Summary
Her presenterer vi en celle dissosiasjon protokoll for effektivt å isolere celler på lav overflod i Drosophila visuelle systemet gjennom fluorescens aktivert celle sortering (FACS).
Abstract
Siste forbedringer i følsomheten av neste generasjons sekvensering lettet anvendelse av transcriptomic og genomisk analyser til lite antall celler. Bruk denne teknologien for å studere utviklingen i Drosophila visuelle systemet, som har et vell av celle type-spesifikk genetisk verktøy, gir en kraftig tilnærming for adressering molekylær grunnlaget for utvikling med presis mobilnettet oppløsning. For en slik tilnærming være gjennomførbart, er det avgjørende å ha kapasitet til å pålitelig og effektivt renser celler på lav overflod i hjernen. Her presenterer vi en metode som gir effektiv rensing av enkeltcelle kloner i genetisk mosaikk eksperimenter. Med denne protokollen oppnår vi konsekvent en høy mobilnettet avkastning etter rensing med fluorescens aktivert celle sortering (FACS) (~ 25% av alle merkede celler), og hell utføres transcriptomics analyser på enkeltcelle kloner generert gjennom mosaikk analyse med merketråd repressible celle (MARCM). Denne protokollen er ideelle for bruk transcriptomic og genomisk analyser på spesifikke celletyper i visuelle systemet, på ulike stadier av utvikling og i forbindelse med ulike genetisk manipulasjon.
Introduction
Det visuelle systemet Drosophila er en fremragende modell for å studere genetisk grunnlag av utvikling og atferd. Det består av en stereotype mobilnettet arkitektur1 og en avansert genetisk verktøykasse for å manipulere bestemt celle typer2,3. En stor styrke for dette systemet er muligheten til selvstendig forhøre gen funksjon i celletyper interesse med enkeltcelle oppløsning, bruker genetisk mosaikk metoder4,5. Vi søkt å kombinere disse genetiske verktøy med nylige fremskritt innen neste generasjons sekvensering å utføre celle type-spesifikk transcriptomic og genomisk analyser i enkelt celle kloner genetisk mosaikk eksperimenter.
Dette er det viktig å utvikle en robust og effektiv metode for å isolere selektivt lav rikelig celle populasjoner i hjernen. Tidligere har utviklet vi en protokoll for å isolere spesifikke celletyper i visuelle systemet under pupal utvikling gjennom FACS, og bestemme deres transcriptomes ved hjelp av RNA-seq6. I disse eksperimentene, ble det store flertallet av celler av en bestemt type (f.eks R7 fotoreseptorer) fluorescently merket. Benytter denne metoden, genetisk mosaikk eksperimenter, der bare et delsett av celler av samme type er merket, kunne vi isolere nok celler for å få kvalitet sekvensering data. For å løse dette, søkt vi å øke cellulære avkastningen ved å forbedre celle dissosiasjon protokollen.
Vår tilnærming var å redusere den totale lengden av protokollen for å maksimere helse dissosiert celler, forbedre cellulære helse ved å endre disseksjon og dissosiasjon buffere og redusere mekanisk avbrudd til dissekert vev. Vi testet forbedret protokollen7 bruker mosaikk analyse med en repressible celle markør5 (MARCM), som tillater generering av fluorescently merket kloner av bestemt celletyper, vill type eller mutant for et genet av interesse i en ellers heterozygote fly. Der, under like, våre tidligere protokollen kunne generere nok materiale til RNA-seq, var forbedret protokollen vellykket. Vi reproduserbar oppnå en høy mobilnettet avkastning (~ 25% merket celleområde) og hente høykvalitets RNA-seq data fra så lite som 1000 celler7.
Flere protokoller har vært beskrevet tidligere for å isolere bestemte celletyper i Drosophila6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. disse protokollene er hovedsakelig ment for å isolere celler som er rikelig i hjernen. Våre protokollen er optimalisert for å isolere lav rikelig celle populasjoner (færre enn 100 celler per hjernen) i visuelle systemet bruker FACS for etterfølgende transcriptomic og genomisk analyser. Med denne protokollen, som mål å tilby å isolere reproduserbar lav rikelig celler fra fly visuelle systemet av FACS og få høykvalitets transcriptome data av RNA-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. planlegging før eksperimentet
-
Før du starter eksperimentet, kan du utføre en småskala pilotprosjekt for å bekrefte hvis genetikk fungerer som forventet spesielt merke ønsket cellene.
