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Genetics

Drosophila दृश्य प्रणाली में कम प्रचुर मात्रा में कोशिकाओं का शुद्धिकरण

Published: September 26, 2018 doi: 10.3791/58474
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurobiology, Harvard Medical School

Summary

यहाँ, हम प्रतिदीप्ति सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS) के माध्यम से Drosophila दृश्य प्रणाली के भीतर कम बहुतायत में मौजूद कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए एक सेल पृथक्करण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

अगली पीढ़ी sequencing की संवेदनशीलता में हाल ही में सुधार कोशिकाओं की छोटी संख्या के लिए transcriptomic और जीनोमिक विश्लेषण के आवेदन की सुविधा है. इस प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए Drosophila दृश्य प्रणाली है, जो सेल प्रकार के एक धन विशिष्ट आनुवंशिक उपकरणों का दावा में विकास का अध्ययन, सटीक सेलुलर संकल्प के साथ विकास के आणविक आधार को संबोधित करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान करता है । इस तरह के एक दृष्टिकोण के लिए संभव है, यह करने के लिए क्षमता है मज़बूती से और कुशलता से मस्तिष्क के भीतर कम बहुतायत पर मौजूद कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम एक तरीका है कि आनुवंशिक मोज़ेक प्रयोगों में एकल कोशिका क्लोनों के कुशल शुद्धि की अनुमति देता है वर्तमान । इस प्रोटोकॉल के साथ, हम लगातार प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग कर शुद्धि के बाद एक उच्च सेलुलर उपज प्राप्त (~ सभी लेबल कोशिकाओं के 25%), और सफलतापूर्वक एक सेल के माध्यम से उत्पन्न क्लोनों पर transcriptomics विश्लेषण प्रदर्शन एक repressible सेल मार्कर (MARCM) के साथ मोज़ेक विश्लेषण । इस प्रोटोकॉल दृश्य प्रणाली में विशिष्ट कोशिका प्रकार के लिए transcriptomic और जीनोमिक विश्लेषण लागू करने के लिए आदर्श है, विकास के विभिंन चरणों के पार और विभिंन आनुवंशिक जोड़तोड़ के संदर्भ में ।

Introduction

Drosophila दृश्य प्रणाली के विकास और व्यवहार के आनुवंशिक आधार का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है । यह विशिष्ट कोशिका प्रकार2,3हेर-फेर के लिए एक छवि एक सेलुलर वास्तुकला1 और एक उंनत आनुवंशिक toolkit शामिल हैं । इस प्रणाली की एक बड़ी ताकत एक सेल संकल्प के साथ ब्याज की कोशिका प्रकार में autonomously पूछताछ जीन समारोह की क्षमता है, आनुवंशिक मोज़ेक4तरीकों का उपयोग कर,5। हम अगली पीढ़ी अनुक्रमण में हाल ही में अग्रिमों के साथ इन आनुवंशिक उपकरण गठबंधन करने के लिए सेल प्रकार विशिष्ट transcriptomic और आनुवंशिक मोज़ेक प्रयोगों में एक सेल क्लोन में जीनोमिक विश्लेषण प्रदर्शन की मांग की ।

यह पूरा करने के लिए, यह एक मजबूत और कारगर तरीका चुन कर मस्तिष्क में कम प्रचुर मात्रा में कोशिका आबादी को अलग विकसित करने के लिए आवश्यक है । पहले, हम FACS के माध्यम से pupal विकास के दौरान दृश्य प्रणाली में विशिष्ट कोशिका प्रकार अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है, और आरएनए-seq6का उपयोग कर अपने transcriptomes का निर्धारण. इन प्रयोगों में, एक विशेष प्रकार की कोशिकाओं के विशाल बहुमत (जैसे R7 photoreceptors) फ्लोरोसेंट लेबल थे. इस विधि का प्रयोग, आनुवंशिक मोज़ेक प्रयोगों में, जिसमें केवल एक ही प्रकार की कोशिकाओं का एक सबसेट लेबल कर रहे हैं, हम गुणवत्ता अनुक्रमण डेटा प्राप्त करने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को अलग करने में विफल. इस पते के लिए, हम सेल पृथक्करण प्रोटोकॉल में सुधार के द्वारा सेलुलर उपज बढ़ाने की मांग की ।

हमारे दृष्टिकोण असंबद्ध कोशिकाओं के स्वास्थ्य को अधिकतम करने के लिए प्रोटोकॉल की कुल लंबाई कम करने के लिए किया गया था, विच्छेदन और पृथक्करण बफ़र्स फेरबदल करके सेलुलर स्वास्थ्य में सुधार, और विच्छेदित ऊतक को यांत्रिक विघटन की मात्रा को कम. हम बेहतर प्रोटोकॉल का परीक्षण7 एक repressible सेल मार्कर के साथ मोज़ेक विश्लेषण का उपयोग कर5 (MARCM) है, जो विशेष रूप से सेल प्रकार के एकल फ्लोरोसेंट लेबल क्लोन की पीढ़ी की अनुमति देता है, कि जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती ब्याज की एक जीन के लिए कर रहे है में एक अन्यथा heterozygous मक्खी. जहां, समान शर्तों के तहत, हमारे पहले प्रोटोकॉल आरएनए-seq के लिए पर्याप्त सामग्री उत्पन्न करने में विफल रहा, बेहतर प्रोटोकॉल सफल रहा । हम एक उच्च सेलुलर उपज प्राप्त reproducibly (~ लेबल कोशिकाओं के 25%) और उच्च गुणवत्ता आरएनए-seq डेटा प्राप्त करने के रूप में कम से १,००० कोशिकाओं7।

