Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Rensning af lav-rigelige celler i Drosophila visuelle System

Published: September 26, 2018 doi: 10.3791/58474
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurobiology, Harvard Medical School

Summary

Vi præsenterer her, en celle dissociation protokol for effektivt isolerer celler stede ved lav overflod i Drosophila visuelle system gennem fluorescens aktiveret celle sortering (FACS).

Abstract

Nylige forbedringer i følsomheden af næste generation sequencing har fremmet anvendelsen af transkriptom og genomisk analyser til et lille antal celler. Udnytte denne teknologi til at undersøge udviklingen i Drosophila visuelle system, som kan prale af et væld af celle type-specifikke genetiske værktøjer, giver en kraftfuld tilgang til at håndtere det molekylære grundlag af udvikling med præcise cellulære opløsning. For en sådan tilgang til at være muligt, er det afgørende at have kapacitet til at pålideligt og effektivt rense celler stede ved lav overflod i hjernen. Vi præsenterer her, en metode, der giver mulighed for effektiv rensning af enkelt celle kloner i genetiske mosaik eksperimenter. Med denne protokol opnår vi konsekvent et højt cellulære udbytte efter rensning ved hjælp af fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) (~ 25% af alle mærket celler), og med held udført transcriptomics analyser på enkelt celle kloner genereret gennem mosaik analyse med en repressible celle markør (MARCM). Denne protokol er ideel til anvendelse transkriptom og genomisk analyser til bestemte celletyper i det visuelle system, på tværs af forskellige stadier af udvikling og i forbindelse med forskellige genetiske manipulationer.

Introduction

Drosophila visuelle system er en fremragende model til at studere det genetiske grundlag for udvikling og adfærd. Det består af en stereotype cellulære arkitektur1 og en avanceret genetiske toolkit til at manipulere bestemte celle typer2,3. En styrke ved dette system er evnen til selvstændigt afhøre genfunktion i celletyper af interesse med enkelt celle opløsning, ved hjælp af genetiske mosaik metoder4,5. Vi forsøgt at kombinere disse genetiske værktøjer med de seneste fremskridt i næste generation sequencing at udføre celle typespecifikke transkriptom og genomisk analyser i enkelt celle kloner i genetiske mosaik eksperimenter.

For at opnå dette, er det vigtigt at udvikle en robust og effektiv metode til at isolere selektivt lav rigelige cellepopulationer i hjernen. Tidligere, vi udviklede en protokol til isolering af specifikke celletyper i det visuelle system under puppe udvikling gennem FACS, og fastlægge deres transcriptomes ved hjælp af RNA-seq6. I disse forsøg var størstedelen af celler af en bestemt type (f.eks. R7 fotoreceptorer) fluorescently mærket. Ved hjælp af denne metode i genetiske mosaik eksperimenter, hvori kun en delmængde af celler af samme type er mærket, er lykkedes at isolere nok celler for at opnå kvalitet sequencing data. For at løse det, søgte vi at øge cellulære udbyttet ved at forbedre celle dissociation protokol.

Vores strategi var at mindske den samlede længde af protokollen for at maksimere dissocierede celler sundhed, forbedre cellulære sundhed ved at ændre dissektion og dissociation buffere, og reducere mængden af mekanisk afbrydelse af dissekerede væv. Vi testede den forbedrede protokol7 ved hjælp af mosaic analyse med en repressible celle markør5 (MARCM), som tillader generation af single fluorescently mærket kloner af bestemte celletyper, der er vildtype eller mutant for et gen af interesse i en ellers heterozygous flyve. Hvor på identiske betingelser, vores tidligere-mislykkedes at generere nok materiale til RNA-FF., var forbedret protokollen vellykket. Vi reproducerbar opnå en høj cellulære udbytte (~ 25% af mærket celler) og få høj kvalitet RNA-seq data fra så lidt som 1.000 celler7.