- Som første omgang, bruk immunohistochemistry og * lys å avgjøre om er uønskede celler merket. Ideelt sett blir genetiske markører bestemt i netthinnen og optikk lobe (Figur 3). Bare optikk lobes brukes for cellen dissosiasjon og så merking i sentrale hjernen er ikke et problem. Samtidig, kan du bestemme hvor mange celler av interesse er merket per hjernen.
- Hvis de genetiske etikett(er) har ønsket spesifisitet, utføre en FACS pilotprosjekt (Figur 4) til å fastslå om en ren populasjon av celler kan isoleres reproduserbar og også å vurdere hvor mange celler rundt kan isoleres fra hver hjernen. Eventuelt vurdere renheten av isolerte celler gjennom kvantitative PCR å bestemme anriking eller de berikelse av bestemte gener.
-
Bestemme antall krysser nødvendig for å oppnå den ønskede mengden av materiale for eksperimentet.
Merk: Basert på eksperimentell erfaring, ~ 17 – 25% av fluorescently merket celler er konsekvent isolert med denne protokollen, og høy kvalitet RNA-sekvensering data hentes fra så lite som 1000 FACS renset celler (færre celler kan være tilstrekkelig).- For å få 1000 celler for RNA-seq analyser, kontroller at det er minst 40 cellene rundt fluorescently merket per hjernen (20 celler per optikk lobe). Rundt ~ 10 celler av interesse bør renses per hjernen, så dissekere 100 hjerner.
- For å få ~ 100 fluer på riktig utviklingstrinn å dissekere i hvert eksperiment, krysser bruk ~ 100 hvis du velger mot balancers (dette vil variere avhengig av genotyper av foreldrene). Hvis fluer homozygous for den alleler/effekter av transgener rundt færre krysser kan angis.
- Begrense vinduet disseksjon til 1 h å maksimere mobilnettet helse og minimere uspesifisert endringer genuttrykk og genom organisasjon som kan oppstå etter at hjernen er dissekert, men dette kan justeres. Bestemme antall dissectors nødvendig å dissekere 100 hjerner i 1 h, som er avhenger av dyktighet av dissectors.
2. fly arbeid
Merk: Fluer er hevet ved 25 ° C med ~ 50% fuktighet ikke annet er oppgitt. Under genotype kvinner er angitt som Genotype F, og at menn Genotype m.
-
Utvide aksjer
- Få ~ 100 ampuller av unge fluer (ikke mer enn en uke gammel med Genotype F) og ~ 30 ampuller av Genotype M.
- På torsdag i uke 1, Vend 100 ampuller av Genotype F på fersk mat. Starter på fredag, Vend hetteglass hver dag tirsdag av Uke2. Disse 6 flips brukes til å samle jomfruer. Også onsdag uke 2, snu fluer Genotype m på fersk mat og rydde foreldrene fredag av Uke2. Disse ampuller brukes til å samle menn kors.
-
Samle jomfruer
- Fra mandag i uke 3, samle jomfruer fra Genotype F hetteglass. Samle 2 - 3 ganger om dagen og lagre jomfruer ved 18 ° C med ~ 50% fuktighet. Gjenta dette hver dag tirsdag av uke 4. Det anbefales å samle så mange jomfruer som mulig, siden mange av dem dø før Kors er satt. Vanligvis krysser ~ 2500 jomfruer skal samles for å angi 100.
-
Angi kors
- Angi ønsket antall kors (vanligvis 100-200 krysser per forsøk) med 15 jomfruer Genotype f og 7 menn av Genotype M hver korset fredag av uke 4. Det er svært viktig å bruke unge og friske menn med intakt vinger.
- Vend kors hver dag fra søndag til lørdag i uke 5. Supplere kors med fersk jomfruer eller menn hvis død fluer. Det er viktig å hindre maten tørker, så vann hetteglass etter behov. Tørr mat vil vesentlig redusere avkastningen.
-
Negativ kontroll FACS sortering
- Inkludere en negativ kontroll uten ønsket cellene blir merket for FACS sorteringen. Kontrollen negative bør ideelt sett ha reporteren (f.eks UAS-GFP) men ikke driveren (f.eks GAL4) slik at basale uttrykk for reporteren (UAS-konstruksjoner kan være "lekk") kan bestemmes du angir passende gating for FACS sorteringen. Snur fluene for negative kontrollen samtidig med de eksperimentelle fluene og iscenesette dem på samme måte.
-
Iscenesettelse pupae
- Samle celler på et bestemt tidspunkt pupal utvikling (f.eks 40 h etter blodsugende formasjon [h APF]) scenen tildelt pupae i 1t tidsvindu å matche med 1t perioden for disseksjoner (beskrevet ovenfor). FACS skal utføres rett etter celle dissosiasjon, som oppstår etter disseksjoner og tar ~ 40 min. Dermed bestemmes nøyaktige tidspunktet for regi og disseksjoner av FACS tilgjengelighet.
- For å få pupae på 40 h APF, scenen på mandag i uke 6 på et bestemt tidspunkt (f.eks 5 pm) å dissekere pupae 40 h senere (f.eks 9 am onsdag). Bruk en våt pensel til å forsiktig plukke hvit pre pupae og plassere dem på veggen i forvarmes hetteglass. Bare plukke pupae med ønsket genotype.
-
Biologiske gjentak
- Gjøre minst 3 biologiske gjentak for hvert eksperiment. Som en enkel måte, kan du gjenta eksperimentet tre ganger i samme uke (uke 6) bruker samme kors. For eksempel scenen pupae for de andre og tredje gjentak tirsdag og onsdag, henholdsvis. Dissekere disse pupae torsdag og fredag, henholdsvis.
3. eksempel forberedelse
Merk: Alle reagenser som brukes i denne protokollen er oppført i Tabellen for materiale.
- Utarbeide løsninger for disseksjoner og vev dissosiasjon
- Forberede proteolytisk enzym blanding lager løsningen (se Tabell for materiale) av gjenoppbygge lyofilisert enzymet med ddH2O til en konsentrasjon av 26 Wünsch enheter (Wu) / mL. Legge til 10 mL av ddH2O ampullen ampuller som inneholder 260 Wu (store medisinglass), og gjøre engangs dele (4,2 µL kreves per dissosiasjon). Lagre lagerløsning på 20 ° C. Hvert eksperiment krever av to prøvene (negativ kontroll og eksperimentelle vev).
- Forberede 10 x han Deltoks løsning (RS) og fullstendig Schneider's Media (CSM) dagen før dissection (mandag i uke 6). Forberede 5 mL CSM for hver dissector, og ca 5 mL 1 x RS og 5 mL CSM for av 2 eksempler (negativ kontroll og eksperimentelle). Lagre 10 x RS ved 4 ° C i opptil en måned og CSM ved 4 ° C i opptil en uke.
- For å forberede 100 mL 10 x RS, løses 8 g NaCl, 200 mg KCl, 50 mg NaH2PO4, 1 g NaHCO3 og 1 g av glukose i 100 mL ddH2O i en 250 mL kanne. Filteret sterilisere med filtere 0.22 mm.
- Legge til 20 mg av L-Glutathione 1 mL av ddH2O i en microtube.
- For å forberede 50 mL av CSM, legge til 5 mL av varme inaktivert bovin serum, 0.1 mL 10 mg/mL insulin løsning, 5 mL av 200 mM L-glutamin løsning, 12.5 μL 20 mg/mL L-Glutathione og 1 mL av Penicillin-Streptomycin løsning (5000 enheter av penicillin og 5 mg streptomycin / mL) til 38.9 mL av Schneider's media. Filteret sterilisere med filtere 0.22 mm.
- Fortynne 10 x RS med ddH2O for å gjøre 1 x RS fungerende løsning. Klargjør 500 μL 1 x RS i ikke-klebende microtubes for hvert utvalg.