कई प्रोटोकॉल पहले Drosophila6,8,9,10,11,12,13 में विशेष कक्ष प्रकारों को अलग करने के लिए वर्णन किया गया है , 14 , 15 , 16. इन प्रोटोकॉल ज्यादातर कोशिकाओं है कि मस्तिष्क के भीतर प्रचुर मात्रा में है अलग करने के लिए इरादा कर रहे हैं । हमारे प्रोटोकॉल को अलग करने के लिए अनुकूलित है कम प्रचुर मात्रा में सेल (मस्तिष्क प्रति १०० कोशिकाओं से कम) दृश्य प्रणाली में बाद में transcriptomic और जीनोमिक विश्लेषण के लिए FACS का उपयोग कर । इस प्रोटोकॉल के साथ, हम FACS द्वारा फ्लाई दृश्य प्रणाली से कम प्रचुर मात्रा में कोशिकाओं को अलग reproducibly और आरएनए-seq द्वारा उच्च गुणवत्ता transcriptome डेटा प्राप्त करने के लिए एक रास्ता प्रदान करने के लिए लक्ष्य ।

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Protocol

1. योजना प्रयोग से पहले

  1. प्रयोग शुरू करने से पहले, अगर आनुवंशिकी वांछित कोशिकाओं को विशेष रूप से लेबल करने के लिए अपेक्षा के अनुरूप काम की पुष्टि करने के लिए एक छोटे पैमाने पर पायलट प्रयोग करते हैं ।
    1. पहले पास के रूप में, अवांछित कोशिकाओं लेबल कर रहे हैं यह निर्धारित करने के लिए immunohistochemistry और प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें. आदर्श रूप में, आनुवंशिक मार्करों रेटिना और ऑप्टिक पालि (चित्रा 3) के भीतर विशिष्ट हो जाएगा । केवल ऑप्टिक पालियों सेल पृथक्करण के लिए उपयोग किया जाता है और इसलिए केंद्रीय मस्तिष्क में लेबल एक मुद्दा नहीं है । एक ही समय में, निर्धारित कैसे ब्याज की कई कोशिकाओं के प्रति मस्तिष्क लेबल रहे हैं ।
    2. आनुवंशिक लेबल (ओं) वांछित विशिष्टता है, तो एक प्रायोगिक FACS प्रयोग (चित्रा 4) का निर्धारण करने के लिए यदि कोशिकाओं की एक शुद्ध जनसंख्या अलग reproducibly जा सकता है, और यह भी आकलन करने के लिए ब्याज की कितनी कोशिकाओं को प्रत्येक मस्तिष्क से अलग किया जा सकता है । यदि आवश्यकता हो तो विशिष्ट जीन के संवर्धन या डे-संवर्धन का निर्धारण करने के लिए मात्रात्मक पीसीआर के माध्यम से पृथक कोशिकाओं की शुद्धता का आकलन करें.
  2. प्रयोग के लिए सामग्री की वांछित राशि प्राप्त करने के लिए आवश्यक पार की संख्या निर्धारित करें ।
    नोट: प्रयोगात्मक अनुभव के आधार पर, ~ 17-फ्लोरोसेंट लेबल कोशिकाओं के 25% लगातार इस प्रोटोकॉल के साथ अलग कर रहे हैं, और उच्च गुणवत्ता आरएनए-अनुक्रमण डेटा १,००० FACS शुद्ध कोशिकाओं (कम कोशिकाओं पर्याप्त हो सकता है) के रूप में कुछ के रूप में से प्राप्त कर रहे हैं.
    1. आरएनए-seq विश्लेषण के लिए १,००० कक्षों को प्राप्त करने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि प्रति मस्तिष्क (ऑप्टिक पालिक प्रति 20 कक्षों) में रुचि रखने वाले न्यूनतम ४० कक्ष हैं । लगभग ~ 10 ब्याज की कोशिकाओं मस्तिष्क प्रति शुद्ध किया जाना चाहिए, तो काटना १०० दिमाग ।
    2. प्राप्त करने के लिए ~ १०० प्रत्येक प्रयोग में काटना के लिए विकास के उपयुक्त चरण में मक्खियों, का उपयोग करें ~ १०० पार अगर बालन के खिलाफ चयन (यह माता पिता के पादी के आधार पर भिंन होगा) । यदि मक्खियों के लिए homozygous है alleles/transgenes ब्याज की कम पार सेट किया जा सकता है ।
    3. 1 h करने के लिए विच्छेदन खिड़की सीमा सेलुलर स्वास्थ्य को अधिकतम करने और गैर विशिष्ट परिवर्तन जीन अभिव्यक्ति और जीनोम संगठन है कि दिमाग में विघटित कर रहे है के बाद हो सकता है को कम करने के लिए, लेकिन यह समायोजित किया जा सकता है । 1 ज में १०० दिमाग काटना करने के लिए आवश्यक प्रक्षेत्रों की संख्या निर्धारित करें, जो विक्षेत्रियों के कौशल पर निर्भर करता है ।

2. फ्लाई वर्क

नोट: मक्खियों 25 ° c पर ~ ५०% नमी के साथ उठाया जब तक अंयथा नोट कर रहे हैं । नीचे महिलाओं के जीनोटाइप जीनोटाइप एफ के रूप में संकेत दिया है, और जीनोटाइप एम के रूप में पुरुषों की है ।