Et antal protokoller har været tidligere beskrevet til at isolere bestemte celletyper i Drosophila6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. disse protokoller er primært beregnet til isolering af celler, der er rigelige i hjernen. Vores protokol er optimeret til at isolere lav rigelige cellepopulationer (færre end 100 celler pr. hjerne) i det visuelle system ved hjælp af FACS for efterfølgende transkriptom og genomisk analyser. Med denne protokol tilstræber vi at give en måde at reproducerbar isolere lav rigelige celler fra det flyve visuelle system af FACS og at opnå høj kvalitet transkriptom data af RNA-FF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. planlægning, før eksperimentet

  1. Før du starter eksperimentet, udføre et mindre pilotprojekt for at bekræfte, hvis genetik fungerer som forventet, at specielt mærke de ønskede celler.
    1. Som en first-pass, brug Immunhistokemi og lysmikroskopi at bestemme, om er uønsket celler mærket. Ideelt set, genetiske markører vil være specifikke i nethinden og optik lap (figur 3). Kun optik lapper bruges til celle dissociation og så mærkning i den centrale hjerne er ikke et problem. På samme tid, afgøre, hvor mange celler af interesse er mærket pr. hjerne.
    2. Hvis de genetiske labels() har den ønskede specificitet, udføre en pilot FACS eksperiment (figur 4) til at afgøre, om en ren population af celler kan isoleres reproducerbar, og også for at vurdere hvor mange celler af interesse kan isoleres fra hver hjerne. Hvis det er nødvendigt, vurdere renhedsgraden af isolerede celler gennem kvantitativ PCR til at bestemme berigelsen eller nedtrapning berigelse af specifikke gener.
  2. Bestem antallet af krydser nødvendig for at opnå den ønskede mængde af materiale til eksperimentet.
    Bemærk: Baseret på eksperimentelle erfaringer, ~ 17-25% af fluorescently mærket celler er konsekvent isoleret med denne protokol, og høj kvalitet RNA-sekventering oplysninger er indhentet fra så lidt som 1.000 FACS renset celler (færre celler kan være tilstrækkelige).
    1. For at få 1.000 celler for RNA-seq analyser, sikre at der er mindst 40 celler af interesse fluorescently mærket pr. hjerne (20 celler pr. optik lap). Omkring ~ 10 celler af interesse bør renses pr. hjerne, så dissekere 100 hjerner.
    2. For at opnå ~ 100 fluer på den passende udviklingstrin at dissekere i hvert forsøg, krydser brug ~ 100 hvis du vælger mod balancers (dette vil variere afhængigt af genotyper af forældrene). Hvis fluer er homozygote for alleler/transgener interesse kan færre krydser indstilles.
    3. Begrænse vinduet dissektion til 1 h at maksimere cellulære sundhed og minimere ikke-specifikke ændringer i genekspression og genom organisation, der kan opstå efter hjerner er dissekeret, men dette kan justeres. Bestem antallet af dissectors forpligtet til at dissekere 100 hjerner i 1 h, som afhænger af dygtighed af dissectors.

2. Flyv arbejde

Bemærk: Fluer er hævet ved 25 ° C med ~ 50% fugtighed, medmindre andet er angivet. Under genotypen hos hunner er indiceret som Genotype F, og at hanner som Genotype M.

