverstärkung Schritt nach der reversen Transkription, sowie eine abschließende anreicherungsschritt PCR nach Tagmentation. Die Anzahl der Zyklen bei der PCR Verstärkung hängt von der Fülle der input-Material. Verwenden Sie mit 1.000 Zellen als Eingabe in der Regel 15 Zyklen in der PCR Vorverstärkung Schritt und 12 Zyklen für die endgültige anreicherungsschritt PCR.
- Die Bibliotheken zu bündeln und sie auf einer einzigen Durchflusszelle (z. B. die NextSeq-Plattform) Sequenz.
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Representative Results
Allgemeine Regelung
Ein allgemeines Schema des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt. Das Protokoll gliedert sich in drei Hauptteile: Arbeit, Probenvorbereitung, Sequenzierung und Analyse von Daten zu fliegen. Die "Planung vor dem Experiment" Sitzung des Protokolls ist nicht in das allgemeine Schema der Einfachheit halber enthalten.
Timeline
Ein Kalender der wichtigsten Teile des Protokolls (Fly Arbeit und Probenvorbereitung) ist in Abbildung 2dargestellt.
Überprüfung der Zelle-spezifische Kennzeichnung durch konfokale Mikroskopie
In einem repräsentativen Experiment wurden eindringmittel L3 Lamina monopolare Neuronen (L3) beschriftet. L3 Neuron ist eines der fünf homologe Lamina Neuronen (L1-L5), die Eingabe von breit abgestimmten Photorezeptoren R1-R6 erhalten und Relais die Informationen zu der hohen Mitte von synapsing Ziel Neuronen in der Medulla. In einem Experiment MARCM sind einzelne zellklonen L3 erzeugt durch Mitotische Rekombination und eindringmittel gekennzeichnet durch zwei Markierungen, Myr-TdTOM (Membran) und H2A-GLP (Kern-). Die Genotypen der fliegen in die Kreuze verwendet sind in Tabelle 1dargestellt. Überprüfen Sie zellspezifische Kennzeichnung, waren fliegen Gehirne von der gewünschten Genotyp in der Entwicklungsphase von Interesse (40 h APF) seziert. Immunostaining wurde als zuvor beschriebenen7 mit der 24B10-Antikörper Antikörper gegen DsRed und GLP (Abbildung 3, Magenta und grün) spezifische sowie als Referenz für die Lamina und Medulla Neuropils (Abbildung 3, blau) durchgeführt. Konfokale Mikroskopie bestätigt, dass L3 die einzige Zelltyp gekennzeichnet durch DsRed und GLP in der Optik-Lappen.
Isolation von niedrig-Fülle Zellen durch FACS
Ein Vertreter FACS sortieren Ergebnis ist in Abbildung 4dargestellt. 100.000 Ereignisse aufgezeichnet wurden. 29,9 % aller Ereignisse sind potenzielle Unterhemden könnte, und des Rests Schmutz oder Aggregate. Dubletten und Zellen mit verschiedenen Größen wurden dann, basierend auf Granularität und Größe bewachte. Von den verbleibenden Einzelzellen (FSC Unterhemden, 27,3 % aller Ereignisse) L3 Neuronen erschien als eine enge Cluster in P1 (Abbildung 4, Probe, Magenta), die wurde auch von den hintergrundzellen (Abbildung 4, Probe, blau) getrennt. Die Größe der Zellen im P1 war ähnlich konsistent mit homogenen zellulären Einwohnern. Insbesondere wurden ein paar Zellen in P2 (Abbildung 4, Probe, grün) mit mittleren Fluoreszenzintensität DsRed und GFP zwischen den engen Cluster von Zellen in P1 und dem Hintergrund verteilt. Die Identität dieser Zellen war nicht klar. Da P2 Zellen eine andere Größe als die P1-Zellen hatten, wurden diese Zellen zu unspezifisch. Zur Vermeidung von möglichen Verunreinigungen aus den Zellen der unspezifischen sammelten nur P1 Zellen für das Experiment. 100.000 Veranstaltungen sind 45 P1 Zellen entnommen.