- Slå på et vannbad og satt temperaturen på 37 ° C. Kontroller temperaturen er nøyaktig ved hjelp av et termometer. Vannbad må være riktig temperatur før papain aktivering. Det anbefales å sette temperaturen kvelden før en morgen disseksjon.
- Forberede papain og proteolytisk enzym blanding
Merk: Gjør papain løsning frisk før hver dissosiasjon.- Tirsdag i uken 6 rundt 45 min før disseksjoner, hente 1 hetteglass med papain pulver fra 4 ° C og ruge ved romtemperatur. Også satt av CSM i en Eppendorf rør ved romtemperatur senere legge til papain pulver.
- min før starten av disseksjoner bruker en sprøyte legge til romtemperatur CSM ampullen av papain (direkte gjennom cap) slik at konsentrasjonen er 100 enheter/mL (pulver i hvert hetteglass er litt annerledes, ampuller med 123 enheter legge 1,23 m L av CSM). For å blande, først Inverter ampullen å fange noen pulver fast på innsiden av lokket og deretter Pipetter opp og ned.
- Legge til ampullen et beger som inneholder 37 ° C vann i vannbad. Kontroller at ampullen papain løsning ikke er flytende. Aktivere papain i 30 min på 37 ° C.
- Etter tilføyer papain til et beger i vannbad, hente en aliquot av proteolytisk enzym blanding (26 Wu/mL) fra 20 ° C og ruge det ved romtemperatur. Etter 30 min av aktivisering, ruge papain ved romtemperatur.
- Dissections
- På tirsdag i uken 6, dissekere trinnvis pupal hjernen i kalde CSM med ren tang og avskåret optikk lobes av knipe i krysset av optikk flik og sentrale hjernen.
- Legg lobes til bunnen av en microtube som inneholder 500 μL 1 x RS (en microtube for eksperimentell vev) og en negativ kontroll vevet. Alltid holde rørene på is.
- Dissekere så mange fliker som mulig i 1 time. Negativ kontroll vevet er 10 lobes nok. Bassenget dissekert optikk fliker i et enkelt microtube å eliminere vev tap under overføring mellom microtubes.
- Cellen dissosiasjon
- Nøye fjerne 1 x RS fra microtube med dissekert optikk lobes bruker en P200 pipette, forlater nok til å dekke lobes. Forsiktig legge 500 μL 1 x RS ved siden av røret, å forstyrre hjernen som mulig. Alltid holde røret på is.
- La lobes bosette til bunnen. Bare en gang, ta opp 200 μL og Pipetter ut for å blande (lobes bør gå). La lobes bosette seg igjen.
- For to prøver (eksperimentell og negative kontroll) aktiveres aliquot 600 μL romtemperatur papain i en microtube. Tilsett 4,2 μL av romtemperatur proteolytisk enzym blanding i 600 μL papain løsning å få en endelig konsentrasjon av 0,18 Wu/mL. Bland ved pipettering opp og ned. Dette er den dissosiasjon.
- Nøye fjerne 1 x RS fra hver prøve og tilsett 300 μL av dissosiasjon løsning lobes. Inkuber prøvene ved 25 ° C, 1000 rpm i 15 min i en microtube thermomixer.
- På 5 og 10 min tid points, kan du stoppe thermomixer og la lobes synke å bunnen av microtube. Ta opptil 200 μL av løsning og Pipetter ut blande.
- Etter 15 minutter, la lobes bosette til bunnen og fjern forsiktig dissosiasjon løsningen fra lobes (prøv ikke å forstyrre lobes).
- Vask to ganger med 1 x RS. Dette nøye legge til 500 μL 1 x RS (prøv ikke å forstyrre lobes). Blanding, forsiktig Pipetter opp 200 μL og deretter Pipetter ut i microtube. La lobes synke å bunnen og gjenta.
- Vask hver prøve to ganger med 500 μL CSM (samme som forrige trinn).
- Nøye fjerne CSM og legger en annen 200 μL av CSM til røret. Bruke en P200 pipette, forstyrre vev av pipettering opp og ned uten skummende, til løsningen er homogene (dvs. kan ikke lenger se rester av vev).
- Filtrere celle suspensjon gjennom en 30 μm mesh cap i en 5 mL FACS rør på is (bruk en P200 og sørge for hele suspensjon går). Legge til en annen 500 μL CSM skylle dissosiasjon microtube og filtrere løsningen i FACS røret.
- Forsiktig ta av hetten av FACS rør, samle løsningen under maske filter med en P200 og legge den til resten av suspensjon i FACS røret. Prøvene er klar for FACS.
- Sørg for å ha microtubes for innsamling FACS renset celler klare på forhånd. For RNA-seq, sortere celler fra hver prøve direkte til microtubes med 300 μL RLT buffer (lyseringsbuffer) i RNA rensing Kit (Legg til 1: 100 2-Mercaptoethanol før bruk).
- FACS sortering
Merk: Etter dissosiasjon, umiddelbart sortere cellene av FACS (1 h max). Kontroller til boken FACS økter tilsvarende når du planlegger for eksperimentet. Cellen sortering med 100 μm munnstykke størrelse brukes vanligvis.- Sammenligne celle distribusjonen i kontrollen negative og eksperimentelle prøven definere gating for sorteringen. Ideelt sett oppretter gating i piloten FACS eksperimentet, og negativ kontroll prøven vil gi bekreftelse eller finjustering av pre-etablert gating. Cellene rundt burde være frisk adskilt fra bakgrunnen celler som finnes i både kontrollen negative og eksperimentelle prøven (Figur 4) (teste dette i piloten eksperimenter).
- Samle sorterte cellene i forberedt samling rør.
- RNA rensing
- Etter sortering cellene direkte til 300 μL RLT buffer, Pipetter opp og ned til lyse cellene.
- Rense RNA etter standard protokoll for rensing av Total RNA fra dyr og menneskelige celler ved hjelp av rensing kit (se Tabell for materiale) med-kolonne DNA fordøyelsen7. Elute RNA i 20 μL RNase-fritt vann.
- Fryse RNA prøvene med flytende nitrogen og butikk på-80 ° C.
- Utfør minst 3 gjentak for kontroll og eksperimentelle forhold for hvert eksperiment. Forberede cDNA bibliotekene for alle prøver samtidig og kjøre alle prøvene på samme flyt celle å kontrollere for teknisk variasjon. Når alle RNA prøvene er forberedt, kan du bruke en hastighet vac for å redusere volumet til 2-5 μL (hvert utvalg).
4. forberede cDNA biblioteker og ved Smart-seq2
Merk: For å minimere tekniske variasjon, gjør alle cDNA bibliotekene samtidig, og ordner dem på samme flyt celle.
- Bruke en inngang på 1,5 μL av konsentrert for å gjøre cDNA biblioteker etter standardprotokollen for Smart-seq217 unntatt følgende endringer: Bruk en annen Hi-Fi PCR original mix (se Tabell for materiale) for PCR forsterkning; Bruk en på-kolonne PCR rensing kit (se Tabell for materiale) i stedet for magnetiske perler å rense PCR produkter.
- Smart-seq2 protokollen inneholder et PCR pre forsterkning skritt etter omvendt transkripsjon samt et siste berikelse PCR skritt etter tagmentation. Antall sykluser i PCR forsterkning avhenger av input. Med 1000 celler som inndata, vanligvis bruke 15 sykluser i PCR pre forsterkning trinn og 12 sykluser for siste berikelse PCR trinn.
- Basseng bibliotekene og ordner dem på en enkelt flyt celle (f.eks NextSeq plattformen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generelle ordningen
En generell ordning av protokollen er vist i figur 1. Protokollen er delt inn i tre store deler: fly arbeid, prøve forberedelse, sekvensering og dataanalyse. "Planlegging før eksperimentet" økten av protokollen er ikke inkludert i den generelle ordningen for enkelhet.
Tidslinje
En kalender for størstedelen av protokollen (Fly arbeid og prøve forberedelse) er vist i figur 2.
Kontrollerer celle-spesifikke merking av AC confocal mikroskopi
I et representativt eksperiment, ble L3 lamina monopolar neurons (L3) fluorescently merket. L3 Nevron er en av fem homologe lamina neurons (L1-L5) som mottar signaler fra de bredt innstilt fotoreseptorer R1-R6 og videresende informasjonen til høy midten av synapsing til målet nerveceller i margen. I et MARCM eksperiment, er enkeltcelle L3 kloner generert av mitotisk rekombinasjon og fluorescently merket av to markører, myr-tdTOM (membran) og H2A-GFP (kjernefysisk). Genotyper fluer i kors er vist i tabell 1. For å bekrefte celle-spesifikke merking, ble fly hjerner av ønsket genotype dissekert på det utviklingen scenen av interesse (40 h APF). Immunostaining ble utført som beskrevet tidligere7 bruker antistoffer spesifikke mot dsRed og GFP (Figur 3, magenta og grønn), samt 24B10 antistoffer som referanse for lamina og forlengede neuropils (Figur 3blå). AC confocal mikroskopi bekreftet at L3 er cellen merket av både dsRed og GFP i optikk flik.
Isolering av lav-overflod celler av FACS
En representant FACS sortering resultatet er vist i Figur 4. 100.000 hendelser ble registrert. 29,9% av alle hendelser er potensielle singleter, og resten kan være rusk eller aggregat. Doublets og celler med forskjellige størrelser ble deretter gated basert på detaljnivå og størrelse. Fra de gjenværende enkeltceller (FSC singleter, 27,3% av alle hendelser), L3 neurons dukket opp som en tett klynge i P1 (Figur 4, prøven, magenta), som var frisk adskilt fra bakgrunnen cellene (Figur 4, prøven, blå). Størrelsen på cellene i P1 var forenlig med en homogen mobilnettet befolkning. Spesielt ble noen celler i P2 (Figur 4, prøven, grønn) med middels fluorescens intensiteten av dsRed og GFP delt mellom stramt klyngen av celler i P1 og bakgrunnen. Identiteten til disse cellene var ikke klar. Siden P2 cellene hadde en annen størrelse enn P1 cellene, var disse cellene sannsynlig å være ikke-spesifikk. For å unngå potensielle forurensning fra uspesifisert cellene, ble bare P1 celler samlet for eksperimentet. Fra 100.000 hendelser, er 45 P1 celler oppnådd.
Figur 1: en generelle ordningen med protokollen. Protokollen består av tre deler: fly arbeid, prøve forberedelse, sekvensering og dataanalyse. Omtrentlig behandlingstiden for hver del er angitt. Hovedtrinn for hver del vises også i de tilsvarende boksene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: tidslinje for fly arbeid og prøve forberedelser. Protokollen tar ca 6 uker. Tidspunktet for de viktigste trinnene vises i kalenderen. Disseksjon, dissosiasjon RNA rensing i samme dag som FACS sortering og vises ikke i kalenderen for enkelhet. Tre biologiske gjentak utføres sekvensielt i samme uke med samme kors. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: et representativt AC confocal mikroskopi bilde som viser selektiv merkingen av ønsket celler ved fluorescerende. MARCM eksperimenter, ble enkelt L3 lamina monopolar neurons gjort å uttrykke myr-tdTOM og H2A-GFP bruker en L3-spesifikke GAL4 driveren (9-9-GAL4)18. Fly hjerner av ønsket genotype dissekert på 40hr APF og farget med anti-dsRed, anti-GFP og 24B10 antistoffer (som referanse for lamina og forlengede neuropils). Fluorescerende merking ble vurdert av AC confocal mikroskopi. L3 neurons er født i lamina og prosjekt axons som avslutte i marg-neuropil. Et delsett av L3 neurons uttrykt både fluorescerende journalister hver hjernen, og disse var de eneste cellene i optikk flik uttrykke markører. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: rense enkelt L3 lamina Nevron MARCM kloner via FACS: en representant FACS tomt. Porter (f.eks P1) ble opprettet basert på celle detaljnivå, størrelse og fluorescens intensitet isolere homogen enkeltceller. L3 neurons uttrykke tilsvarende høye nivåer av myr-tdTOM og H2A-GFP ble samlet fra i P1 (magenta). Noen celler med middels fluorescens intensitet er observert i P2 (grønn). Dette er forskjellige i størrelse L3 nerveceller i P1 og kan representere uspesifisert celler. Disse er ikke samlet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Genotype | Kilde |
| w; TubP-GAL80, FRT40, 27G 05-FLP::PEST/CyO, Kr-GAL4, UAS-GFP; 9-9-GAL4, UAS-myr::tdTOM/TM6B | Peng et al., 2018 |
| w; FRT40/CyO, Kr-GAL4, UAS-GFP; UAS-H2A-GFP/TM6B | Peng et al., 2018 |
Tabell 1: Genotyper fluer i kors.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen er enkel og ikke teknisk vanskelig å gjennomføre, men det er flere viktige trinn som hvis oversett vil føre til en betydelig reduksjon i mobilnettet avkastning. (Trinn 2.3.2.) Det er avgjørende at kors er sunn, og at maten ikke tørke. Vanlig vanning av kors er viktig å maksimere antall fluer tilgjengelig for disseksjon som høyre genotype og riktig utviklingstrinn. Hvor ofte krysser måtte bli vannet varierer maten brukes og boforhold Fluenes. For å sikre krysser ikke tørke ut, undersøke hetteglass to ganger om dagen og tilsett vann tilsvarende. (Trinn 3.3.) Det er også viktig å samle dissekert hjernen i en enkelt microtube som skal brukes for dissosiasjon, i motsetning til å ha hver dissector bruker sin egen microtube og deretter senere pooling prøvene. Dette vil eliminere hjerne mistet overføre mellom microtubes, som kan være betydelig. (Trinn 3.4.9.) Når pipettering opp og ned for å manuelt forstyrre vev, er det viktig å gjøre det til ingen rester av vev vises av øyet i suspensjon. Ufullstendig vev avbrudd vil redusere antall enkeltceller som kan sorteres via FACS, og dermed reduserer mobilnettet avkastning.
Stor begrensning av mobilnettet avkastning starter materiale. I denne forbindelse disseksjoner er rate begrense for flere grunner: (1) dissosiasjon-protokollen krever optikk lobes dissekert ut av hodet og atskilt fra sentrale hjernen, (2) å få vev på nøyaktig tidspunkt under utvikling tid vinduet for disseksjoner må være begrenset, (3) jo lenger-perioden mellom disseksjoner og FACS, jo større sjanse for suboptimal celle helse og ikke-spesifikke effekter på genekspresjon og genomic organisasjon (dvs. jo kortere dissection perioden bedre). Tidsbruk dissekere bør endres for å få den ønskede mengden av materiale i minimalt med tid. De fleste av feilsøking utføres i piloten eksperimenter. Her er det avgjørende å: optimalisere genetisk merking for lysstyrke og spesifisitet (Figur 3), vurdere om cellene rundt reproduserbar innbyggere er tydelig segregerte fra bakgrunnen celler FACS tomter (Figur 4), finne den antallet Hjerner som må være dissekert for å få en tilstrekkelig mengde materiale for senere utligninger (se trinn 1. Fly arbeid), og finne minimal mengde tid måtte dissekere det aktuelle antallet Hjerner.
Store forkant av denne protokollen er at det tillater effektiv isolasjon av lav rikelig celler for transcriptomic og genomisk programmer, bedre følsomhet betydelig våre tidligere metode6. Basert på våre estimations, kan fluorescently merket populasjoner med færre enn 100 celler per optikk lobe isoleres effektivt for RNA-seq analyser. Dette gir transcriptomic og genomisk analyser som skal brukes i genetisk mosaikk eksperimenter, hvor delsett av celler av spesielle typer genetisk manipulert i en ellers normal bakgrunn. Dette representerer en kritisk forhånd eksperimenter er slik avgjørende for å bestemme cellen autonome og ikke autonome genet funksjoner i komplekse vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av NINDS av National Institutes of Health prisen nummer K01NS094545, andgrants fra Lefler senter for studier av nevrodegenerative lidelser. Vi erkjenner kalking Tan og Jason McEwan for verdifulle samtaler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