  1. Udvidelse lagre
    1. Få ~ 100 hætteglas af unge fluer (ikke mere end en uge gammel med Genotype F) og ~ 30 hætteglas af Genotype M.
    2. På torsdag i uge 1, flip 100 hætteglas af Genotype F på frisk mad. Starter på fredag, flip hætteglassene hver dag gennem tirsdag i uge 2. Disse 6 flips skal bruges til at indsamle jomfruer. Også på onsdag i uge 2, flip fluer af Genotype M på frisk mad og rydde ud forældrene på fredag i uge 2. Disse hætteglas skal bruges til at indsamle hanner til Kors.
  2. Indsamle jomfruer
    1. Fra mandag i uge 3, indsamle jomfruer fra Genotype F hætteglas. Indsamle 2 - 3 gange om dagen og gemme jomfruer ved 18 ° C med ~ 50% fugtighed. Gentag dette hver dag gennem tirsdag i uge 4. Det anbefales stærkt at indsamle så mange jomfruer som muligt, da en masse af dem die før krydser er indstillet. Typisk, ~ 2.500 jomfruer bør indsamles for at indstille 100 krydser.
  3. Indstilling af Kors
    1. Fredag i uge 4, angive det ønskede antal krydser (typisk 100-200 Kors pr. eksperiment) med 15 jomfruer af Genotype F og 7 hanner af Genotype M for hver Kors. Det er meget vigtigt at bruge unge og sunde mænd med intakt vinger.
    2. Flip krydser hver dag fra søndag til lørdag i uge 5. Supplere krydser med friske jomfruer eller hanner, hvis døde fluer er fundet. Det er vigtigt at beskytter fødevarer mod udtørring, så vand hætteglassene efter behov. Tørfoder formindskes betydeligt udbytte.
  4. Negativ kontrol for FACS sortering
    1. Omfatter en negativ kontrol uden de ønskede celler bliver mærket til FACS sortering. Ideelt, den negative kontrol bør have reporter (fx UAS-normal god landbrugspraksis), men ikke driveren (f.eks. GAL4), således at basal udtryk for reporter (UAS-konstruktioner kan være "utæt") kan bestemmes til at indstille passende gating for FACS sortering. Flip fluer for den negative kontrol samtidig med de eksperimentelle fluer, og iscenesætte dem på samme måde.
  5. Iscenesættelse pupper
    1. For at indsamle celler på en bestemt fase af puppe udvikling (f.eks. 40 timer efter puparium dannelse [h APF]), fase pupper i en 1 h tidsvindue til at matche med perioden 1 h tildelt for dissektioner (drøftet ovenfor). FACS bør udføres direkte efter celle dissociation, som opstår efter dissektioner og tager ~ 40 min. Således bestemmes det nøjagtige tidspunkt i staging og dissektioner af FACS tilgængelighed.
    2. For at få pupper på 40 h APF, etape på mandag i uge 6 for et bestemt tidspunkt (f.eks. 5 pm) at dissekere pupper 40 h senere (f.eks. 9: 00 på onsdag). Bruge en våd pensel til at forsigtigt pick hvid før pupper og placere dem på væggen i pre varmede hætteglas. Kun vælge pupper med ønskede genotype.
  6. Biologiske replikater
    1. Gøre mindst 3 biologiske flergangsbestemmelser for hvert forsøg. Som en enkel måde, gentage eksperimentet tre gange i den samme uge (uge 6) ved hjælp af de samme Kors. For eksempel, stage pupper til de anden og tredje replikater på tirsdag og onsdag, henholdsvis. Dissekere disse pupper på torsdag og fredag, henholdsvis.

3. Prøvetilberedning

Bemærk: Alle reagenser i denne protokol er angivet i Tabel af materialer.