Abbildung 1: ein allgemeines Schema des Protokolls. Das Protokoll besteht aus drei Teilen: Arbeit, Probenvorbereitung, Sequenzierung und Analyse von Daten zu fliegen. Die ungefähre Bearbeitungszeit der einzelnen Teile wird angezeigt. Hauptschritte der einzelnen Teile sind auch in der entsprechenden Box Regionen gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Timeline für fliegen Arbeit und Probenvorbereitung. Das Protokoll dauert etwa 6 Wochen. Zeitplan für die wichtigsten Schritte wird im Kalender angezeigt. Dissektion, Dissoziation und RNA Reinigung erfolgt am selben Tag wie die FACS-Sortierung und erscheinen nicht im Kalender für Einfachheit. Drei biologische Wiederholungen sind sequentiell durchgeführt, in der gleichen Woche mit der gleichen kreuzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: ein repräsentatives konfokalen Mikroskopie-Bild zeigt die selektive Kennzeichnung der gewünschten Zellen durch fluoreszierende Markierungen. MARCM Experimente wurden einzelne L3 Lamina monopolare Neuronen zu Myr-TdTOM und H2A-GFP mit einem L3-spezifische GAL4-Treiber (9-9-GAL4)18zum Ausdruck bringen. Fliegen Gehirne des gewünschten Genotyps wurden bei 40 Std. APF seziert und befleckt mit Anti-DsRed, Anti-GFP und 24B10 Antikörper (als Referenz für die Lamina und Medulla Neuropils). Fluoreszierende Kennzeichnung wurde anhand der konfokalen Mikroskopie. L3 Neuronen entstehen in der Lamina und Projekt Axone, die innerhalb der Medulla Neuropil beenden. In jedem Gehirn eine Teilmenge der L3 Neuronen ausgedrückt beide fluoreszierende Reporter, und diese waren nur Zellen in der Optik-Lappen mit dem Ausdruck der Marker. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Reinigung von einzelnen L3 Lamina Neuron MARCM über FACS Klone: eine repräsentative FACS Plot. Tore (z.B. P1) entstanden basierend auf Zelle Granularität, Größe und Fluoreszenz-Intensität, homogene Einzelzellen zu isolieren. L3-Neuronen, die mit dem Ausdruck ähnlich hohe Myr-TdTOM und H2A-GFP wurden von P1 (Magenta) gesammelt. Ein paar Zellen mit mittleren Fluoreszenzintensität werden in P2 (grün) beobachtet. Diese unterscheiden sich in Größe L3 Neuronen in P1 und unspezifischen Zellen darstellen könnte. Diese wurden nicht gesammelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Genotyp | Quelle |
| w; TubP-GAL80, FRT40, 27G 05-FLP::PEST/CyO, Kr-GAL4, UAS-GFP; 9-9-GAL4, FH-myr::tdTOM/TM6B | Peng Et Al., 2018 |
| w; FRT40/CyO, Kr-GAL4, UAS-GFP; FH-H2A-GLP/TM6B | Peng Et Al., 2018 |
Tabelle 1: Genotypen von fliegen in die Kreuze verwendet.