  1. शेयरों का विस्तार
    1. प्राप्त ~ युवा मक्खियों की १०० शीशियों (कोई एक सप्ताह से अधिक पुराने) जीनोटाइप एफ और ~ जीनोटाइप एम के 30 शीशियों के साथ ।
    2. 1 सप्ताह के गुरुवार को, जीनोटाइप एफ के ताजा भोजन पर फ्लिप १०० शीशियों । शुक्रवार को शुरू, 2 सप्ताह के मंगलवार के माध्यम से शीशियों प्रत्येक दिन फ्लिप । इन 6 फ्लिप्स को कुंवारी इकट्ठा किया जाएगा । इसके अलावा 2 सप्ताह के बुधवार को, फ्लिप ताजा भोजन पर जीनोटाइप एम की मक्खियों और बाहर साफ 2 सप्ताह के शुक्रवार को माता पिता । इन शीशियों को क्रॉस के लिए पुरुषों को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
  2. कुंवारी का संग्रह
    1. 3 सप्ताह के सोमवार से, जीनोटाइप एफ शीशियों से कुंवारी इकट्ठा । एक दिन में 2-3 बार इकट्ठा और 18 ° c पर कुंवारी की दुकान ~ ५०% आर्द्रता के साथ । 4 सप्ताह के मंगलवार के माध्यम से यह प्रत्येक दिन दोहराएं । यह अत्यधिक संभव के रूप में कई कुंवारी के रूप में इकट्ठा की सिफारिश की है, उनमें से एक बहुत से मरने से पहले पार सेट कर रहे हैं । आमतौर पर, ~ २,५०० कुंवारी १०० पार सेट करने के लिए एकत्र किया जाना चाहिए ।
  3. सेटिंग काटता है
    1. 4 सप्ताह के शुक्रवार को, पार के वांछित संख्या निर्धारित (आमतौर पर 100-प्रयोग के अनुसार 200 पार) जीनोटाइप एफ के 15 कुंवारी और प्रत्येक पार के लिए जीनोटाइप मीटर के 7 पुरुषों के साथ । यह बहुत ही बरकरार पंख के साथ युवा और स्वस्थ पुरुषों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    2. 5 सप्ताह के शनिवार के माध्यम से रविवार से हर दिन पार फ्लिप । मृत मक्खियों पाया जाता है अगर ताजा कुंवारी या पुरुषों के साथ पार पूरक । यह खाना बाहर सुखाने से रोकने के लिए आवश्यक है, इसलिए पानी की शीशियों के रूप में की जरूरत है । ड्राई फूड से पैदावार में काफी कमी आएगी ।
  4. FACS छंटाई के लिए नकारात्मक नियंत्रण
    1. FACS सॉर्टिंग के लिए लेबल किए जा रहे इच्छित कक्षों के बिना कोई ऋणात्मक नियंत्रण शामिल करें । आदर्श रूप में, नकारात्मक नियंत्रण रिपोर्टर (जैसे यूएएस-GFP) लेकिन ड्राइवर (जैसे GAL4) नहीं होना चाहिए, ताकि रिपोर्टर के बेसल अभिव्यक्ति (यूएएस-constructs हो सकता है "टपका हुआ") गेटिंग छंटाई के लिए उपयुक्त FACS निर्धारित करने के लिए निर्धारित किया जा सकता है । प्रयोगात्मक मक्खियों के साथ एक ही समय में नकारात्मक नियंत्रण के लिए मक्खियों फ्लिप, और उसी तरह से उन्हें मंच.
  5. मचान प्यूपा
    1. pupal विकास के एक विशिष्ट स्तर पर कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए (जैसे puparium गठन के बाद ४० ज [एच APF]), एक 1 एच समय विंडो में प्यूपा के लिए 1 ज अवधि के साथ मैच के लिए आवंटित विच्छेदन (ऊपर चर्चा) । FACS सीधे सेल पृथक्करण के बाद किया जाना चाहिए, जो विच्छेदन के बाद होता है और ~ ४० मिनट लेता है । इस प्रकार, मचान और विच्छेदन का सही समय FACS उपलब्धता द्वारा निर्धारित किया जाता है ।
    2. ४० एच APF में प्यूपा प्राप्त करने के लिए, 6 सप्ताह के सोमवार को स्टेज पर एक विशिष्ट समय बिंदु (जैसे, 5 बजे) काटना प्यूपा ४० ज बाद में (जैसे, बुधवार को 9 बजे) । एक गीली तूलिका का उपयोग करने के लिए धीरे से सफेद पूर्व प्यूपा लेने और उंहें पूर्व गर्म शीशियों में दीवार पर जगह है । केवल वांछित जीनोटाइप के साथ प्यूपा उठाओ ।
  6. जैविक प्रतिकृति
    1. प्रत्येक प्रयोग के लिए कम से कम 3 जैविक प्रतिकृति करें । एक सरल तरीका के रूप में, प्रयोग को दोहराने तीन बार एक ही सप्ताह (6 सप्ताह) में एक ही पार का उपयोग कर । उदाहरण के लिए, दूसरे और तीसरे के लिए चरण प्यूपा क्रमशः मंगलवार और बुधवार को दोहराने । काटना ये प्यूपा क्रमशः गुरुवार और शुक्रवार को करें ।

3. नमूना तैयारी

नोट: सभी इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया एजेंट सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं ।