  1. Forberede dissektioner og væv dissociation løsninger
    1. Forberede proteolytisk enzym blanding stamopløsningen (Se Tabel af materialer) af erstatningsgodtgørelse frysetørrede enzymet med ddH2O til en koncentration af 26 Wünsch enheder (Wu) / mL. For et hætteglas indeholdende 260 Wu (store vial), der tilsættes 10 mL af Hedeselskabet2O til hætteglasset og gøre engangsbrug delprøver (4,2 µL er påkrævet per dissociation). Gemme stamopløsning ved-20 ° C. Hvert forsøg kræver dissociation af to prøver (negativ kontrol og eksperimentelle væv).
    2. Forberede 10 x Rinaldinis løsning (RS) og komplet Schneiders medier (CSM) dagen før dissektion (mandag i uge 6). Forberede 5 mL af CSM for hver dissector, og ca. 5 mL 1 x RS og 5 mL af CSM for dissociation af 2 prøver (negativ kontrol og eksperimentelle). Gemme 10 x RS ved 4 ° C i op til en måned, og CSM ved 4 ° C i op til en uge.
      1. For at forberede 100 mL 10 x RS, 8 g NaCl, 200 mg af KCl, 50 mg af NaH2PO4, 1 g NaHCO3 og 1 g glukose i ddH2O i et 250 mL bægerglas 100 mL opløses. Filter sterilisere med 0,22 mm filter.
      2. Tilføj 20 mg L-Glutathion til 1 mL af Hedeselskabet2O i en microtube.
      3. For at forberede 50 mL af CSM, tilsættes 5 mL af varme inaktiveret bovint serum, 0,1 mL af 10 mg/mL insulin opløsning, 5 mL af 200 mM L-glutamin løsning, 12,5 μl af 20 mg/mL L-Glutathion, og 1 mL af Penicillin-Streptomycin løsning (5.000 enheder penicillin og 5 mg streptomycin / mL) til 38.9 mL af Schneiders medier. Filter sterilisere med 0,22 mm filter.
      4. Fortynde 10 x RS med ddH2O for at gøre 1 x RS brugsopløsning. Forberede 500 μL 1 x RS i ikke-klæbende microtubes til hver prøve.
    3. Tænd et vandbad og Indstil temperaturen ved 37 ° C. Sørg for at temperaturen er præcis ved hjælp af et termometer. Vandbadet skal være på den korrekte temperatur før papain aktivering. Det anbefales at indstille temperaturen om aftenen før en morgen dissektion.
  2. Forberede papain og proteolytisk enzym blend
    Bemærk: Sørg papain løsning frisk før hver dissociation.
    1. Tirsdag i uge 6 ca 45 min før du starter dissektioner, hente 1 hætteglas med papain pulver fra 4 ° C og inkuberes ved stuetemperatur. Også afsat CSM i en Eppendorf-rør ved stuetemperatur til senere tilføje til papain pulver.
    2. min før start af dissektioner bruge en sprøjte til at tilføje stuetemperatur CSM hætteglas med papain (direkte gennem fælles landbrugspolitik), så koncentrationen er 100 enheder/mL (mængden af pulver i hvert hætteglas er lidt anderledes, for et hætteglas indeholdende 123 enheder tilføje 1,23 m L af CSM). For at blande, først invertere hætteglas for at fange eventuelle pulver fast på indersiden af fælles landbrugspolitik, og derefter pipetteres op og ned.
    3. Tilføje hætteglasset til et bægerglas, der indeholder 37 ° C vand i vandbadet. Sørg for at hætteglas med papain løsning ikke flydende. Aktivere papain i 30 minutter ved 37 ° C.
    4. Efter tilsætning af papain til et bægerglas i vandbadet, hente en alikvot af proteolytisk enzym blanding (26 Wu/mL) fra-20 ° C og der inkuberes ved stuetemperatur. Efter 30 min for aktivering, Ruger papain ved stuetemperatur.
  3. Dissektioner
    1. Tirsdag i uge 6, dissekere de iscenesatte puppe hjerner i kolde CSM med ren pincet og afskære optik lapper ved at klemme på krydset af optik lap og centrale hjernen.
    2. Tilføj lapper til bunden af en microtube, der indeholder 500 μL 1 x RS (en microtube for det eksperimenterende væv) og en for negativ kontrol væv. Altid holde rør på is.
    3. Dissekere så mange lapper som muligt i 1 h. For negative kontrol væv er 10 fliger nok. Pool dissekeret optik lapper i en enkelt microtube til at fjerne væv tab under overførsel mellem microtubes.
  4. Celle dissociation