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Discussion
Dieses Protokoll ist einfach und nicht technisch schwierig zu realisieren, aber es gibt einige wichtige Schritte, die wenn Sie übersehen wird dazu führen, dass eine erhebliche Reduzierung in zellulären Ausbeute. (Schritt 2.3.2.) Es ist entscheidend, dass Kreuze gesund sind, und dass das Essen nicht austrocknet. Regelmässige Bewässerung der Kreuze ist wichtig, die Anzahl der fliegen zur Dissektion zu maximieren, die von der richtigen Genotyp und in der richtigen Phase der Entwicklung. Wie oft kreuzen müssen gewässert werden, variiert je nach verwendeten Nahrungsmittel und die Wohnverhältnisse der fliegen. Um sicherzustellen, dass die Kreuze nicht austrocknen, untersuchen Sie die Ampullen zweimal am Tag und fügen Sie Wasser entsprechend hinzu. (Schritt 3.3.) Es ist auch wichtig, seziert Gehirne in einem einzigen reaktionscup zu bündeln, die für die Dissoziation, im Gegensatz zu mit jedem Sezierer verwenden Sie ihre eigenen reaktionscup und dann anschließend Bündelung der Proben verwendet werden. Dies verhindert jedes Gehirn verloren aus der Übertragung zwischen mikroröhrchen, die erheblich sein können. (Schritt 3.4.9.) Beim pipettieren rauf und runter um manuell Gewebe stören, ist es wichtig, dies zu tun, bis keine Reste des Gewebes mit dem Auge in der Suspension sichtbar sind. Unvollständige Gewebe Störungen verringert sich die Anzahl der Einzelzellen, die über FACS sortiert werden können, und zelluläre Ausbeute vermindern.
Die größte Beschränkung der zellulären Ausbeute beginnt Material. In diesem Zusammenhang sind die Sezierungen Ratenbegrenzung aus mehreren Gründen: (1) das Dissoziation-Protokoll erfordert Sehlappen seziert aus dem Kopf und getrennt vom zentralen Gehirn, (2), Gewebe zu präzisen Zeitpunkten während der Entwicklung zu erhalten werden die Zeit Fenster für Sezierungen muss, desto größer die Chance, suboptimale Zell-Gesundheit und unspezifische Auswirkungen auf Genexpression und genomische Organisation (d. h., je kürzer die Dissektion Limited, (3) je länger der Zeitraum zwischen Sezierungen und FACS, Zeitraum desto besser). Der Zeitaufwand sezieren sollte geändert werden, um die gewünschte Menge des Materials in die minimale Menge an Zeit zu erhalten. Die meisten der Fehlerbehebung wird in den Pilotversuchen durchgeführt. Hier ist es wichtig,: Optimieren Sie genetische Kennzeichnung für Helligkeit und Spezifität (Abbildung 3), beurteilen zu ermitteln, ob eine reproduzierbare Population von Zellen von Interesse sind klar getrennt vom hintergrundzellen in FACS Parzellen (Abbildung 4), die Anzahl der Köpfe, die müssen zerlegt werden, um eine ausreichende Menge an Material für spätere Anmeldungen zu erhalten (siehe Schritt 1. Fliegen Arbeit), und bestimmen Sie die minimale Menge an Zeit benötigt, um die entsprechenden Zahlen des Gehirns zu sezieren.
Die große Fortschritt dieses Protokolls ist, dass es ermöglicht die effiziente Isolierung der niedrigen reichlich Zellen für transkriptomischen und genomische Anwendungen, Verbesserung der Empfindlichkeit deutlich über unsere vorherigen Methode6. Basierend auf unseren Schätzungen, absperrbar eindringmittel beschriftete Populationen mit weniger als 100 Zellen pro Optik Lobe effizient für RNA-Seq Analysen. Dies ermöglicht transkriptomischen und genomische Analysen in genetischen Mosaik Experimente angewendet werden wobei Teilmengen von Zellen bestimmter Arten in einem sonst normalen Hintergrund gentechnisch manipuliert werden. Dies stellt einen wichtigen Fortschritt dar, als solche Experimente sind essentiell für die Bestimmung der Zelle autonom und nicht selbständig Genfunktionen in komplexen Geweben.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch das NINDS von den National Institutes of Health unter prämiennummer K01NS094545, Andgrants von Lefler Mitte für die Studie von neurodegenerativen Erkrankungen finanziert. Wir erkennen Kalkung Tan und Jason McEwan für wertvolle Gespräche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
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