  1. विच्छेदन और ऊतक पृथक्करण के लिए समाधान तैयार करें
    1. proteolytic एंजाइम मिश्रण शेयर समाधान तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) ddH2के साथ lyophilized एंजाइम का पुनर्गठन करके 26 Wünsch इकाइयों (वू) की एकाग्रता के लिए/mL. २६० वू (बड़ी शीशी) युक्त एक शीशी के लिए, शीशी में ddH2ओ के 10 मिलीलीटर जोड़ें, और एकल उपयोग aliquots (४.२ µ एल पृथक्करण प्रति आवश्यक हैं) । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान की दुकान । प्रत्येक प्रयोग दो नमूनों की पृथक्करण (नकारात्मक नियंत्रण और प्रयोगात्मक ऊतक) की आवश्यकता है ।
    2. (6 सप्ताह के सोमवार) विच्छेदन से पहले दिन 10x Rinaldini के समाधान (आरएस) और पूरा Schneider के मीडिया (CSM) तैयार करें । प्रत्येक विCSM के लिए 5 मिलीलीटर तैयार करें, और CSM के 5 मिलीलीटर और 2 नमूनों के पृथक्करण के लिए 5 मिलीलीटर (नकारात्मक नियंत्रण और प्रायोगिक) । एक महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10x रुपये की दुकान है, और एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर CSM ।
      1. 10x रुपये की १०० मिलीलीटर तैयार करने के लिए, NaCl के 8 जी भंग, २०० मिलीग्राम की KCl, ५० मिलीग्राम के णः2पीओ4, 1 जी के NaHCO3 और 1 ग्राम में ग्लूकोज की १०० मिलीलीटर में ddH2हे एक २५० मिलीलीटर चोंच में. ०.२२ mm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर निष्फल ।
      2. इसमें 20 मिलीग्राम के एल-Glutathione को 1 एमएल के ddH2हे एक microtube में डालें ।
      3. CSM की ५० मिलीलीटर तैयार करने के लिए, गर्मी निष्क्रिय गोजातीय सीरम के 5 मिलीलीटर जोड़ें, ०.१ मिलीलीटर की 10 मिलीग्राम/एमएल इंसुलिन समाधान, 5 मिलीलीटर की २०० मिमी l-Glutamine समाधान, १२.५ μL की 20 मिलीग्राम/एमएल एल-Glutathione, और 1 एमएल के पेनिसिलिन-Streptomycin समाधान (५,००० इकाइयों के पेनिसिलिन और 5 मिलीग्राम की Streptomycin /mL) को Schneider के मीडिया के ३८.९ मि. ०.२२ mm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर निष्फल ।
      4. ddH2ओ के साथ 10x रुपये पतला करने के लिए 1x रुपये काम समाधान करना । प्रत्येक नमूने के लिए गैर-चिपकने वाले microtubes में 1x रुपये के ५०० μL तैयार करें ।
    3. एक पानी स्नान पर बारी और ३७ डिग्री सेल्सियस पर तापमान निर्धारित किया है । सुनिश्चित करें कि तापमान एक थर्मामीटर का उपयोग करके सही है । जल स्नान papain सक्रियण से पहले सही तापमान पर होना चाहिए । यह एक सुबह विच्छेदन से पहले शाम को तापमान निर्धारित करने की सिफारिश की है ।
  2. तैयार papain और proteolytic एंजाइम मिश्रण
    नोट: हर पृथक्करण से पहले papain समाधान ताजा कर दें ।
    1. 6 सप्ताह की मंगलवार को विच्छेदन शुरू करने से पहले ४५ मिनट के आसपास, 4 डिग्री सेल्सियस से papain पाउडर के 1 शीशी पुनः प्राप्त करने और कमरे के तापमान पर मशीन । इसके अलावा कमरे के तापमान पर एक Eppendorf ट्यूब में अलग CSM सेट करने के लिए बाद में papain पाउडर को जोड़ने के लिए ।
    2. विच्छेदन के शुरू करने से पहले एक सिरिंज papain की शीशी (सीधे टोपी के माध्यम से) के लिए कमरे के तापमान CSM जोड़ने के लिए इतना है कि एकाग्रता १०० इकाइयों/एमएल (प्रत्येक शीशी में पाउडर की मात्रा थोड़ा अलग है; एक शीशी १२३ इकाइयों युक्त के लिए १.२३ मीटर जोड़ L के CSM). मिश्रण करने के लिए, पहले किसी भी पाउडर टोपी के अंदर पर अटक कब्जा करने के लिए शीशी पलटना, और फिर ऊपर और नीचे पिपेट ।
    3. शीशी को एक चोंच में डालकर पानी में नहाने से ३७ डिग्री सेल्सियस पानी शामिल है. सुनिश्चित करें कि papain समाधान की शीशी तैर नहीं है । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए papain को सक्रिय करें ।
    4. पानी के स्नान में एक चोंच के लिए papain जोड़ने के बाद, proteolytic एंजाइम मिश्रण (26 वू/एमएल) से-20 डिग्री सेल्सियस के एक aliquot पुनः प्राप्त करने और कमरे के तापमान पर यह मशीन । सक्रियण के 30 मिनट के बाद, कमरे के तापमान पर papain की मशीन ।
  3. परिच्छेदों
    1. 6 सप्ताह के मंगलवार को, स्वच्छ संदंश के साथ ठंड CSM में मंचन pupal दिमाग काटना, और ऑप्टिक पालि और केंद्रीय मस्तिष्क के जंक्शन पर चुटकी द्वारा ऑप्टिक पालियों में कटौती ।
    2. (एक microtube के प्रायोगिक ऊतक के लिए और नकारात्मक नियंत्रण ऊतक के लिए एक) 1x रुपये के ५०० μL युक्त एक microtube के नीचे पालियों जोड़ें । हमेशा बर्फ पर ट्यूब रखें ।
    3. काटना के रूप में संभव के रूप में कई पालियों 1 ज । नकारात्मक नियंत्रण ऊतक के लिए, 10 पालियों पर्याप्त हैं । पूल एक एकल microtube में विच्छेदित ऑप्टिक पालियों microtubes के बीच स्थानांतरण के दौरान ऊतक नुकसान को खत्म करने के लिए ।
  4. सेल पृथक्करण
    1. ध्यान से एक P200 पिपेट का उपयोग कर, पर्याप्त छोड़ने पालियों को कवर करने के लिए विच्छेदित ऑप्टिक पालियों के साथ microtube से 1x रु निकालें । ध्यान से ट्यूब के साइड में 1x रुपये का ५०० μL जोड़ें, ताकि दिमाग को जितना कम हो सके परेशान करें । हमेशा बर्फ पर ट्यूब रखें ।
    2. पालियों को नीचे तक बसा दो । बस एक बार, ऊपर ले २०० μL और मिश्रण करने के लिए बाहर पिपेट (पालियों के चारों ओर बढ़ना चाहिए) । पालियों को फिर से व्यवस्थित करने दें ।
    3. दो नमूनों के लिए (प्रयोगात्मक और नकारात्मक नियंत्रण), एक microtube में सक्रिय कमरे के तापमान papain के ६०० μL aliquot. जोड़ें ४.२ μL कमरे के तापमान proteolytic एंजाइम मिश्रण में ६०० μL papain समाधान के लिए एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ०.१८ वू/एमएल । ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स । यह पृथक्करण समाधान है ।
    4. ध्यान से प्रत्येक नमूने से 1x रुपए निकालें और पालियों में पृथक्करण समाधान के ३०० μL जोड़ें । एक microtube thermomixer में 15 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, १,००० rpm पर नमूनों की मशीन ।
    5. 5 और 10 मिनट के समय बिंदुओं पर, thermomixer को रोकें और पालियों को microtube के नीचे से सिंक होने दें । समाधान के २०० μL ले लो और मिश्रण करने के लिए बाहर प्लास्टिक ।
    6. 15 मिनट के बाद, पालियों को नीचे की ओर व्यवस्थित करने दें और पालियों से पृथक्करण समाधान को सावधानीपूर्वक निकालें (पालियों को परेशान न करने की कोशिश करें) ।
    7. 1x रु के साथ दो बार धोएं । ऐसा करने के लिए, ध्यान से ५०० μL 1x रुपये जोड़ें (पालियों को परेशान करने की कोशिश न करें) । मिश्रण करने के लिए, धीरे प्लास्टिक ऊपर २०० μL, और फिर microtube में बाहर प्लास्टिक । पालियों को नीचे और दोहराने के लिए सिंक करने दें ।
    8. प्रत्येक नमूने को दो बार CSM के ५०० μL के साथ धोएं (पिछले चरण के समान) ।
    9. ध्यान से CSM निकालें और ट्यूब करने के लिए CSM के एक और २०० μL जोड़ें । एक P200 पिपेट का प्रयोग, फोम के बिना ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ऊतक को बाधित, जब तक समाधान समरूप है (यानी, अब ऊतक के किसी भी अवशेष देख सकते हैं) ।
    10. बर्फ पर एक 5 मिलीलीटर FACS ट्यूब में एक 30 माइक्रोन मेष टोपी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर (एक P200 का उपयोग करें और यकीन है कि पूरे निलंबन के माध्यम से चला जाता है बनाने के लिए) । पृथक्करण microtube कुल्ला करने के लिए CSM के एक और ५०० μL जोड़ें, और FACS ट्यूब में समाधान फ़िल्टर ।
    11. ध्यान से FACS ट्यूब की टोपी ले, एक P200 के साथ जाल फिल्टर के नीचे समाधान इकट्ठा करने और FACS ट्यूब में निलंबन के आराम करने के लिए इसे जोड़ने । नमूने FACS के लिए तैयार हैं ।
    12. हो FACS शुद्ध पहले से तैयार कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए microtubes है सुनिश्चित करें । आरएनए-seq के लिए, प्रत्येक नमूने से सीधे microtubes में RLT बफर (lysis बफर) के ३०० μL युक्त आरएनए शुद्धि किट (उपयोग करने से पहले 1:100 2-Mercaptoethanol जोड़ें) से क्रमबद्ध कोशिकाओं.
  5. FACS छँटाई
    नोट: पृथक्करण के बाद, तुरंत FACS (1 एच मैक्स) द्वारा कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें । प्रयोग के लिए योजना बनाते समय तदनुसार FACS सत्र बुक करना सुनिश्चित करें । १०० माइक्रोन नोजल आकार के साथ एक सेल सॉर्टर आम तौर पर प्रयोग किया जाता है ।
    1. ऋणात्मक नियंत्रण में कक्ष वितरण की तुलना करें और सॉर्टिंग के लिए गेटिंग सेट करने के लिए प्रायोगिक नमूना । आदर्श रूप में, पायलट FACS प्रयोग में गेटिंग की स्थापना, और नकारात्मक नियंत्रण नमूना पूर्व की स्थापना की गेटिंग की पुष्टि या ठीक ट्यूनिंग प्रदान करेगा । ब्याज की कोशिकाओं को अच्छी तरह से पृष्ठभूमि कोशिकाओं है कि नकारात्मक नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूना (चित्रा 4) (प्रायोगिक प्रयोगों में इस परीक्षण) में मौजूद है से अलग किया जाना चाहिए ।
    2. तैयार संग्रह ट्यूबों में क्रमबद्ध कोशिकाओं को इकट्ठा ।
  6. आरएनए शुद्धि
    1. RLT बफर के ३०० μL में सीधे कोशिकाओं छंटाई के बाद, प्लास्टिक ऊपर और नीचे कोशिकाओं लाइसे ।
    2. शुद्ध आरएनए शुद्धि किट का उपयोग पशु और मानव कोशिकाओं से कुल आरएनए के शुद्धिकरण के मानक प्रोटोकॉल के बाद ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ कॉलम डीएनए पाचन7. RNase के २० μL में आरएनए-मुक्त जल Elute.
    3. -८० ° c पर तरल नाइट्रोजन और स्टोर के साथ आरएनए नमूने फ्रीज ।
    4. प्रत्येक प्रयोग के लिए नियंत्रण और प्रायोगिक स्थितियों के लिए कम से कम 3 दोहराने की । एक ही समय में सभी नमूनों के लिए सीडीएनए पुस्तकालयों तैयार करने और तकनीकी परिवर्तनशीलता के लिए नियंत्रित करने के लिए एक ही प्रवाह सेल पर सभी नमूनों को चलाने. एक बार सभी आरएनए नमूने तैयार कर रहे हैं, एक गति vac का उपयोग करने के लिए मात्रा को कम करने के लिए 2 – 5 μL (प्रत्येक नमूना).

4. स्मार्ट-seq2 द्वारा सीडीएनए पुस्तकालयों और अनुक्रमण की तैयारी

नोट: तकनीकी परिवर्तनशीलता को ंयूनतम करने के लिए, एक ही समय में सभी सीडीएनए लायब्रेरीज़ बनाएं, और उंहें एक ही प्रवाह कक्ष पर अनुक्रम करें ।

  1. निम्नलिखित संशोधनों को छोड़कर स्मार्ट-seq217 के लिए मानक प्रोटोकॉल का पालन करके सीडीएनए पुस्तकालयों बनाने के लिए केंद्रित आरएनए के १.५ μL के एक इनपुट का उपयोग करें: पीसीआर के लिए एक अलग उच्च निष्ठा पीसीआर मास्टर मिक्स ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें वर्धन पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करने के लिए चुंबकीय मोतियों की बजाय एक ऑन-कॉलम पीसीआर शुद्धिकरण किट ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें ।
  2. स्मार्ट-seq2 प्रोटोकॉल रिवर्स प्रतिलेखन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से tagmentation के बाद एक अंतिम संवर्धन पीसीआर कदम के बाद एक पीसीआर पूर्व प्रवर्धन कदम भी शामिल है । पीसीआर प्रवर्धन में चक्र की संख्या इनपुट सामग्री की बहुतायत पर निर्भर करता है । इनपुट के रूप में १,००० कोशिकाओं के साथ, आम तौर पर अंतिम संवर्धन पीसीआर कदम के लिए पीसीआर पूर्व प्रवर्धन कदम और 12 चक्र में 15 चक्र का उपयोग करें ।
  3. पुस्तकालयों पूल और उंहें एक एकल प्रवाह सेल पर अनुक्रम (जैसे, NextSeq मंच) ।

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Representative Results

सामान्य योजना
प्रोटोकॉल की एक सामांय योजना चित्रा 1में दिखाया गया है । प्रोटोकॉल तीन प्रमुख भागों में विभाजित है: काम, नमूना तैयारी, अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण फ्लाई । प्रोटोकॉल का प्रयोग "सत्र से पहले योजना" सादगी के लिए सामांय योजना में शामिल नहीं है ।

समयरेखा
प्रोटोकॉल के प्रमुख भागों का एक कैलेंडर (मक्खी काम और नमूना तैयारी) चित्रा 2में दिखाया गया है ।

फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल-विशिष्ट लेबलिंग का सत्यापन
एक प्रतिनिधि प्रयोग में, l3 लेमिना monopolar न्यूरॉन्स (l3) फ्लोरोसेंट लेबल थे. L3 ंयूरॉन पांच मुताबिक़ लेमिना ंयूरॉंस में से एक है (L1-L5) कि मोटे तौर पर देखते photoreceptors R1-R6 से इनपुट प्राप्त करते है और उच्च केंद्र के लिए जानकारी रिले synapsing में न्यूरॉन्स मज्जा । एक MARCM प्रयोग में, सिंगल सेल L3 क्लोन mitotic पुनर्संयोजन और फ्लोरोसेंट दो मार्करों, myr-tdTOM (झिल्ली) और H2A-GFP (परमाणु) द्वारा लेबल द्वारा उत्पंन कर रहे हैं । क्रॉस में प्रयुक्त मक्खियों की पादी तालिका 1में दिखाई जाती हैं. सेल-विशिष्ट लेबलिंग को सत्यापित करने के लिए, वांछित जीनोटाइप के दिमाग उड़ना ब्याज के विकास के स्तर पर विच्छेदित किया गया (४० ज APF) । Immunostaining पहले dsRed और GFP ( चित्रा 3, रानी और हरे रंग) के खिलाफ विशेष एंटीबॉडी का उपयोग कर के रूप में प्रदर्शन किया था, साथ ही साथ एंटीबॉडी और लेमिना मज्जा (चित्रा 3, नीला) के लिए एक संदर्भ के रूप में 24B10 neuropils । फोकल माइक्रोस्कोपी की पुष्टि की है कि L3 केवल सेल प्रकार दोनों dsRed और GFP द्वारा लेबल ऑप्टिक पालि में है ।

FACS द्वारा कम बहुतायत कोशिकाओं का अलगाव
कोई प्रतिनिधि FACS सॉर्टिंग परिणाम आरेख 4में दिखाया गया है । १००,००० घटनाएँ दर्ज हुईं. सभी घटनाओं के २९.९% संभावित singlets हैं, और बाकी मलबे या समुच्चय हो सकता है । दोहरी और विभिंन आकारों के साथ कोशिकाओं को फिर दानेदार और आकार के आधार पर बाहर gated थे । शेष एकल कोशिकाओं से (FSC singlets, सभी घटनाओं का २७.३%), L3 न्यूरॉन्स P1 में एक तंग क्लस्टर (चित्रा 4, नमूना, रानी), जो अच्छी तरह से पृष्ठभूमि कोशिकाओं (चित्रा 4, नमूना, नीला) से अलग किया गया था के रूप में दिखाई दिया. P1 में कोशिकाओं का आकार एक समरूप सेलुलर जनसंख्या के अनुरूप समान था । विशेष रूप से, dsRed और GFP के मध्यवर्ती प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ P2 (चित्रा 4, नमूना, हरा) में कुछ कोशिकाओं P1 और पृष्ठभूमि में कोशिकाओं के तंग क्लस्टर के बीच वितरित किया गया । इन कक्षों की पहचान स्पष्ट नहीं थी । के बाद से P2 कोशिकाओं P1 कोशिकाओं से एक अलग आकार था, इन कोशिकाओं को गैर विशिष्ट होने की संभावना थी । गैर विशिष्ट कोशिकाओं से संभावित संदूषण से बचने के लिए, केवल P1 कोशिकाओं प्रयोग के लिए एकत्र किए गए थे । से १००,००० घटनाओं, ४५ P1 कोशिकाओं प्राप्त कर रहे हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल की एक सामान्य योजना. प्रोटोकॉल तीन भागों: फ्लाई काम, नमूना तैयारी, अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण के होते हैं । प्रत्येक भाग का अनुमानित संसाधन समय दर्शाया गया है । प्रत्येक भाग के प्रमुख कदम भी इसी बॉक्सिंग क्षेत्रों में दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: उड़ान भरने के काम और नमूना तैयारी के लिए समयरेखा । प्रोटोकॉल के बारे में 6 सप्ताह लगते हैं । प्रमुख चरणों के लिए समय कैलेंडर में दिखाया गया है । विच्छेदन, पृथक्करण और आरएनए शुद्धि FACS छंटाई के रूप में एक ही दिन में किया जाता है, और सादगी के लिए कैलेंडर में नहीं दिखाया गया है । तीन जैविक प्रतिकृति क्रमिक रूप से उसी के साथ एक ही सप्ताह में किया जाता है काटता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एक प्रतिनिधि फोकल माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट मार्करों द्वारा वांछित कोशिकाओं के चयनात्मक लेबल दिखा छवि । MARCM प्रयोगों में, एकल l3 लेमिना monopolar न्यूरॉन्स myr-tdTOM और H2A-GFP एक l3-विशिष्ट GAL4 ड्राइवर (9-9-GAL4)18का उपयोग कर व्यक्त करने के लिए किए गए थे । वांछित जीनोटाइप के फ्लाई दिमाग 40hr APF पर विच्छेदित किया गया और विरोधी dsRed, विरोधी GFP और 24B10 एंटीबॉडी के साथ दाग (लेमिना और मज्जा neuropils के लिए एक संदर्भ के रूप में) । फ्लोरोसेंट लेबलिंग फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया गया था । L3 न्यूरॉन्स लेमिना और परियोजना axons है कि मज्जा neuropil के भीतर समाप्त में पैदा होते हैं । प्रत्येक मस्तिष्क में, L3 न्यूरॉन्स के एक सबसेट दोनों फ्लोरोसेंट पत्रकारों व्यक्त की है, और इन ऑप्टिक मार्करों एक्सप्रेस में ही कोशिकाओं थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: FACS के जरिए सिंगल L3 लेमिना ंयूरॉन MARCM क्लोनों को शुद्ध करना: एक प्रतिनिधि FACS भूखंड । गेट्स (उदा. P1) कोशिका दानेदार, आकार, और प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर बनाए गए सजातीय एकल कोशिकाओं को अलग । L3 ंयूरॉंस myr-tdTOM और H2A-GFP के उच्च स्तर को व्यक्त P1 (रानी) में से एकत्र किए गए । मध्यवर्ती प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ कुछ कोशिकाओं P2 (हरा) में मनाया जाता है । ये P1 में L3 न्यूरॉन्स से आकार में भिन्न होते हैं, और गैर-विशिष्ट कक्षों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. ये एकत्र नहीं हुए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

जीनोटाइप स्रोत
w TubP-GAL80, FRT40, 27G05-FLP::P est/CyO, केआर-GAL4, यूएएस-GFP; 9-9-GAL4, यूएएस-myr:: tdTOM/TM6B पेंग एट अल., २०१८
w FRT40/CyO, केआर-GAL4, यूएएस-GFP; यूएएस-H2A-GFP/TM6B पेंग एट अल., २०१८

तालिका 1: पार में इस्तेमाल मक्खियों की पादी ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल सरल और तकनीकी रूप से लागू नहीं मुश्किल है, लेकिन वहां कई महत्वपूर्ण कदम है कि अगर अनदेखी सेलुलर उपज में काफी कमी का कारण होगा रहे हैं । (स्टेप 2.3.2.) यह महत्वपूर्ण है कि पार स्वस्थ हैं, और है कि खाना बाहर सूखी नहीं है । काटता है के नियमित रूप से पानी के विच्छेदन कि सही जीनोटाइप के है और विकास के सही स्तर पर है के लिए उपलब्ध मक्खियों की संख्या को अधिकतम करने के लिए आवश्यक है । कितनी बार पार करने की जरूरत है पानी का इस्तेमाल किया और मक्खियों के आवास की स्थिति के आधार पर भिंन होगा । यह सुनिश्चित करने के लिए पार सूखी नहीं है, शीशियों की जांच एक दिन में दो बार और तदनुसार पानी जोड़ें । (चरण ३.३.) यह भी एक microtube कि पृथक्करण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा में पूल विदारक दिमाग के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में प्रत्येक विच्छेदन अपने microtube का उपयोग करने का विरोध किया और फिर बाद में नमूने पूलिंग । यह किसी भी microtubes है, जो काफी हो सकता है के बीच स्थानांतरित करने से खो दिमाग को समाप्त होगा । (स्टेप 3.4.9.) जब pipetting ऊपर और नीचे मैंयुअल रूप से ऊतक को बाधित करने के लिए, यह ऐसा करने के लिए महत्वपूर्ण है जब तक ऊतक के कोई अवशेष निलंबन में आंख से दिखाई दे रहे हैं । अपूर्ण ऊतक व्यवधान एकल कोशिकाओं है कि FACS के माध्यम से हल किया जा सकता है की संख्या कम हो जाएगा, और इस तरह सेलुलर उपज में कमी ।

सेलुलर उपज की प्रमुख सीमा शुरू सामग्री है । इस संबंध में, विच्छेदन कई कारणों के लिए सीमित दर कर रहे हैं: (1) पृथक्करण प्रोटोकॉल ऑप्टिक पालियों की आवश्यकता को सिर से बाहर विच्छेदित और केंद्रीय मस्तिष्क से अलग है, (2) समय के विकास के दौरान सटीक समय-अंक में ऊतक प्राप्त करने के लिए विच्छेदों के लिए खिड़की सीमित किया जाना चाहिए, (3) अब समय-विच्छेदों और FACS के बीच की अवधि, अधिक से अधिक इष्टतम कोशिका स्वास्थ्य और गैर जीन अभिव्यक्ति और जीनोमिक संगठन पर विशिष्ट प्रभाव का मौका (यानी, छोटे विच्छेदन अवधि बेहतर है) । समय खर्च विदारक समय की ंयूनतम राशि में सामग्री की वांछित राशि प्राप्त करने के लिए संशोधित किया जाना चाहिए । समस्या निवारण के अधिकांश पायलट प्रयोगों में किया जाता है । यहां यह महत्वपूर्ण है: अनुकूलन आनुवंशिक चमक और विशिष्टता (चित्रा 3) के लिए लेबल, आकलन है कि ब्याज की कोशिकाओं की एक reproducible जनसंख्या स्पष्ट रूप से FACS भूखंडों (चित्रा 4) में पृष्ठभूमि कोशिकाओं से अलग हैं, का निर्धारण दिमाग की संख्या की जरूरत है कि बाद के अनुप्रयोगों के लिए सामग्री की एक पर्याप्त राशि प्राप्त करने के लिए विच्छेदित करने के लिए (चरण 1 देखें । काम उड़ना), और समय की ंयूनतम राशि का निर्धारण करने के लिए दिमाग की उचित संख्या काटना की जरूरत है ।

इस प्रोटोकॉल के प्रमुख अग्रिम यह है कि यह transcriptomic और जीनोमिक अनुप्रयोगों के लिए कम प्रचुर मात्रा में कोशिकाओं के कुशल अलगाव की अनुमति देता है, संवेदनशीलता में काफी सुधार हमारे पिछले6विधि पर । हमारे अनुमान के आधार पर, फ्लोरोसेंट लेबल आबादी ऑप्टिक पालि प्रति से कम १०० कोशिकाओं को शामिल कुशलतापूर्वक आरएनए-seq विश्लेषण के लिए अलग किया जा सकता है । यह अनुमति देता है transcriptomic और जीनोमिक विश्लेषण आनुवंशिक मोज़ेक प्रयोगों में लागू किया है, जिसमें विशेष प्रकार की कोशिकाओं के सबसेट आनुवंशिक रूप से एक अंयथा सामांय पृष्ठभूमि में हेरफेर कर रहे हैं । यह एक महत्वपूर्ण अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है, के रूप में इस तरह के प्रयोगों जटिल ऊतकों में सेल स्वायत्त और गैर स्वायत्त जीन कार्यों का निर्धारण करने के लिए आवश्यक हैं ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस शोध में पुरस्कार संख्या K01NS094545 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के NINDS, Neurodegenerative विकारों के अध्ययन के लिए Lefler केंद्र से andgrants को वित्त पोषित किया गया. हम मूल्यवान बातचीत के लिए चूने टैन और जेसन McEwan स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liberase TM Roche 5401127001 Proteolytic enzyme blend
NaCl Sigma-Aldrich S3014
KCl Sigma-Aldrich P9541
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich  S5761
Glucose Sigma-Aldrich G0350500
L-Glutathione Sigma-Aldrich G6013
Heat Inactivated Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135
Insulin Solution Sigma-Aldrich I0516
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513
Penicillin-Streptomycin Solution Sigma-Aldrich P4458
Schneider's Culture Medium Gibco 21720024
Papain Worthington LK003178
2-Mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA purification kit
RNase-free DNase Qiagen 79254
SuperScript II Reverse Transcriptase Life Technologies 18064-014
dNTP Mix Life Technologies R0191
MgCl2 Solution Sigma-Aldrich M1028-10X1ML
Betaine Solution Sigma-Aldrich B0300-1VL
RNaseOUT Life Technologies 10777-019
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix New England Biolabs M0492S
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004
Nextera XT DNA Library Prepration Kit Illumina FC-131-1024
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-1001
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap Falcon 352235
Bottle-Top Vacuum Filter Systems Corning CLS431153
ThermoMixer F1.5 Eppendorf 5384000020
FACSAria Flow Cytometer BD Biosciences 656700
HiSeq 2500 Sequencing System Illumina SY–401–2501

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References

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आनुवंशिकी अंक १३९ Drosophila दृश्य प्रणाली ऑप्टिक पालि न्यूरॉन्स सेल पृथक्करण FACS आरएनए-अनुक्रमण MARCM आनुवंशिक मोज़ेक कम बहुतायत
Drosophila दृश्य प्रणाली में कम प्रचुर मात्रा में कोशिकाओं का शुद्धिकरण
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Peng, J., Santiago, I. J., Pecot, M. … More

Peng, J., Santiago, I. J., Pecot, M. Y. Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System. J. Vis. Exp. (139), e58474, doi:10.3791/58474 (2018).

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