    1. Fjern forsigtigt 1 x RS fra microtube med dissekeret optik lapper ved hjælp af en P200 pipette, forlader nok til at dække lapper. Forsigtigt tilføje 500 μL 1 x RS til siden af røret, således at forstyrre så lidt som muligt hjerner. Altid holde røret på is.
    2. Lad lapper bilægge til bunden. Bare en gang tage op 200 μl og afpipetteres ud for at blande (fligerne bør flytte rundt). Lad lapper bosætte sig igen.
    3. For to prøver (eksperimentel og negativ kontrol) aktiveret alikvot 600 μl stuetemperatur papain ind i en microtube. Tilføje 4,2 μL af stuetemperatur proteolytisk enzym blanding i 600 μl papain løsning til at opnå en endelig koncentration på 0,18 Wu/mL. Mix af pipettering op og ned. Dette er dissociation løsningen.
    4. Forsigtigt fjerne 1 x RS fra hver prøve og tilføje 300 μL af dissociation løsning til lapper. Inkuber prøver ved 25 ° C, 1000 rpm for 15 min i en microtube thermomixer.
    5. På 5-10 min gang points, stop thermomixer og lad lapper synker til bunden af microtube. Tage op 200 μl af løsning og afpipetteres ud til mix.
    6. Efter 15 min, lad lapper bilægge til bunden, og fjern forsigtigt dissociation løsning fra lapper (prøv ikke at forstyrre kamre).
    7. Vaskes to gange med 1 x RS. For at gøre dette, omhyggeligt tilsæt 500 μL 1 x RS (prøv ikke at forstyrre kamre). Mix, forsigtigt afpipetteres op 200 μl og derefter afpipetteres ud i microtube. Lad lapper synker til bunds og Gentag.
    8. Vask hver prøve to gange med 500 μL af CSM (samme som forrige trin).
    9. Forsigtigt fjerne CSM og tilføje en anden 200 μl af CSM til røret. Ved hjælp af en P200 pipette, forstyrre væv af pipettering op og ned uden skumdannelse, indtil løsningen er homogen (dvs., kan ikke længere se eventuelle rester af væv).
    10. Filtrer cellesuspension gennem en 30 μm mesh cap ind i et 5 mL FACS rør på is (brug en P200 og sørg for at hele suspension går). Tilføje et andet 500 μL af CSM at skylle dissociation microtube, og opløsningen filtreres ind i FACS rør.
    11. Omhyggeligt tag hætten af FACS tube, indsamle løsning nedenunder mesh-filter med en P200 og føje det til resten af suspension i FACS tube. Prøverne er klar til FACS.
    12. Sørg for at have microtubes til at indsamle FACS renset celler klar på forhånd. RNA-FF., sortere celler fra hver prøve direkte ind i microtubes indeholdende 300 μL af RLT buffer (lysisbuffer) fra RNA oprensning kit (tilføje 1: 100 2-Mercaptoethanol før brug).
  5. FACS sortering
    Bemærk: Efter dissociation, straks sortere celler af FACS (1 h max). Sørg for at bogen FACS sessioner i overensstemmelse hermed ved planlægning af forsøget. En celle sorteringsanlæg med 100 μm dyse størrelse bruges typisk.
    1. Sammenlign cell distribution i den negative kontrol og den eksperimentelle prøve at oprette gating for sortering. Ideelt, etablere gating i FACS pilotprojekt, og en negativ kontrolprøve vil give bekræftelse eller finjustering af de forud fastsatte gating. Celler af interesse skal være godt adskilt fra baggrunden celler, der findes i både den negative kontrol og eksperimentelle prøven (figur 4) (teste dette i de pilotforsøg).
    2. Indsamle de sorterede celler i rede indsamling rør.
  6. RNA oprensning
    1. Efter sortering celler direkte til 300 μL af RLT buffer, afpipetteres op og ned til lyse celler.
    2. Rense RNA efter standardprotokol for rensning af Total RNA fra dyre- og humane celler ved hjælp af rensning kit (Se Tabel af materialer) med på kolonnen DNA fordøjelsen7. Elueres RNA i 20 μL af RNase-fri vand.
    3. Fryse RNA prøver med flydende kvælstof og opbevares ved-80 ° C.
    4. Udføre mindst 3 flergangsbestemmelser for kontrol og eksperimentelle betingelser for hvert forsøg. Forberede alle prøver cDNA-biblioteker på samme tid og køre alle prøver på samme flow cellen til at kontrollere for tekniske variabilitet. Når alle RNA prøver er udarbejdet, skal du bruge en speed vac reducere lydstyrken til 2-5 μl (hver prøve).

4. forberedelse cDNA-biblioteker og sekventering af Smart-seq2

Bemærk: For at minimere tekniske variabilitet, gøre alle cDNA-bibliotekerne på samme tid, og sekvens dem på den samme flow-celle.

  1. Bruge en indgang på 1,5 μL af koncentreret RNA for at gøre cDNA-biblioteker ved at følge standardprotokol for Smart-seq217 undtagen følgende ændringer: Brug en anden high-fidelity PCR master mix (Se Tabel af materialer) til PCR forstærkning; bruge en på kolonnen PCR rensning kit (Se Tabel af materialer) i stedet for magnetiske perler til at rense PCR produkter.
  2. Smart-seq2 protokol omfatter en PCR pre forstærkning trin efter reverse transkription samt et afsluttende berigelse PCR skridt efter tagmentation. Antallet af cyklusser i PCR-amplifikation afhænger af overfloden af de input materiale. Med 1.000 celler som input, brug typisk 15 cykler i PCR pre forstærkning trin og 12 cykler til det endelige berigelse PCR skridt.
  3. Pool bibliotekerne og sekvens dem på en enkelt flow celle (f.eks. NextSeq platform).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generel ordning
En generel ordning i protokollen er vist i figur 1. Protokollen er opdelt i tre hoveddele: flyve arbejde, prøveforberedelse, sekventering og dataanalyse. "Planlægning før forsøget" sessionen i protokollen er ikke inkluderet i den generelle ordning for enkelhed.

Tidslinje
En kalender over de store dele af protokollen (flyve arbejde og prøveforberedelse) er vist i figur 2.

Kontrol af celle-specifikke mærkning af konfokalmikroskopi
I et repræsentativt eksperiment, var L3 lamina monopolære neuroner (L3) fluorescently mærket. L3 neuron er en af de fem homologe lamina neuroner (L1-L5), der modtager input fra de bredt tuned fotoreceptorer R1-R6 og oplysninger til byens høje af synapsing til target neuroner i medulla. I en MARCM eksperiment, enkelt celle L3 kloner genereres af mitotiske rekombination og fluorescently mærket af to markører, myr-tdTOM (membran) og H2A-normal god landbrugspraksis (nukleare). Genotyper af fluer i kors er vist i tabel 1. Du kan kontrollere celle-specifik mærkning, var flyve hjerner af den ønskede genotype dissekeret på udviklingsstadiet af interesse (40 h APF). Immunfarvning blev udført som tidligere beskrevet7 ved hjælp af antistoffer specifikke mod dsRed og normal god landbrugspraksis (figur 3, magenta og grøn), samt 24B10 antistof som reference for lamina og medulla neuropils (figur 3, blå). Konfokal mikroskopi bekræftet, at L3 er den eneste celletype mærket af både dsRed og normal god landbrugspraksis i den optik lap.

Isolering af lav-overflod celler af FACS
En repræsentant FACS sortering resultatet er vist i figur 4. 100.000 begivenheder blev registreret. 29,9% af alle begivenheder er potentielle slåbrokker, og resten kunne være snavs eller aggregater. Dubletter og celler med forskellige størrelser blev derefter lukket ud baseret på nøjagtighed og størrelse. Fra de resterende enkelte celler (FSC housecoats, 27,3% af alle begivenheder), L3 neuroner optrådte som en stram klynge i P1 (figur 4, modellen, magenta), som var godt adskilt fra baggrunden celler (figur 4, modellen, blå). Størrelsen på cellerne i P1 var ens i overensstemmelse med en homogen cellulære befolkning. Især var et par celler i P2 (figur 4, modellen, grøn) med mellemliggende fluorescens intensiteten af dsRed og normal god landbrugspraksis fordelt mellem den stramme klynge af celler i P1 og baggrunden. Identiteten af disse celler var ikke klar. Da P2 celler havde en anden størrelse end P1 celler, var disse celler tilbøjelige til at være ikke-specifikke. For at undgå potentiel forurening fra de ikke-specifikke celler, blev kun P1 celler indsamlet til eksperimentet. 100.000 begivenheder, er 45 P1 celler fremstillet.

Figure 1
Figur 1: en generel ordning for protokollen. Protokollen består af tre dele: flyve arbejde, prøveforberedelse, sekventering og dataanalyse. Den omtrentlige behandlingstid for hver del er indiceret. Vigtige skridt af hver del er også vist i de tilsvarende boxed regioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: tidslinje for flyve arbejde og prøveforberedelse. Protokollen tager ca 6 uger. Timingen for de vigtigste trin er vist i kalenderen. Dissektion, dissociation og RNA oprensning udføres i samme dag som FACS sortering, og vises ikke i kalenderen for enkelhed. Tre biologiske replikater er gjort sekventielt i den samme uge med de samme Kors. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: en repræsentativ Konfokal mikroskopi billede viser den selektive mærkning af ønsket celler af fluorescerende markører. I MARCM eksperimenter man enkelt L3 lamina monopolære neuroner at udtrykke myr-tdTOM og H2A-normal god landbrugspraksis ved hjælp af en L3-specifikke GAL4 driver (9-9-GAL4)18. Flyve hjerner af den ønskede genotype var dissekeret på 40hr APF og farves med anti-dsRed, anti-normal god landbrugspraksis og 24B10 antistoffer (som en reference til lamina og medulla neuropils). Fluorescerende mærkning blev vurderet af Konfokal mikroskopi. L3 neuroner er født i lamina og projekt axoner, der afsluttes i medulla neuropil. I hver hjerne, en delmængde af L3 neuroner udtrykt både fluorescerende journalister, og disse var de eneste celler i den optik lap udtrykker markører. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: rensende enkelt L3 lamina neuron MARCM kloner via FACS: en repræsentativ FACS plot. Gates (fx P1) blev skabt på grundlag af celle nøjagtighed, størrelse og fluorescens intensitet at isolere homogene enkelt celler. L3 neuroner udtryk for tilsvarende høje niveauer af myr-tdTOM og H2A-normal god landbrugspraksis var indsamlet fra i P1 (magenta). Et par celler med mellemliggende fluorescens intensitet er observeret i P2 (grøn). Disse er forskellige i størrelse end L3 neuroner i P1, og kunne udgøre ikke-specifikke celler. Disse blev ikke indsamlet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Genotype Kilde
w; TubP-GAL80, FRT40, 27G CyO/05-FLP::PEST, kr.-GAL4, UAS-NGL; 9-9-GAL4, UAS-myr::tdTOM/TM6B Peng et al., 2018
w; FRT40/CyO, Kr-GAL4, UAS-normal god landbrugspraksis; UAS-H2A-NORMAL GOD LANDBRUGSPRAKSIS/TM6B Peng et al., 2018

Tabel 1: Genotyper af fluer i Kors.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol er enkel og ikke teknisk vanskeligt at udføre, men der er flere nøglen skridt, hvis overset vil medføre en betydelig reduktion i cellulære udbytte. (Trin 2.3.2.) Det er afgørende at kors er sund, og at maden ikke tørre ud. Regelmæssig vanding af krydser er vigtigt at maksimere antallet af fluer dissektioner, der er af den rigtige genotype og på den korrekte udviklingstrin. Hvor ofte krydser skal vandes vil variere afhængigt af maden bruges og boligforhold af fluer. At sikre krydser ikke tørre ud, undersøge hætteglassene to gange om dagen og tilsæt vand i overensstemmelse hermed. (Trin 3.3.) Det er også vigtigt at samle dissekeret hjerner i en enkelt microtube, der skal bruges til dissociation, i modsætning til at have hver dissector bruger deres egne microtube og derefter efterfølgende pooling af prøver. Dette vil fjerne alle hjerner tabt fra overførsel mellem microtubes, som kan være betydelige. (Trin 3.4.9.) Når pipettering op og ned for at manuelt forstyrrer væv, er det vigtigt at gøre det indtil ingen rester af væv er synlige med det blotte øje i suspensionen. Ufuldstændig væv forstyrrelser vil reducere antallet af enkelt celler, der kan sorteres via FACS, og dermed mindske cellulære udbytte.

De store begrænsning af cellulære udbytte er begyndt materiale. I denne forbindelse dissektioner er sats begrænsning af flere årsager: (1) dissociation protokollen kræver optik lapper at blive dissekeret ud af hovedet og adskilt fra de centrale hjernen, (2) at opnå væv på præcise tidspunkter under udviklingen af tid vindue til dissektioner skal være begrænset, (3) jo længere perioder mellem dissektioner og FACS, jo større chance for suboptimal celle sundhed og uspecifikke effekter på genekspression og genomiske organisation (dvs. jo kortere dissektion periode jo bedre). Tidsforbrug dissekere bør ændres for at opnå den ønskede mængde af materiale i den minimale mængde af tid. De fleste af de fejlfinding er udført i de pilotforsøg. Her er det afgørende at: optimere genetiske mærkning for lysstyrke og specificitet (figur 3), vurdere om en reproducerbar befolkning af celler af interesse er klart adskilt fra baggrunden celler i FACS parceller (figur 4), bestemme den antallet af hjernen, der har brug for at blive dissekeret for at opnå en tilstrækkelig mængde af materiale for efterfølgende ansøgninger (Se trin 1. Flyve arbejde), og bestemme den minimale mængde af tid til at dissekere det passende antal hjerner.

De store fremskridt i denne protokol er at det giver mulighed for effektiv isolering af lav rigelige celler til transkriptom og genomisk applikationer, forbedre følsomhed betydeligt over vores tidligere metode6. Baseret på vores skøn, kan fluorescently mærket populationer bestående af færre end 100 celler pr. optik lap isoleres effektivt for RNA-seq analyser. Dette giver transkriptom og genomisk analyser skal anvendes i genetiske mosaik eksperimenter, hvori delmængder af celler af bestemte typer genetisk manipuleret i en ellers normal baggrund. Dette er et afgørende skridt fremad, som sådanne forsøg er afgørende for bestemmelse af celle autonome og ikke-selvstændige genet funktioner i komplekse væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Denne forskning er finansieret af NINDS af National Institutes of Health under award nummer K01NS094545, andgrants fra byens Lefler for undersøgelse af Neurodegenerative sygdomme. Vi anerkender kalkning Tan og Jason McEwan for værdifulde samtaler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liberase TM Roche 5401127001 Proteolytic enzyme blend
NaCl Sigma-Aldrich S3014
KCl Sigma-Aldrich P9541
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich  S5761
Glucose Sigma-Aldrich G0350500
L-Glutathione Sigma-Aldrich G6013
Heat Inactivated Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135
Insulin Solution Sigma-Aldrich I0516
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513
Penicillin-Streptomycin Solution Sigma-Aldrich P4458
Schneider's Culture Medium Gibco 21720024
Papain Worthington LK003178
2-Mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA purification kit
RNase-free DNase Qiagen 79254
SuperScript II Reverse Transcriptase Life Technologies 18064-014
dNTP Mix Life Technologies R0191
MgCl2 Solution Sigma-Aldrich M1028-10X1ML
Betaine Solution Sigma-Aldrich B0300-1VL
RNaseOUT Life Technologies 10777-019
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix New England Biolabs M0492S
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004
Nextera XT DNA Library Prepration Kit Illumina FC-131-1024
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-1001
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap Falcon 352235
Bottle-Top Vacuum Filter Systems Corning CLS431153
ThermoMixer F1.5 Eppendorf 5384000020
FACSAria Flow Cytometer BD Biosciences 656700
HiSeq 2500 Sequencing System Illumina SY–401–2501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
  2. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  3. Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
  4. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
  5. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  6. Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
  7. Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
  8. Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
  9. Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
  10. Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
  11. Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
  12. Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
  13. Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
  14. Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
  15. Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
  16. Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
  17. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  18. Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).

Tags

Genetik sag 139 Drosophila visuelle system optik lap neuroner celle dissociation FACS RNA-sekventering MARCM genetiske mosaik lav overflod
Rensning af lav-rigelige celler i Drosophila visuelle System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peng, J., Santiago, I. J., Pecot, M. … More

Peng, J., Santiago, I. J., Pecot, M. Y. Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System. J. Vis. Exp. (139), e58474, doi:10.3791/58474 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter