Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تنقية الخلايا منخفض وفيرة في النظام المرئي المورفولوجية

Published: September 26, 2018 doi: 10.3791/58474
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurobiology, Harvard Medical School

Summary

نقدم هنا، بروتوكول تفكك خلية لكفاءة عزل الخلايا الحالية في وفرة منخفضة داخل منظومة المورفولوجية البصرية من خلال الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية).

Abstract

وسهلت التحسينات الأخيرة في الحساسية من تسلسل الجيل القادم تطبيق ترانسكريبتوميك والتحاليل الجينية لإعداد صغيرة من الخلايا. استخدام هذه التكنولوجيا لدراسة التنمية في النظام المرئي المورفولوجية، التي تفخر بثروة أدوات الوراثية الخاصة بنوع الخلية، ويوفر نهج قوية لمعالجة الأساس الجزيئي للتنمية مع القرار الخلوية الدقيقة. لهذا نهج أن يكون مجديا، من الأهمية بمكان لديها القدرة على موثوقية وكفاءة تنقية الخلايا الحالية في وفرة منخفضة داخل المخ. نقدم هنا، طريقة تسمح بتنقية فعالة من استنساخ خلية مفردة في التجارب الوراثية الفسيفساء. مع أحكام هذا البروتوكول، نحن دائماً تحقيق عالية غلة خلوية بعد تنقية الأسفار باستخدام تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) (~ 25% من كافة الخلايا المسماة)، وإجراء تحليلات ترانسكريبتوميكس بنجاح في استنساخ خلية واحدة فقط التي تم إنشاؤها من خلال تحليل فسيفساء مع علامة خلية ريبريسيبلي (ماركم). هذا البروتوكول مثالي لتطبيق ترانسكريبتوميك والتحاليل الجينية لأنواع محددة من الخلايا في النظام المرئي، عبر مراحل مختلفة من التنمية، وفي سياق مختلف التلاعبات الجينية.

Introduction

النظام المرئي المورفولوجية نموذج معلقة لدراسة الأساس الجيني للتنمية والسلوك. وتضم بنية خلوية نمطية1 ومجموعة أدوات وراثية متقدمة للتلاعب في خلية معينة أنواع2،3. نقاط قوة رئيسية لهذا النظام هو القدرة على استجواب استقلالية وظيفة الجينات في الخلية أنواع المصالح مع القرار خلية مفردة، باستخدام أساليب فسيفساء الوراثية4،5. وسعينا إلى الجمع بين هذه الأدوات الوراثية مع التقدم الذي أحرز مؤخرا في تسلسل الجيل القادم لتنفيذ ترانسكريبتوميك الخاصة بنوع الخلية واستنساخ تحليل الجينوم في خلية واحدة فقط في التجارب الوراثية الفسيفساء.

ولتحقيق ذلك، من الضروري لتطوير طريقة قوية وفعالة لعزل السكان منخفضة خلية وفيرة في الدماغ بشكل انتقائي. سابقا، قمنا بتطوير بروتوكول لعزل أنواع الخلايا المحددة في النظام المرئي أثناء تطوير الخوادر من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية، وتحديد ترانسكريبتوميس استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي6. في هذه التجارب، كانت الغالبية العظمى من خلايا نوع معين (مثل photoreceptors R7) المسمى فلوريسسينتلي. باستخدام هذا الأسلوب، في التجارب الوراثية الفسيفساء، حيث تتم تسمية مجموعة فرعية فقط من الخلايا من نفس النوع، فشلنا في عزل خلايا كافية للحصول على جودة تسلسل البيانات. ولمعالجة ذلك، سعينا إلى زيادة غلة الخلوية بتحسين البروتوكول تفكك خلية.

وكان نهجنا تقليل الطول الإجمالي للبروتوكول لتحقيق أقصى قدر من صحة الخلايا معزولة، وتحسين الصحة الخلوية بتغيير المخازن المؤقتة للتشريح، وتفكك، وتقليل مقدار اختلال ميكانيكية لتشريح الأنسجة. نحن اختبار بروتوكول تحسين7 باستخدام تحليل فسيفساء مع خلية ريبريسيبلي ماركر5 (ماركم)، الذي يسمح لجيل واحد فلوريسسينتلي المسمى استنساخ أنواع خلية معينة، نوع البرية أو المسخ لجينات للفائدة في إلا يطير متخالف. حيث، في ظروف مماثلة، فشلت لدينا بروتوكول سابق لتوليد ما يكفي من المواد لتسلسل الحمض النووي الريبي، بروتوكول تحسين كان ناجحاً. نحن تكاثر تحقيق عائد خلوية عالية (~ 25% خلايا المسماة)، والحصول على بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي عالية الجودة من 1,000 قدر ضئيل الخلايا7.

