Summary
Burada, verimli bir şekilde hücreleri mevcut Drosophila görsel sistemi aktif floresans hücreye (FACS) sıralama içinde düşük bereket, izole bir hücre ayrılma protokol mevcut.
Abstract
Sonraki nesil sıralama son ilerleme duyarlılık içinde az sayıda hücre transcriptomic ve genomik analizler uygulamaya kolaylaştırdı. Kullanmak bu teknoloji geliştirme hücre türüne özgü genetik araçları zenginliği sahip, Drosophila görsel sistemde, eğitim için güçlü bir yaklaşım geliştirme ile kesin hücresel kararlılık moleküler temeli adresleme için sağlar. Uygulanabilir böyle bir yaklaşım için güvenilir ve verimli bir şekilde mevcut düşük bolluk içinde beyin hücreleri arındırmak için kapasitesine sahip önemlidir. Burada, verimli arıtma tek hücre klonlar genetik mozaik deneylerde sağlayan bir yöntem mevcut. Floresans kullanarak arıtma (FACS) (~ %25 tüm etiketli hücreleri) sıralama hücre aktif ve transcriptomics analizler aracılığıyla oluşturulan tek hücre klonlar başarıyla gerçekleştirilen sonra bu iletişim kuralı ile sürekli yüksek hücresel verim elde ettik Mozaik analizi ile bir repressible Hücre işaretçisi (MARCM). Bu iletişim kuralı, transcriptomic ve genomik analizleri belirli hücre tipleri için visual sisteminde farklı aşamalarında gelişme ve farklı genetik manipülasyon bağlamında genelinde uygulamak için idealdir.
Introduction
Drosophila görsel sistem geliştirme ve davranış genetik temeli çalışmak için olağanüstü bir modeldir. Kalıplaşmış hücresel mimarisi1 ve belirli hücre türleri2,3değiştirmek için gelişmiş bir genetik toolkit oluşmaktadır. Bu sistemin büyük bir güç özerk hücre tipleri ile tek hücre kararlılık, genetik mozaik yöntemleri4,5kullanarak ilgi işlevinde gen sorguya çekmek için yeteneğidir. Hücre türüne özgü transcriptomic gerçekleştirmek için sonraki nesil sıralama son gelişmeler ile bu genetik araçlarını birleştirmek aranan ve tek hücredeki genomik analizleri klonlar genetik mozaik deneyler.
Bunu yapmak için seçime bağlı olarak beyindeki düşük bol hücre popülasyonlarının yalıtmak için sağlam ve verimli bir yöntem geliştirmek için önemlidir. Daha önce biz FACS aracılığıyla pupa geliştirme sırasında visual sisteminde belirli hücre tipleri yalıtma ve RNA-seq6kullanarak kendi transcriptomes belirlemek için bir iletişim kuralı geliştirilmiştir. Bu deneylerde hücreleri (Örneğin R7 photoreceptors) belirli bir türdeki büyük çoğunluğu fluorescently etiketli. Neyin yalnızca bir alt kümesini aynı türden hücreleri etiketlenir, genetik mozaik deneylerde bu yöntemle kaliteli sıralama verileri elde etmek için yeterince hücre izole etmek başarısız oldu. Bu sorunu çözmek için hücre ayrılma Protokolü geliştirerek hücresel verim artışı istedi.
Yaklaşımımız Disosiye hücrelerin sağlığını en üst düzeye çıkarmak, diseksiyon ve ayrılma arabellekleri değiştirerek hücresel sağlığı geliştirmek için protokol toplam uzunluğu azaltmak ve mekanik bozulma disseke doku miktarını azaltmak için yapıldı. Biz fluorescently klonlar vahşi yazın veya mutant gen ilgi için belirli hücre tiplerinin, etiketli tek nesil sağlayan bir repressible Hücre işaretçisi ile5 (MARCM), mozaik analizi kullanılarak geliştirilmiş protokol7 test bir Aksi takdirde Heterozigoz sinek. Nerede aynı koşullar altında bizim önceki Protokolü RNA-seq için yeterli malzeme oluşturulamadı, geliştirilmiş protokolü başarılı olmuştur. Tekrarlanarak yüksek hücresel verim (~ % 25 etiketli hücre) elde etmek ve kaliteli RNA-seq verileri kadar az 1.000 hücrelerin7' den elde.
Bir dizi protokolü daha önce belirli hücre tipleri Drosophila6,8,9,10,11,12,13 ' te yalıtmak için tarif var , 14 , 15 , 16. bu protokol çoğunlukla beyin içinde bol olan hücreler yalıtmak için tasarlanmıştır. Bizim iletişim kuralı FACS sonraki transcriptomic ve genomik analizleri için kullanarak görsel sisteminde düşük bol hücre popülasyonlarının (100'den az beyin hücreleri) yalıtmak için optimize edilmiştir. Bu iletişim kuralı ile biz tekrarlanarak düşük bol hücreler FACS ve RNA-seq. tarafından yüksek kaliteli transcriptome veri alma tarafından sinek görsel sisteminden yalıtmak için bir yol sağlamak amacı
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. önce deneme planlama
-
Deneme başlamadan önce genetik özellikle istediğiniz hücreleri etiketlemek için beklendiği gibi çalışır onaylamak için küçük ölçekli bir pilot deney gerçekleştirmek.
- İstenmeyen hücrelerin bir ilk geçişinde, kullanımı immünhistokimya ve olup olmadığını belirlemek için ışık mikroskobu olarak etiketlenir. İdeal olarak, genetik işaretler retina ve optik lob (Şekil 3) içinde geçerli olur. Sadece optik loblar hücre ayrılma için kullanılır ve çok merkezi beyinde etiketleme bir sorun değil. Aynı zamanda, ilgi kaç hücre beyin etiketlenir belirlemek.
- Genetik etiketi saf Vaha'da hücre olup olmadığını belirlemek için pilot bir FACS deneyi (Şekil 4) gerçekleştirmek istenen özgüllüğü varsa tekrarlanarak ayrılmış olabilir ve aynı zamanda ilgi kaç hücre değerlendirmek için her beyninden izole olabilir. Gerekirse, zenginleştirme belirlemek için kantitatif PCR ile izole hücreleri saflığı veya belirli genlerin de-zenginleştirme değerlendirmek.
-
Haçlar malzeme deney için istenilen miktarda almak için gerekli sayısını belirleyin.
Not: deneysel deneyime dayalı, ~ 17-%25 fluorescently etiketli hücre bu iletişim kuralı ile tutarlı bir şekilde izole edilmiştir ve kaliteli RNA-sıralama veri (daha az hücreleri yeterli olabilir) 1.000 saf FACS hücreler olarak az elde edilir.- RNA-seq analizleri için 1.000 hücreleri elde etmek için en az 40 hücreleri fluorescently beyin (optik lob başına 20 hücreleri) başına etiketli ilgi olduğundan emin olun. Yaklaşık ~ 10 faiz hücrelerinin beyin saf yani 100 beynini incelemek.
- ~ 100 sinekler her deneyde teşrih gelişiminin uygun aşamada elde etmek için (bu veliler genotip bağlı olarak değişir) dengeleyici karşı seçilirken ~ 100 haçlar kullanın. Sinekler faiz allelleri/transgenes için homozigoz varsa daha az haçlar ayarlayabilirsiniz.
- Hücresel sağlık en üst düzeye çıkarmak ve gen ekspresyonu ve sonra beyin disseke, ama bu-ebilmek var olmak ayarlamak oluşabilir genom organizasyonu non-spesifik değişiklikleri en aza indirmek için 1 h diseksiyon penceresine sınırlayın. Dissectors dissectors yeteneklerinize bağlıdır 1 h 100 beyinlerinde incelemek için gereken sayısını belirleyin.
2. iş fly
Not: Sinekler 25 ° c ~ %50 nem ile aksi belirtilmediği sürece neden oldu. Kadın genotip genotip F ve bu erkeklerin gibi genotip M belirtilir.
-
Genişleyen hisse senetleri
- ~ 100 şişeleri genç uçar (hiçbir daha fazla bir hafta genotip F ile eski) ve genotip m ~ 30 şişeleri elde edilir.
- Hafta 1 Perşembe günü, genotip F 100 şişeleri taze gıda üzerine çevirmek. Cuma günü başlayan, tüpleri her hafta 2, Salı günü çevir. Bu 6 döndürür bakireler toplamak için kullanılır. Ayrıca hafta 2 Çarşamba günü genotip M sinekler taze gıda üzerine çevirmek ve veliler hafta 2 Cuma günü temizleyin. Bu tüpleri erkekler haçlar için toplamak için kullanılır.
-
Bakireler toplama
- Pazartesi hafta 3, bakireler genotip F tüpleri toplamak. Günde 2 - 3 kez toplar ve 18 ° c ~ %50 nem ile bakireleri saklarız. Bu hafta 4, Salı her gün tekrarlayın. Onları bir sürü ölmek beri mümkün olduğunca çok sayıda bakireler toplamak için önerilir haçlar ayarlamadan önce. Genellikle, ~ 2500 bakireler 100 ayarlamak için toplanmalıdır haçlar.
-
Haçlar ayarlama
- Hafta 4 Cuma günü, genotip f 15 bakireler istenen sayılarla haçlar (genelde 100-200 haçlar deneme başına) ve genotip M 7 erkekler her çapraz için ayarlayın. Genç ve sağlıklı erkek olduğu gibi kanatları ile kullanılması çok önemlidir.
- Haçlar flip Pazar hafta 5 Cumartesi'ye her gün. Ölü sinekler bulunursa haçlar taze bakireler ya da erkekler ile ek. Gıda kurumasını önlemek, böylece şişeleri gerektiği gibi su esastır. Kuru gıda önemli ölçüde verim azalır.
-
FACS sıralama için negatif kontrol
- Bir negatif kontrol etiketli olmak istediğiniz hücreleri ekleyin FACS sıralama için. İdeal olarak, böylece bazal ifade (UAS yapıları "sızan" olabilir) muhabiri FACS sıralamak için çoğunluğuna uygun ayarlamak için belirlenen negatif kontrol muhabir (Örneğin UAS GFP) ancak değil sürücü (Örneğin GAL4), olmalıdır. Deneysel sinekler ile aynı zamanda negatif kontrol için sinekler çevirmek ve onları aynı şekilde sahne.
-
Evreleme pupa
- Pupa geliştirme (Örneğin 40 h puparium oluşumu [h APF] sonra), sahne belirli bir aşamada hücreleri toplamak için 1 saat süre ile eşleştirmek için bir 1s zaman penceresi içinde Pupa (yukarıda açıklanmıştır) gruptakiler için ayrılmış. FACS diseksiyonlarının sonra oluşur ve ~ 40 dakika sürer doğrudan hücre ayrılma sonra yapılmalıdır. Böylece, evreleme ve diseksiyonu tam zamanında FACS durumu tarafından belirlenir.
- Pupa 40 h APF elde etmek için belirli bir zaman noktasında hafta 6 Pazartesi günü sahne (Örneğin, 5 pm) pupa 40 h daha sonra incelemek için (Örneğin, 9 am Çarşamba günü). Yavaşça beyaz ön pupa almak ve önceden ısıtılmış şişe içinde duvarda yer onları ıslak bir fırça kullanın. Yalnızca istenen genotip ile pupa seç.
-
Biyolojik çoğaltır
- Her deneme için en az 3 biyolojik çoğaltır yapmak. Basit bir yolu olarak aynı haçlar kullanarak deney aynı hafta (hafta 6) içinde üç kez tekrarlayın. Örneğin, sırasıyla pupa için Salı ve Çarşamba, ikinci ve üçüncü çoğaltır aşama. Bu pupa Perşembe ve Cuma günü sırasıyla incelemek.
3. numune hazırlama
Not: Bu protokol için kullanılan reaktifler Malzemeler tablolistelenir.
- Gruptakiler ve doku ayrılma için çözümler hazırlamak
- Proteolitik enzim karışımı hisse senedi çözüm hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) GKD2O 26 Wünsch birimlerinin (Wu) konsantrasyonu ile lyophilized enzim başlamaktan tarafından / mL. 260 Wu (büyük şişe) içeren bir flakon GKD2O 10 mL şişe için ekleyin ve tek kullanımlık aliquots (4.2 µL ayrılma gerekli) olun. Hisse senedi çözüm-20 ° C'de depolayın Her deney iki örnek (negatif kontrol ve deneysel doku) ayrılma gerektirir.
- 10 x Rinaldini'nın çözüm (RS) ve tam Schneider'ın medya (CSM) diseksiyon (Pazartesi hafta 6) önceki gün hazırlayın. CSM 5 mL için her tetkik ve yaklaşık 5 mL 1 x RS ve CSM 5 mL ayrılma 2 örnekleri için hazırlamak (negatif kontrol ve deneysel). Bir ay kadar için 4 ° C'de 10 x RS ve CSM 4 ° C'de için bir hafta kadar saklayın.
- 10 x RS 100 mL hazırlamak için NaCl, KCl, NaH2PO4, 1 g NaHCO3 ve 1 g glikoz GKD2O bir 250 mL ölçek 100 ml 50 mg 200 mg 8 g geçiyoruz. Filtre sterilize 0.22 mm filtre ile.
- L-glutatyon 20 mg 1 mL GKD2O'bir microtube ekleyin.
- 5 mL ısı de inaktive Sığır serum, 0.1 mL 10 mg/mL insülin çözeltisi, 5 mL 200 mM L-glutamin çözüm de, 12,5 μL 20 mg/ml L-glutatyon ve 1 mL penisilin-streptomisin çözeltisi (5.000 adet penisilin ve streptomisin 5 mg 50 mL CSM hazırlamak için Ekle / mL) Schneider'ın medya 38.9 ml. Filtre sterilize 0.22 mm filtre ile.
- 1 x RS çalışma çözüm yapmak için 10 x RS GKD2O ile sulandırmak. Yapışkan olmayan mikrotüpler 1 x RS 500 μL her örnek için hazırlayın.
- Bir su banyosu açın ve sıcaklığı 37 ° C'de ayarlayın Sıcaklık termometre kullanarak doğru olduğundan emin olun. Su banyosu papain etkinleştirme öncesinde doğru sıcaklıkta olması gerekir. Bu akşam önce bir sabah diseksiyon sıcaklığı ayarlamak için tavsiye edilir.
- Hazırlamak papain ve proteolitik enzim karışımı
Not: papain çözüm her ayrılma önce taze olun.- Gruptakiler başlamadan önce Salı günü hafta 6 yaklaşık 45 dakika, papain tozu 1 şişe 4 ° C almak ve oda sıcaklığında kuluçkaya. Ayrıca CSM Eppendorf tüp papain toz daha sonra eklemek için oda sıcaklığında bir kenara.
- Min diseksiyonlarının başlangıcı öncesinde konsantrasyonu 100 adet/mL olması (cap) aracılığıyla doğrudan papain şişe oda sıcaklığında CSM eklemek için bir şırınga kullanın (her şişe içinde toz miktarı biraz farklıdır; için bir şişe içeren 123 adet 1.23 m ekleyin. L CSM). Karıştırmak için ilk şişe kapağı içeriden sıkışmış herhangi bir toz yakalamak için ters çevir'i ve sonra yukarı ve aşağı pipet.
- Şişe su banyosu içinde 37 ° C su içeren bir ölçek ekleyin. Emin olun papain çözüm şişe yüzen değil. 37 ° C'de 30 dk papain etkinleştirmek
- Bir ölçek su banyosunda için papain ekledikten sonra bir aliquot (26 Wu/mL) proteolitik enzim karışımı-20 ° C almak ve oda sıcaklığında kuluçkaya. Etkinleştirme 30 dk sonra oda sıcaklığında papain kuluçkaya.
- Diseksiyonlar
- Hafta 6 Salı günü soğuk CSM aşamalı pupa beyinlerinde temiz forseps ile incelemek ve optik lob ve merkezi beyin kavşağında pinching tarafından optik loblar kesti.
- 1 x RS (deneysel doku için bir microtube) ve bir negatif kontrol doku için 500 μL içeren bir microtube altına loblar ekleyin. Her zaman buz üzerine boruları tutun.
- 1 h mümkün olduğu kadar çok loblar incelemek. Negatif kontrol doku için 10 loblar yeterlidir. Havuzu doku kaybı mikrotüpler arasında aktarım sırasında ortadan kaldırmak için tek bir microtube içine optik loblar kesmiştim.
- Hücre ayrılma
- Dikkatli bir şekilde 1 x RS microtube disseke optik loblar örtecek kadar bırakarak bir P200 pipet kullanarak lob ile çıkarın. Dikkatle 1 x RS 500 μL beyin mümkün olduğunca az rahatsız böylece Tüp, tarafına ekleyin. Her zaman tüp buz üzerinde tutun.
- Altına yerleşmek loblar izin. Sadece bir kez, 200 μL al ve dışarı karıştırmak için pipet (loblar hareket etmeliyiz). Tekrar yerleşmek loblar izin.
- (Deneysel ve negatif kontrol) iki örnek için aliquot 600 μL bir microtube oda sıcaklığında papain aktif. Oda sıcaklığında proteolitik enzim karışımı 4.2 μL 0,18 Wu/mL nihai bir konsantrasyon elde etmek için 600 μL papain çözüm ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. Ayrılma çözüm bu.
- Dikkatle her örnek 1 x RS kaldırın ve ayrılma çözüm 300 μL loblar için ekleyin. 25 ° c, 15 dakika içinde microtube thermomixer 1000 devir/dakika örnekleri kuluçkaya.
- 5 ila 10 dk zaman noktalarda, thermomixer ve microtube altına loblar lavabo izin durdurmak. Çözüm ve damlalıklı dışarı 200 μL karıştırmak için kaplar.
- 15 dk sonra dikkatli bir şekilde ayrılma çözüm loblar (loblar bozmamaya çalışın) çıkarın ve altına yerleşmek loblar izin.
- İki kez 1 x RS ile yıkayın. Bunu yapmak için dikkatli bir şekilde 500 μL 1 eklemek x RS (loblar bozmamaya çalışın). Mix, yavaşça damlalıklı 200 μL yukarı ve dışarı microtube içine sonra damlalıklı için. Loblar altına lavabo ve tekrar izin.
- Her örnek 500 μL CSM (önceki adımı aynı) ile iki kez yıkayın.
- Dikkatle CSM kaldırın ve tüp CSM başka bir 200 μL ekleyin. P200 pipet kullanarak çözüm homojen olana yukarı ve aşağı köpük olmadan, pipetting tarafından bozabilir dokunun (Yani, artık herhangi bir doku kalıntıları görebilirsiniz).
- Buz üzerinde 5 mL FACS tüp içine hücre süspansiyon 30 mikron mesh cap aracılığıyla filtre (bir P200 kullanın ve tüm süspansiyon goes-den geçerek dikkat edin). CSM ayrılma microtube durulama için başka bir 500 μL ekleyin ve çözüm FACS tüp içine filtre.
- Dikkatle FACS tüp kapağını, çözüm gözenekli filtre ile bir P200 altında toplamak ve geri kalanına FACS tüp süspansiyon ekleyin. Örnekleri FACS için hazırsınız demektir.
- Saf FACS hücrelerin hazır önceden toplamak için mikrotüpler var emin olun. RNA-seq için her örnek hücrelerden içine doğrudan mikrotüpler RLT arabelleği (lizis arabellek) RNA arıtma Takımı'ndan 300 μL içeren sıralamak (1: 100 2-Mercaptoethanol kullanmadan önce ekleyin).
- FACS sıralama
Not: ayrılma sonra hemen FACS (1 h max) tarafından hücreleri sıralamak. Kitap FACS oturumları için buna göre deneme için planlama yaparken emin olun. Bir hücre sıralayıcısı 100 mikron meme büyüklüğü ile genellikle kullanılır.- Negatif kontrol ve sıralama için geçişi yukarı ayarlamak için deneysel örnek hücre dağıtım karşılaştırın. İdeal olarak, pilot FACS deneyde geçişi kurmak ve negatif kontrol örnek onay veya önceden kurulmuş geçişi ince ayar sağlar. Faiz hücrelerinin de negatif kontrol ve deneysel örnek (Şekil 4) mevcut arka plan hücrelerden ayrılmalıdır (pilot deneylerde sınav bu).
- Hazırlanan koleksiyon tüpler sıralanmış hücrelerde toplamak.
- RNA arıtma
- Hücreleri RLT arabellek, yukarı ve aşağı hücreleri parçalayıcı damlalıklı 300 μL doğrudan sıraladıktan sonra.
- Hayvan ve insan arıtma kullanarak hücreleri arıtma toplam RNA'ın standart protokol sonrası RNA arındırmak ( Tablo malzemelerigörmek) sütun üzerine DNA sindirim7ile kit. RNA 20 μL RNase free suyun içinde elute.
- RNA örnekleri ile sıvı azot ve mağaza-80 ° C'de dondurmak
- Her deneme için kontrol ve deneysel koşullar için en az 3 çoğaltır gerçekleştirin. CDNA kütüphaneler tüm örnekleri için aynı anda hazırlamak ve tüm örnekleri için teknik değişkenlik denetlemek için aynı akışı hücrede çalıştırın. Tüm RNA örnekleri hazırlanır sonra hız vac 2 – 5 μL (her örnek) sesi azaltmak için kullanabilirsiniz.
4. hazırlama cDNA kütüphaneler ve akıllı-seq2 göre sıralama
Not: teknik değişkenlik en aza indirmek için tüm cDNA kitaplıkları aksaklıklar ve aynı akışı cepten sıralayın.
- CDNA kitaplıkları için akıllı-seq217 aşağıdaki değişiklikler dışında standart iletişim kuralı takip ederek yapmak için konsantre RNA'ın 1.5 μL bir giriş kullanın: farklı bir yüksek-sadakat PCR master mix ( Tablo malzemelerigörmek) için PCR kullanımı amplifikasyon; bir sütun üzerinde PCR arıtma kullanın (bkz. Tablo reçetesi) yerine manyetik boncuklar PCR ürünleri arındırmak için kit.
- Akıllı-seq2 iletişim kuralı bir PCR öncesi amplifikasyon adım tagmentation sonra son zenginleştirme PCR adım yanı sıra ters transkripsiyon sonra içerir. PCR güçlendirme döngülerle giriş malzeme zenginliği üzerinde bağlıdır. Giriş olarak 1.000 hücreleri ile genellikle son zenginleştirme PCR adım için PCR öncesi amplifikasyon adım 15 döngüleri ve 12 döngüleri kullanın.
- Kütüphaneler havuz ve bir tek akış cep telefonundan (Örneğin, NextSeq platformu) sıralayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genel düzeni
İletişim kuralının genel bir düzeni Şekil 1' de gösterilen. Protokol üç ana bölüme ayrılmıştır: sinek iş, numune hazırlama, sıralama ve veri analizi. "Deneme önce planlama" oturum Protokolü'nün basitlik için genel düzeni dahil değil.
Zaman çizelgesi
Protokol (sinek iş ve numune hazırlama) ana kısımları takvimini Şekil 2' de gösterilmiştir.
Tarafından confocal mikroskobu hücre özel etiketleme doğrulama
Temsil edici bir deneyde, L3 lamina monopolar nöronlar (L3) fluorescently etiketli. L3 nöron girdi genel olarak ayarlanmış photoreceptors R1-R6 almak ve hedef nöronlarda medulla synapsing tarafından yüksek merkezine bilgi iletmeniz beş homolog lamina nöronlar (L1-L5) biridir. Bir MARCM deneyi, tek hücre L3 klonlar mitotik rekombinasyon tarafından oluşturulan ve fluorescently iki işaretleri, en düşük myr-tdTOM (membran) ve H2A GFP tarafından (nükleer) etiketli. Çarpılar içinde kullanılan sinekler genotip Tablo 1' de gösterilmiştir. Hücre özel etiketleme doğrulamak için istenen genotip sinek beyinlerinin faiz (40 h APF) gelişim aşamasında disseke. Immunostaining yukarıda açıklanan7 antikorlar dsRed ve GFP (Şekil 3, kırmızı ve yeşil) karşı özel yanı 24B10 antikor lamina ve medulla neuropils (Şekil 3, mavi) için bir referans olarak kullanarak olarak gerçekleştirildi. Confocal mikroskobu L3 hem dsRed hem de GFP tarafından optik lobunda etiketli tek hücre tipi olduğunu doğruladı.
Yalıtım FACS tarafından düşük-bereket hücrelerinin
Sonuç sıralama bir temsilcisi FACS Şekil 4' te gösterilmiştir. 100.000 olaylar kaydedildi. 29,9 tüm olayları yüzde potansiyel gömlek, ve geri kalan enkaz veya toplamları olabilir. Birini ve farklı boyutlarda hücrelerle sonra temel alınarak parçalı yapı ve boyutu kapı. Kalan tek hücrelerden (FSC gömlek, tüm olayları yüzde 27,3), L3 nöronlar P1 sıkı bir kümede olarak ortaya çıktı (Şekil 4, numune, magenta), hangi iyi arka plan hücrelerden (Şekil 4, numune, mavi) ayrılmış. P1 hücrelerde boyutunu benzer homojen bir hücresel nüfus ile tutarlı. Özellikle, P2 (4 rakam, numune, yeşil) bir kaç hücrelerde dsRed ve GFP ara floresan yoğunluğu ile P1 hücrelerinin sıkı küme ile arka plan arasında dağıtıldı. Bu hücreler kimliğinin belli değildi. P2 hücreleri daha P1 hücre farklı bir boyutta olmadığından, bu hücreler belirsiz olabilir edildi. Spesifik olmayan hücrelerden potansiyel kirlenmesini önlemek için yalnızca P1 hücreleri denemenin toplanmıştır. 100.000 olaylardan 45 P1 hücreleri elde edilir.
Şekil 1: genel düzeni Protokolü'nün. Protokol üç bölümden oluşmaktadır: sinek iş, numune hazırlama, sıralama ve veri analizi. Her bölümü yaklaşık işlem süresi belirtilir. Her bölümü önemli adımlar karşılık gelen kutulu bölgelerde de gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: zaman çizelgesi için sinek iş ve numune hazırlama. Protokol yaklaşık 6 hafta sürer. Zamanlama büyük adımlar için takvimde gösterilir. Diseksiyon, ayrışma ve RNA arıtma FACS sıralama olarak aynı gün içinde yapılır ve basitlik için takvimde gösterilmez. Üç biyolojik çoğaltır sırayla aynı haç ile aynı hafta içinde yapılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: seçici etiketlerine göre gösterilen bir temsilcisi confocal mikroskobu görüntüsü istenilen hücreleri tarafından floresan işaretleri. MARCM deneylerde tek L3 lamina monopolar nöronlar myr-tdTOM ve H2A GFP L3 özgü GAL4 sürücü (9-9-GAL4)18kullanarak ifade etmek için yapılmıştır. Uçmak istediğiniz genotip beyinlerinin 40 hr APF disseke ve (lamina ve medulla neuropils için bir başvuru) olarak anti-dsRed, anti-GFP ve 24B10 antikorlar ile lekeli. Floresan etiketleme confocal mikroskobu tarafından değerlendirildi. L3 nöronlar medulla neuropil içinde sonlandırmak lamina ve proje aksonlar doğarlar. Her beyin her iki floresan gazetecilere L3 nöronların alt kümesini ifade ve bu tek hücreleri optik lob veri işaretleyicilerini ifade edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: MARCM klonlar FACS tek L3 lamina nöron arındırıcı: bir temsilcisi FACS arsa. Gates (Örneğin P1) homojen tek hücreleri izole etmek için hücre taneciklik, boyutu ve floresan yoğunluğu üzerinde temel alınarak oluşturulmuştur. En düşük myr-tdTOM ve H2A GFP benzer şekilde yüksek düzeyde ifade L3 nöronlar P1 (macenta) toplanmıştır. Orta floresan yoğunluğu ile birkaç hücre içinde P2 (yeşil) gözlenir. Bunlar boyutunda P1 nöronlarda L3 ve daha farklıdır, non-spesifik hücreleri temsil edebilir. Bunlar toplanan değil. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Genotip | Kaynak |
| w; TubP-GAL80, FRT40, 27G 05-FLP::PEST/CyO, Kr-GAL4, UAS-GFP; 9-9-GAL4, UAS-myr::tdTOM/TM6B | Peng vd., 2018 |
| w; FRT40/CyO, Kr-GAL4, UAS-GFP; UAS-H2A-GFP/TM6B | Peng vd., 2018 |
Tablo 1: Genotip çarpılar içinde kullanılan uçar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı basit ve yürütmek Teknik olarak zor değil, ama orada birkaç anahtar adımlar bu gözden eğer hücresel verim içinde önemli ölçüde azalmasına neden. (Adım 2.3.2.) Bu haçlar sağlıklı ve gıda kurumasına da önemlidir. Düzenli sulama haçlar doğru genotip ve doğru geliştirme aşamasında olan sinekler diseksiyon için kullanılabilir sayısını en üst düzeye çıkarmak için gerekli olduğunu. Ne sıklıkta haçlar sulanması gerek kullanılan gıda ve barınma koşulları "Sineklerin Tanrısı" bağlı olarak değişir. Haçlar kurumasına yok emin olmak için günde iki kez tüpleri incelemek ve buna göre su ekleyin. (Adım 3.3.) Kendi microtube kullanmak her tetkik olması ve daha sonra örnekleri havuzu oluşturma ayrışma için kullanılacak tek bir microtube içine disseke beyin havuzu önemlidir. Bu önemli olabilir mikrotüpler arasında aktarma kayıp beynin ortadan kaldırır. (Adım 3.4.9.) Yukarı ve aşağı doku el ile bozmaya pipetting doku yok kalıntıları göz süspansiyon tarafından görünür hale gelene kadar bunu yapmak için önemlidir. Eksik doku bozulması FACS yolu ile sıralanabilir ve böylece azaltmak hücresel verim tek hücre sayısını azaltacaktır.
Hücresel verim büyük sınırlandırılması malzeme başlıyor. Bu bağlamda, çeşitli nedenlerden dolayı hız sınırı diseksiyonlarının vardır: (1 ayrılma Protokolü optik loblar başını dışarı disseke ve merkezi beyin (2) doku noktalarda kesin zaman-geliştirme sırasında elde etmek için ayrılmış gerekir zaman gruptakiler için pencere limited, (3) uzun-dönem diseksiyonu ve FACS, arasında büyük olasılığını suboptimal hücre sağlık ve gen ekspresyonu ve Genomik organizasyon (Yani, kısa diseksiyon belirsiz etkileri olmalıdır dönem daha iyi). Harcanan süre anatomi malzeme istenilen miktarda zaman en az miktarda elde etmek için değiştirilmesi gerekir. Sorun giderme çoğu pilot deneylerde gerçekleştirilir. Burada için önemlidir: parlaklık ve özgüllük (Şekil 3), değerlendirmek için genetik etiketleme optimize tekrarlanabilir Vaha'da hücre ilgi açıkça ayrılmış olup olmadığını FACS parsellerde (Şekil 4) arka plan hücrelerden, belirlemek (bkz: adım 1. izleyen uygulamalar için malzeme yeterli miktarda elde etmek için disseke gerekir beyin sayısı Sinek iş) ve beyin uygun sayıda incelemek için gereken en az süreyi belirler.
Bu protokol büyük ilerleme verimli yalıtım transcriptomic ve duyarlılık önemli ölçüde üzerinde bizim önceki Yöntem6iyileştirilmesi genomik uygulamalar için düşük bol hücrelerinin sağlanmıştır. Bizim tahminler üzerinde bağlı olarak, optik lob başına 100'den az hücre oluşan fluorescently etiketli nüfus RNA-seq analizleri için verimli bir şekilde ayrılmış olabilir. Bu transcriptomic ve genomik analizleri genetik mozaik deneylerde, neyin alt kümeleri belirli türdeki hücrelerin genetik olarak Aksi takdirde normal bir arka planda işlenir uygulanmasına olanak sağlar. Bu kritik bir avans temsil eder, bu nedenle deneyler hücre özerk ve özerk gen fonksiyonları karmaşık dokularda belirlemek için gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası K01NS094545, nörodejeneratif hastalıklar çalışma Lefler Merkezi'nden andgrants altında NINDS tarafından finanse edildi. Değerli görüşmeleri için Liming Tan ve Jason McEwan kabul edersiniz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