وقد وصفت سابقا عددا من البروتوكولات لعزل أنواع خلية معينة في المورفولوجية6،،من89،10،11،،من1213 , 14 , 15 , 16-هذه البروتوكولات معظمها مخصصة لعزل الخلايا التي وفيرة داخل المخ. لدينا بروتوكول هو الأمثل لعزل السكان خلية وفيرة منخفضة (أقل من 100 خلية كل الدماغ) في النظام البصري باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية ترانسكريبتوميك اللاحقة والتحليلات الجينية. مع أحكام هذا البروتوكول، ونحن نهدف إلى توفير وسيلة لعزل تكاثر الخلايا وفرة منخفضة من النظام المرئي يطير بنظام مراقبة الأصول الميدانية، والحصول على بيانات عالية الجودة الترنسكربيتوم بالجيش الملكي النيبالي-ما يليها

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-التخطيط قبل التجربة

  1. قبل البدء التجربة، إجراء تجربة رائدة صغيرة الحجم لتأكيد إذا علم الوراثة تعمل كما هو متوقع إلى تسمية الخلايا المطلوب على وجه التحديد.
    1. تمرير أول واستخدام إيمونوهيستوتشيميستري والخفيفة الميكروسكوب تحديد ما إذا كان يتم تسمية الخلايا غير المرغوب فيها. ومن الناحية المثالية، سوف تكون البصمات الجينية المحددة داخل الشبكية والفص البصري (الشكل 3). وتستخدم فقط للبصريات الفصوص تفكك خلية وحتى وضع العلامات في الدماغ المركزي ليست قضية. في نفس الوقت، تحديد كم عدد الخلايا ذات الاهتمام هي المسماة في الدماغ.
    2. إذا كان label(s) الوراثية خصوصية المنشودة، تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية تجربة رائدة تحديد ما إذا كان عدد السكان نقية من الخلايا (الشكل 4) يمكن تكاثر معزولة، وأيضا لتقدير كم عدد الخلايا من الفائدة يمكن أن تكون معزولة من كل الدماغ. إذا لزم الأمر، تقييم نقاء الخلايا المعزولة عن طريق PCR الكمي لتحديد تخصيب أو تخصيب دي من جينات محددة.
  2. تحديد عدد الصلبان اللازمة للحصول على المبلغ المطلوب من المواد للتجربة.
    ملاحظة: استناداً إلى الخبرة التجريبية، ~ 17 – 25% خلايا المسماة فلوريسسينتلي معزولة دائماً مع هذا البروتوكول، ويتم الحصول على بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي عالية الجودة من عدد قليل من 1,000 نظام مراقبة الأصول الميدانية تنقية الخلايا (خلايا أقل قد تكون كافية).
    1. للحصول على خلايا 1,000 لإجراء تحاليل الحمض النووي الريبي seq، ضمان أن هناك مالا يقل عن 40 من خلايا لمصلحة المسمى فلوريسسينتلي في الدماغ (خلايا 20 كل الفص البصري). تشريح حوالي 10 ~ يجب تنقية الخلايا التي تهم كل الدماغ، حتى 100 العقول.
    2. للحصول على الذباب ~ 100 في المرحلة المناسبة للتنمية تشريح في كل تجربة، استخدام الصلبان ~ 100 إذا كان اختيار ضد الموازنون (هذا سوف تختلف تبعاً للأنماط الوراثية للآباء والأمهات). إذا كان الذباب متماثل الآليلات/المتسلسلات الفائدة يمكن تعيين عدد أقل من الصلبان.
    3. تحديد الإطار التشريح إلى ح 1 تحقيق أقصى قدر من الصحة الخلوية والتقليل من التغييرات غير محدد للجينات والجينوم المنظمة التي يمكن أن تحدث بعد أن يتم تشريح العقول، ولكن هذا يمكن تعديلها. تحديد عدد dissectors اللازمة لتشريح أدمغة 100 في ح 1، الذي يعتمد على مهارة dissectors.

2-يطير العمل

ملاحظة: يتم رفع الذباب عند 25 درجة مئوية مع رطوبة ~ 50% ما لم يذكر خلاف ذلك. ويرد أدناه النمط الوراثي للإناث "و النمط الوراثي"، والذكور ك M النمط الوراثي.

  1. توسيع المخزون
    1. الحصول على قنينة ~ 100 من الذباب الصغار (لا منذ أكثر من أسبوع القديمة مع و النمط الوراثي) والقنينات ~ 30 م الوراثي.
    2. يوم الخميس من الأسبوع 1، فليب قارورة 100 "والنمط الوراثي" على المواد الغذائية الطازجة. ابتداء من يوم الجمعة، الوجه قارورة كل يوم خلال يوم الثلاثاء من الأسبوع 2. سيتم استخدام هذه تقلب 6 جمع العذارى. أيضا في يوم الأربعاء من الأسبوع 2، الوجه الذباب م الوراثي على المواد الغذائية الطازجة وواضحة من الآباء والأمهات يوم الجمعة من الأسبوع 2. سيتم استخدام هذه القنينات لجمع الذكور للصلبان.
  2. جمع العذارى
    1. اعتبارا من يوم الاثنين من الأسبوع 3، جمع العذارى من قنينات "و النمط الوراثي". جمع 2-3 مرات يوميا وتخزين العذارى عند 18 درجة مئوية مع رطوبة ~ 50%. كرر هذه العملية كل يوم خلال يوم الثلاثاء من الأسبوع 4. يوصي بشدة بجمع العديد من العذارى قدر الإمكان، حيث يموت الكثير منهم قبل أن يتم تعيين الصلبان. بشكل عام، يعبر ~ 2,500 ينبغي جمع العذارى لتعيين 100.
  3. وضع الصلبان
    1. يوم الجمعة من الأسبوع 4، تعيين الأرقام المطلوبة من الصلبان (عادة الصلبان 100-200 كل تجربة) مع العذارى 15 "والنمط الوراثي" والذكور 7 م "النمط الوراثي" لكل الصليب. من المهم جداً استخدام الذكور الشباب وصحية مع أجنحة سليمة.
    2. الوجه الصلبان كل يوم من يوم الأحد إلى يوم السبت من الأسبوع 5. الملحق الصلبان مع العذارى الطازجة أو الذكور إذا تم العثور على الذباب الميت. من الضروري لمنع الطعام من الجفاف، وحتى المياه في قارورة حسب الحاجة. المواد الغذائية الجافة ستنخفض إلى حد كبير العائد.
  4. مراقبة سلبية لنظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز
    1. تضمين عنصر تحكم سلبية دون الخلايا المرغوبة التي وصفت لفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون عنصر التحكم السلبي المراسل (مثلاً UAS-التجارة والنقل) ولكن ليس برنامج التشغيل (مثل GAL4)، حيث أنه يمكن تحديد التعبير القاعدية للمراسل (UAS-ثوابت يمكن أن تكون "راشح") لتعيين المناسبة النابضة لفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية. الوجه الذباب لمراقبة سلبية في الوقت نفسه مع الذباب التجريبية، ومرحلة لهم بنفس الطريقة.
  5. الخوادر التدريج
    1. جمع الخلايا في مرحلة معينة من التنمية الخوادر (مثلاً 40 ح بعد تشكيل بوباريوم [ح APF])، مرحلة الخوادر في إطار زمني تتطابق مع فترة ح 1 ح 1 المخصص لتشريح (نوقشت أعلاه). ينبغي أن يقوم نظام مراقبة الأصول الميدانية مباشرة بعد تفكك الخلية، التي تحدث بعد تشريح ويأخذ ~ 40 دقيقة. وهكذا، يتحدد الموعد المحدد لانطلاق وتشريح بتوافر نظام مراقبة الأصول الميدانية.
    2. للحصول على الخوادر في ح 40 الاتحادية، المرحلة يوم الاثنين من الأسبوع 6 في نقطة زمنية معينة (مثلاً، 05:00 م) تشريح الخوادر ح 40 في وقت لاحق (مثلاً، 09:00 ص يوم الأربعاء). استخدام الرسام من رطب بلطف بيك الخوادر قبل الأبيض ووضعها على الحائط في قنينات المعالجون مسبقاً. اختيار الخوادر مع النمط الوراثي المطلوب فقط.
  6. Replicates البيولوجية
    1. هل replicates البيولوجية 3 على الأقل لكل تجربة. كطريقة بسيطة، كرر هذه التجربة ثلاث مرات في الأسبوع نفسه (الأسبوع 6) استخدام الصلبان نفسه. على سبيل المثال، مرحلة الخوادر ل replicates الثانية والثالثة يومي الثلاثاء والأربعاء على التوالي. تشريح هذه الخوادر يومي الخميس والجمعة على التوالي.

3-نموذج إعداد

ملاحظة: يتم سرد كافة الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول للمواد.

  1. إعداد حلول لتشريح وتفكك النسيج
    1. إعداد مزيج إنزيم proteolytic الحل الأسهم (انظر الجدول للمواد) بإعادة تشكيل إنزيم المجففة بالتبريد مع ddH2س إلى تركيز وحدات Wünsch 26 (وو)/مل. قنينة تحتوي على 260 وو (قنينة كبيرة)، بإضافة 10 مل من ddH2س إلى القنينة، وجعل مختبرين تستخدم مرة واحدة (4.2 ميليلتر مطلوبة للانفصال). حل تخزين المخزون عند-20 درجة مئوية. وتتطلب كل تجربة الانفصال عينتين (المراقبة السلبية والأنسجة التجريبية).
    2. إعداد 10 × رينالديني للحل (RS) و "وسائل الإعلام" (CSM كاملة شنايدر) في اليوم قبل التشريح (يوم الاثنين من الأسبوع 6). إعداد 5 مل من المجلس الأعلى للقضاء لكل ديسيكتور، وحوالي 5 مل 1 x RS و 5 مل من المجلس الأعلى للقضاء للانفصال من العينات 2 (السلبية السيطرة والتجريبية). تخزين صربيا 10 x في 4 درجات مئوية لتصل إلى شهر، والمجلس الأعلى للقضاء في 4 درجات مئوية لتصل إلى أسبوع.
      1. لتحضير 100 مل من 10 x RS، حل ز 8 من كلوريد الصوديوم، 200 مغ بوكل، 50 ملغم من نة2ص4، 1 ز ناكو3 و 1 غرام من السكر في 100 مل من ddH2س في كوب 250 مل. فلتر تعقيم مع عامل تصفية 0.22 مم.
      2. إضافة 20 ملغ لالجلوتاثيون إلى 1 مل من ddH2س في microtube.
      3. لإعداد 50 مل من المجلس الأعلى للقضاء، بإضافة 5 مل حرارة إبطال المصل البقري، 0.1 مل من محلول الأنسولين 10 ملغ/مل، 5 مل من 200 ملم الحل ل الجلوتامين، ميكروليتر 12.5 من 20 ملغ/مل L-Glutathione، و 1 مل من محلول البنسلين والستربتوميسين (000 5 وحدة من البنسلين و 5 ملغ من ستربتوميسين /mL) لمل 38.9 شنايدر في وسائل الإعلام. فلتر تعقيم مع عامل تصفية 0.22 مم.
      4. تمييع RS x 10 مع ddH2س جعل 1 x RS العامل الحل. إعداد ميكروليتر 500 روبية x 1 في microtubes غير لاصقة لكل عينة.
    3. بدوره على حمام مائي وضبط درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية. تأكد من أن درجة الحرارة دقيقة باستخدام مقياس حرارة. يجب أن يكون حمام الماء في درجة الحرارة الصحيحة قبل التنشيط غراء. من المستحسن تعيين درجة الحرارة في المساء قبل تشريح صباح.
  2. إعداد غراء وإنزيم proteolytic مزيج
    ملاحظة: جعل الحل غراء الطازجة قبل كل الانفصال.
    1. يوم الثلاثاء من الأسبوع 6 حوالي 45 دقيقة قبل البدء تشريح، استرداد 1 قنينة من مسحوق غراء من 4 درجة مئوية واحتضان في درجة حرارة الغرفة. كما نقض المجلس الأعلى للقضاء في أنبوب ايبندورف في درجة حرارة الغرفة لوقت لاحق إضافة إلى مسحوق غراء.
    2. دقيقة قبل بدء تشريح استخدام المحاقن لإضافة درجة حرارة الغرفة المجلس الأعلى للقضاء لقنينة غراء (مباشرة عن طريق عملية النداءات الموحدة) حيث يكون التركيز 100 وحدة/مل (مقدار مسحوق في كل قنينة يختلف قليلاً؛ لقنينة تحتوي على وحدات 123 إضافة 1.23 m L من المجلس الأعلى للقضاء). مزيج، أولاً عكس القنينة لالتقاط أي مسحوق عالقاً داخل عملية النداءات الموحدة، و "ثم الماصة؛" صعودا وهبوطاً.
    3. إضافة القنينة إلى دورق يحتوي على 37 درجة مئوية في المياه في حوض ماء. تأكد من قنينة حل غراء لا يتحرك. تنشيط غراء لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. بعد إضافة غراء إلى أخلطه في حوض ماء، استرداد قاسمة لأنزيم proteolytic مزيج (26 وو/mL) من-20 درجة مئوية واحتضان في درجة حرارة الغرفة. وبعد 30 دقيقة من التنشيط، احتضان غراء في درجة حرارة الغرفة.
  3. تشريح
    1. يوم الثلاثاء من الأسبوع 6، تشريح أدمغة الخوادر نظموا في المجلس الأعلى للقضاء الباردة مع ملقط نظيف، ومن قطع الفصوص البصرية معسر عند مفرق الفص البصري والدماغ المركزي.
    2. إضافة الفصوص إلى الجزء السفلي من microtube التي تحتوي على 500 ميكروليتر 1 x روبية (microtube واحد للأنسجة التجريبية) وواحد للأنسجة المراقبة السلبية. تبقى دائماً هذه الأنابيب على الجليد.
    3. تشريح الفصوص أكبر عدد ممكن في ح 1. للأنسجة المراقبة السلبية، الفصوص 10 بما فيه الكفاية. حوض تشريح الفصوص البصرية في microtube واحدة للقضاء على فقدان الأنسجة أثناء نقل بين microtubes.
  4. تفكك خلية
    1. بعناية إزالة صربيا 1 x من microtube مع تشريح الفصوص البصرية باستخدام ماصة P200، ترك ما يكفي لتغطية الفصوص. إضافة ميكروليتر 500 روبية 1 x بعناية إلى الجانب من الأنبوب، بغية تعكير العقول بأقل قدر ممكن. دائماً الأنبوب على الجليد.
    2. واسمحوا الفصوص تترسب في القاع. تناول 200 ميكروليتر مرة واحدة فقط، و "الماصة؛" الخروج مزيج (الفصوص ينبغي التحرك). واسمحوا الفصوص تسوية مرة أخرى.
    3. للعينتين (التحكم التجريبية والسلبية)، تنشيط ميكروليتر 600 الكوة من غراء درجة حرارة الغرفة إلى microtube. إضافة ميكروليتر 4.2 من مزيج إنزيم proteolytic درجة حرارة الغرفة إلى 600 حل غراء ميكروليتر للحصول على تركيز نهائي 0.18 وو/مل. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. هذا هو الحل الانفصال.
    4. بعناية إزالة صربيا 1 x من كل عينة وإضافة 300 ميكروليتر من الحل الانفصال الفصوص. احتضان هذه العينات عند 25 درجة مئوية، 1,000 لفة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في ثيرموميكسير microtube.
    5. في 5 و 10 نقاط الوقت دقيقة، وقف ثيرموميكسير والسماح الفصوص بالوعة إلى الجزء السفلي من microtube. يستغرق 200 ميكروليتر من الحل وبيبيت من مزيج.
    6. وبعد 15 دقيقة، واسمحوا الفصوص تترسب في القاع وإزالة الحل الانفصال بعناية من الفصوص (حاول أن لا تخل الفصوص).
    7. تغسل مرتين مع 1 x روبية. للقيام بذلك، بعناية إضافة 500 ميكروليتر 1 × روبية (حاول أن لا تخل الفصوص). ميكس ولطف بيبيت حتى 200 ميكروليتر بيبيت ثم الخروج إلى microtube. واسمحوا الفصوص تنزل إلى القاع، وتكرار.
    8. تغسل كل عينة مرتين مع 500 ميكروليتر من المجلس الأعلى للقضاء (كما في الخطوة السابقة).
    9. بعناية إزالة المجلس الأعلى للقضاء وإضافة ميكروليتر 200 آخر من المجلس الأعلى للقضاء للأنبوب. استخدام ماصة P200، تعطيل الأنسجة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً دون رغوة، حتى أن الحل متجانسة (أي، يمكن لم يعد انظر أي مخلفات من الأنسجة).
    10. تصفية تعليق خلية عن طريق غطاء مش 30 ميكرومتر في أنبوب 5 مل نظام مراقبة الأصول الميدانية على الجليد (استخدام P200 وتأكد من أن يمر بتعليق كامل). إضافة ميكروليتر 500 آخر من المجلس الأعلى للقضاء microtube تفارق شطف، وتصفية الحل في أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية.
    11. عناية خلع غطاء أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية، وجمع الحل تحت التصفية مش مع P200 وإضافته إلى بقية التعليق في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية. النماذج جاهزة لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
    12. من المؤكد أن يكون microtubes لجمع نظام مراقبة الأصول الميدانية تنقية خلايا جاهزة في وقت مبكر. للحمض النووي الريبي-seq، فرز الخلايا من كل عينة مباشرة إلى microtubes التي تحتوي على 300 ميكروليتر RLT المخزن المؤقت (تحلل المخزن المؤقت) من مجموعة أدوات تنقية الحمض النووي الريبي (إضافة 1: 100 2–ميركابتوثانول قبل الاستخدام).
  5. نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز
    ملاحظة: بعد الانفصال، فورا فرز الخلايا بنظام مراقبة الأصول الميدانية (ح 1 كحد أقصى). تأكد من كتاب نظام مراقبة الأصول الميدانية الدورات تبعاً لذلك عند التخطيط للتجربة. ويستخدم عادة أرز خلية مع حجم الفوهة ميكرومترات 100.
    1. مقارنة توزيع خلية في عنصر التحكم السلبي والعينة التجريبية لإعداد النابضة للفرز. ومن الناحية المثالية، إنشاء النابضة في تجربة نظام مراقبة الأصول الميدانية التجريبية، وسوف توفر عينة مراقبة سلبية تأكيد أو ضبط النابضة وضعت من قبل. يجب فصل خلايا الاهتمام أيضا من خلفية الخلايا الموجودة في عنصر التحكم السلبي والعينة التجريبية (الشكل 4) (هذا الاختبار في التجارب الرائدة).
    2. جمع الخلايا تم فرزها في أنابيب جمع المعدة.
  6. تنقية الحمض النووي الريبي
    1. وبعد فرز الخلايا مباشرة إلى 300 ميكروليتر RLT المخزن المؤقت، بيبيت صعودا ونزولاً الخلايا.
    2. تنقية الحمض النووي الريبي بعد بروتوكول قياسي "لتنقية الحمض النووي الريبي مجموع" من استخدام التنقية الخلايا البشرية والحيوانية (انظر الجدول للمواد) مع الحمض النووي على عمود الهضم7عدة. الوت الجيش الملكي النيبالي في 20 ميكروليتر من المياه خالية من رناسي.
    3. تجميد عينات الحمض النووي الريبي بالنتروجين السائل ومخزن في-80 درجة مئوية.
    4. لكل تجربة إجراء replicates على الأقل 3 للتحكم والظروف التجريبية. تعد مكتبات كدنا لجميع العينات في نفس الوقت وتشغيل جميع العينات في نفس الخلية تدفق التحكم للتغير التقني. حالما يتم إعداد جميع عينات الحمض النووي الريبي، استخدام فولت سرعة لتقليل الحجم إلى 2 – 5 ميكروليتر (كل عينة).

4-إعداد مكتبات كدنا وتسلسلها بالذكية-seq2

ملاحظة: إلى تقليل التغير التقني، جعل جميع المكتبات كدنا في نفس الوقت، وتسلسل منهم في نفس الخلية تدفق.

  1. استخدام مدخلات من 1.5 ميكروليتر من تركيز الحمض النووي الريبي لجعل المكتبات كدنا باتباع بروتوكول قياسي ل الذكية--seq217 باستثناء التعديلات التالية: استخدام مزيج سيد بكر عالية دقة مختلفة (انظر الجدول للمواد) لبكر التضخيم؛ تستخدم تنقية PCR في عمود كيت (انظر الجدول للمواد) بدلاً من الخرز المغناطيسي لتنقية منتجات PCR.
  2. يشمل البروتوكول الذكية-seq2 خطوة ما قبل تضخيم PCR بعد النسخ العكسي، فضلا عن خطوة PCR تخصيب اليورانيوم نهائياً بعد تاجمينتاتيون. عدد الدورات في التضخيم PCR يعتمد على وفرة المواد المدخلة. مع 1,000 الخلايا كمدخل، عادة استخدام دورات 15 في الخطوة ما قبل التضخيم بكر ودورات 12 للخطوة PCR تخصيب اليورانيوم نهائياً.
  3. تجمع المكتبات وتسلسل منهم على خلية تدفق واحد (مثلاً، النظام الأساسي نيكستسيق).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

المخطط العام
ويرد في الشكل 1مخطط عام للبروتوكول. البروتوكول وينقسم إلى ثلاثة أجزاء رئيسية: يطير العمل وتسلسلها وإعداد نموذج تحليل البيانات. لا يتم تضمين دورة "التخطيط قبل التجربة" البروتوكول في المخطط العام للبساطة.

الجدول الزمني
ويرد في الشكل 2تقويم من الأجزاء الرئيسية للبروتوكول (أعمال الطيران وإعداد نموذج).

التحقق من وضع العلامات الخاصة بالخلية بالفحص المجهري [كنفوكل]
في تجربة تمثيلية، كانت فلوريسسينتلي المسمى L3 الصفيحة العصبية أحادي القطب (L3). العصبية L3 هي واحدة من الخلايا العصبية الصفيحة مثلى الخمسة (L1-L5) التي تلقي المدخلات من فوتوريسيبتورس على نطاق واسع لا تنزعج R1 R6 وترحيل المعلومات إلى مركز عالية من سينابسينج إلى الخلايا العصبية المستهدفة في لب. في تجربة ماركم، استنساخ خلية مفردة L3 هي التي تم إنشاؤها بواسطة جزئ الانقسامية والمسمى فلوريسسينتلي من علامات اثنين و myr-تدتوم (غشاء) H2A-التجارة والنقل (النووية). الأنماط الجينية الذباب المستخدمة في الصلبان مبينة في الجدول 1. للتحقق من وضع العلامات الخاصة بالخلية، تم تشريح أدمغة يطير من النمط الوراثي المطلوب في المرحلة التنموية للفائدة (ح 40 الاتحادية). وأجرى إيمونوستينينج كما هو موضح سابقا7 باستخدام أجسام مضادة محددة ضد دسريد والتجارة والنقل (الشكل 3، والأرجواني والأخضر)، فضلا عن جسم 24B10 كمرجع للصفيحة ولب نيوروبيلس (الشكل 3، الأزرق). مجهرية [كنفوكل] أكد أن L3 هي نوع الخلية فقط المسمى دسريد والتجارة والنقل في الفص البصري.

عزل الخلايا منخفض--وفرة من نظام مراقبة الأصول الميدانية
ويرد نظام مراقبة الأصول الميدانية ممثل فرز النتيجة في الشكل 4. وسجلت أحداث 100,000. 29.9 في المائة من جميع الأحداث التي نوع المحتملة، ويمكن أن تكون بقية الحطام أو المجاميع. ثم كانت بوابات دوبليتس والخلايا التي تحتوي على أحجام مختلفة استناداً إلى التفاصيل والحجم. ظهرت L3 الخلايا العصبية من الخلايا الوحيدة المتبقية (نوع منتدى التعاون الأمني، 27.3 في المائة من جميع الأحداث)، كمجموعة ضيقة في P1 (الشكل 4، عينة، أرجواني)، التي فصلت أيضا من خلفية الخلايا (الشكل 4، عينة، أزرق). وكان حجم الخلايا في P1 مماثلة تتفق مع مجموعة متجانسة من سكان خلوية. جدير بالذكر أن وزعت بعض الخلايا في P2 (الشكل 4، عينة، الأخضر) مع كثافة متوسطة الأسفار دسريد والتجارة والنقل بين مجموعة ضيقة من الخلايا في P1 والخلفية. هوية هذه الخلايا لم تكن واضحة. لأن الخلايا P2 حجم مختلف من الخلايا P1، هذه الخلايا من المرجح أن تكون غير محددة. لتجنب التلوث المحتملة من الخلايا غير المحددة، جمعت الخلايا P1 فقط للتجربة. من 100,000 الأحداث، يتم الحصول على 45 P1 الخلايا.

Figure 1
رقم 1: مخطط عام للبروتوكول. البروتوكول ويتكون من ثلاثة أجزاء: يطير العمل وتسلسلها وإعداد نموذج تحليل البيانات. تتم الإشارة إلى وقت تجهيز التقريبي لكل جزء. وترد أيضا الخطوات الرئيسية لكل جزء في منطقتي محاصر المقابلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الجدول الزمني لأعمال الطيران وإعداد عينة- البروتوكول تستغرق حوالي 6 أسابيع. توقيت للخطوات الرئيسية التي تظهر في التقويم. التشريح، والانفصال، وتنقية الحمض النووي الريبي تتم في نفس يوم الفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية، وهي لا تظهر في الجدول الزمني للبساطة. Replicates البيولوجية الثلاثة تتم تسلسلياً في نفس الأسبوع مع الصلبان نفسه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: صورة مجهرية [كنفوكل] ممثل تظهر العلامات الانتقائي للخلايا ينشدها علامات مضيئة. وقدمت واحد L3 الصفيحة العصبية أحادي القطب في تجارب ماركم، للتعبير عن myr-تدتوم و H2A-التجارة والنقل باستخدام برنامج تشغيل (9-9-GAL4) GAL4 خاصة بالمستوى 318. تم تشريح في 40 ساعة APF يطير العقول من النمط الوراثي المطلوب وملطخة بالأجسام المضادة دسريد ومكافحة التجارة والنقل 24B10 (كمرجع نيوروبيلس الصفيحة ولب). وقيمت وسم الفلورسنت بالفحص المجهري [كنفوكل]. الخلايا العصبية L3 يولدون في محاور عصبية الصفيحة والمشروع أن تنهي داخل نيوروبيل لب. في الدماغ، وكل مجموعة فرعية من الخلايا العصبية L3 أعرب كلا الصحفيين الفلورسنت، وكانت هذه الخلايا فقط في الفص البصري معربا عن العلامات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تنقية واحد L3 الصفيحة العصبية ماركم استنساخ عبر نظام مراقبة الأصول الميدانية: مؤامرة نظام مراقبة الأصول الميدانية ممثل. غيتس (مثل P1) تم إنشاؤها استناداً إلى كثافة الخلية الحبوبية، والحجم، والأسفار عزل الخلايا المفردة متجانسة. الخلايا العصبية L3 معربا عن مستويات عالية وبالمثل myr-تدتوم والتجارة والنقل H2A جمعت من P1 (أرجواني). ولوحظت بعض الخلايا بكثافة متوسطة الأسفار في P2 (أخضر). وهذه تختلف في الحجم من الخلايا العصبية L3 في P1، ويمكن أن تمثل خلايا غير محددة. وقد جمعت هذه لا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

النمط الوراثي المصدر
ث؛ توبب-GAL80، FRT40، ز 27 05-FLP::PEST/سيو، الخمير الحمر-GAL4، UAS-التجارة والنقل؛ 9-9-GAL4، UAS-myr::tdTOM/TM6B بنغ et al., 2018
ث؛ FRT40/سيو، الخمير الحمر-GAL4، UAS-التجارة والنقل؛ UAS-H2A-التجارة والنقل/TM6B بنغ et al., 2018

الجدول 1: الأنماط الجينية المستخدمة في الصلبان الذباب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول بسيط وليس من الصعب من الناحية الفنية لتنفيذ، ولكن هناك مفتاح عدة خطوات إذا تجاهل إرادة يسبب انخفاض كبير في الغلة الخلوية. (الخطوة 2.3.2.) من الأهمية بمكان أن الصلبان يتمتعون بصحة جيدة، وأن الطعام لم تجف. سقي العادية من الصلبان ضروري لزيادة عدد الذباب المتاحة لتشريح ذات النمط الوراثي الصحيح وفي مرحلة التنمية الصحيحة. وكم الحاجة الصلبان إلى أن تسقي تختلف تبعاً للمواد الغذائية المستخدمة وظروف الإسكان للذباب. للتأكد من الصلبان لا تجف، دراسة في القنينات مرتين في يوم وإضافة المياه تبعاً لذلك. (الخطوة 3، 3.) من المهم أيضا أن تجمع العقول تشريح في microtube واحد التي سيتم استخدامها للانفصال، بدلاً من وجود كل ديسيكتور استخدام microtube الخاصة بهم، وثم بعد ذلك تجميع العينات. هذا سيزيل أي العقول التي فقدت من نقل بين microtubes، التي يمكن أن تكون كبيرة. (الخطوة 3.4.9.) عندما بيبيتينج صعودا وهبوطاً لتعطيل يدوياً الأنسجة، من المهم أن تفعل ذلك حتى لا مخلفات الأنسجة مرئية بالعين المجردة في التعليق. اختلال الأنسجة ناقصة سيقلل من العدد الخلايا المفردة التي يمكن فرز عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية، وهكذا ينخفض العائد الخلوية.

وبدأ الحد الرئيسية من الغلة الخلوية المواد. وفي هذا الصدد، تشريح معدل الحد لعدة أسباب: (1) البروتوكول الانفصال يتطلب الفصوص الألياف البصرية إلى تشريح خارج الرأس وفصلها عن الدماغ المركزي، (2) للحصول على أنسجة في نقاط زمنية دقيقة أثناء تطوير الوقت يجب أن تكون نافذة لتشريح المحدودة، (3) طول الفترة الزمنية بين تشريح ونظام مراقبة الأصول الميدانية، أكبر فرصة للأمثل الخلية الصحية والآثار غير محددة في التعبير الجيني ومنظمة الجينوم (أي أقصر تشريح الفترة على نحو أفضل). وينبغي تعديل تشريح الوقت المستغرق للحصول على المبلغ المطلوب من المواد في الحد الأدنى من الوقت. يتم تنفيذ معظم من استكشاف الأخطاء وإصلاحها في التجارب الرائدة. هنا من الأهمية بمكان: تحسين العلامات الجينية للسطوع وخصوصية (الشكل 3)، تقييما لتحديد ما إذا كان عدد سكان استنساخه من خلايا ذات الاهتمام هي المتواجدة من الخلايا الخلفية في مؤامرات نظام مراقبة الأصول الميدانية (الشكل 4)، عدد العقول التي بحاجة إلى أن تشريح للحصول على كمية كافية من المواد للتطبيقات اللاحقة (راجع الخطوة 1. يطير العمل)، وتحديد الحد الأدنى من الوقت اللازم لتشريح الأرقام المناسبة للعقول.

تقدما كبيرا لهذا البروتوكول أنه يتيح كفاءة عزل الخلايا وفرة منخفضة ترانسكريبتوميك والتطبيقات الجينومية، تحسين الحساسية إلى حد كبير على أن الأسلوب السابق6. استناداً إلى تقديرات لدينا، المسمى فلوريسسينتلي الفئات السكانية التي تضم أقل من 100 خلية كل الفص البصري يمكن أن تكون كفاءة معزولة لإجراء تحاليل الحمض النووي الريبي seq. هذا يسمح ترانسكريبتوميك وتحليلات الجينومية لتطبيقها في التجارب الوراثية الفسيفساء، فيها مجموعات فرعية خلايا لأنواع معينة يتم التلاعب وراثيا في خلفية عادية إلا. وهذا يمثل تقدما حاسما، على هذا النحو التجارب ضرورية لتحديد وظائف الجينات ذاتية وغير ذاتية الخلية في الأنسجة المعقدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

بتمويل هذا البحث من NINDS من "معاهد الصحة الوطنية" تحت رقم جائزة K01NS094545، أندجرانتس من مركز لفلر "دراسة اضطرابات الأعصاب". نحن نسلم ليمينغ تان وجيسون ماك إيوان لقيمة المحادثات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liberase TM Roche 5401127001 Proteolytic enzyme blend
NaCl Sigma-Aldrich S3014
KCl Sigma-Aldrich P9541
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich  S5761
Glucose Sigma-Aldrich G0350500
L-Glutathione Sigma-Aldrich G6013
Heat Inactivated Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135
Insulin Solution Sigma-Aldrich I0516
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513
Penicillin-Streptomycin Solution Sigma-Aldrich P4458
Schneider's Culture Medium Gibco 21720024
Papain Worthington LK003178
2-Mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA purification kit
RNase-free DNase Qiagen 79254
SuperScript II Reverse Transcriptase Life Technologies 18064-014
dNTP Mix Life Technologies R0191
MgCl2 Solution Sigma-Aldrich M1028-10X1ML
Betaine Solution Sigma-Aldrich B0300-1VL
RNaseOUT Life Technologies 10777-019
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix New England Biolabs M0492S
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004
Nextera XT DNA Library Prepration Kit Illumina FC-131-1024
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-1001
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap Falcon 352235
Bottle-Top Vacuum Filter Systems Corning CLS431153
ThermoMixer F1.5 Eppendorf 5384000020
FACSAria Flow Cytometer BD Biosciences 656700
HiSeq 2500 Sequencing System Illumina SY–401–2501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
  2. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  3. Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
  4. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
  5. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  6. Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
  7. Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
  8. Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
  9. Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
  10. Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
  11. Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
  12. Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
  13. Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
  14. Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
  15. Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
  16. Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
  17. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  18. Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).

Tags

علم الوراثة، 139 قضية، النظام المرئي المورفولوجية، الفص البصري، الخلايا العصبية، وتفكك الخلية، نظام مراقبة الأصول الميدانية، تسلسل الحمض النووي الريبي، ماركم، فسيفساء الوراثية، تدني وفرة
تنقية الخلايا منخفض وفيرة في النظام المرئي المورفولوجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peng, J., Santiago, I. J., Pecot, M. … More

Peng, J., Santiago, I. J., Pecot, M. Y. Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System. J. Vis. Exp. (139), e58474, doi:10.3791/58474 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter