在这里, 我们提出了一个协议, 用于生产和临床前测试小鼠 CD19 汽车 T 细胞的逆转录病毒转导和利用, 作为一种治疗同源 A20 B 细胞淋巴瘤在 BALB/c 鼠有或没有 lymphodepleting预调理。
CD19 嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞疗法的惊人临床成功导致了两个第二代嵌合抗原受体 (汽车) 对急性淋巴细胞白血病 (ALL) 和非-霍奇金淋巴瘤 (NHL) 的批准。目前, 该领域的重点是在其他血液恶性肿瘤中效仿这些成功, 而观察到的完全反应率不那么显著。进一步工程的汽车 T 细胞或其他治疗方式的联合管理可能成功地克服障碍, 成功治疗其他癌症设置。
因此, 我们提出了一个模型, 其他人可以进行 CD19 汽车 T 细胞的临床前测试。结果在这个测试良好的 B 细胞淋巴瘤模型可能是信息汽车 T 细胞治疗一般。
该协议允许通过 MP71 反转录病毒构造和 pCL-生态包装质粒, 然后收集分泌的逆转录病毒微粒, 通过磷酸钙转染生产小鼠汽车 T 细胞, 并用重组人纤维连接蛋白片段和离心进行转导。此外, 通过流式细胞术、luminometry 和酶联免疫吸附法 (ELISA) 的应用, 验证了逆转录病毒转导的有效性, 并证实了汽车 T 细胞在体内杀死靶淋巴瘤细胞的能力。
介绍了 lymphoreplete 和 lymphodepleted 同源小鼠体内检测汽车 T 细胞的实验方案, 建立了系统淋巴瘤。抗癌活动由体内生物发光和疾病进展监测。我们展示了根除建立的 B 细胞淋巴瘤的典型结果, 当利用 1st或 2nd一代汽车结合 lymphodepleting 预调理和少数小鼠实现长期减免时, 利用汽车 Tlymphoreplete 小鼠 IL-12 表达的细胞。
这些协议可用于评估 CD19 汽车 t 细胞与不同的额外修改, 组合的汽车 t 细胞和其他治疗剂或适应使用汽车 t 细胞对不同的靶抗原。
嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞治疗已显示惊人的临床成功治疗 CD19+恶性肿瘤导致 tisagenlecleucel 复发性急性淋巴细胞白血病1和 axicabtagene 的批准ciloleucel2在2017年的累进大 B 细胞非霍奇金淋巴瘤。
癌症和免疫系统在疾病进展和治疗机制中相互作用的重要性日益得到承认3,4,5。例如, 很好地记录了肿瘤微环境 (TME) 充斥着可以抑制免疫细胞6、7、8的效应函数的因素。另外, 内源免疫细胞的启动和表位的传播可以是根除肿瘤和长期抵抗肿瘤挑战的关键9,10。这两种现象都不能在缺乏免疫系统的异种模型中得到评价。同样, 使用转基因蛋白质的系统不能准确地反映出11、12的表位分布所需的破坏免疫耐受的挑战。因此, 一个具有完全功能免疫系统的同源模型对于模拟癌症疾病进展和免疫治疗的这些重要方面至关重要。
汽车 T 细胞治疗的一个重要的警告是, lymphodepleting 预调理是必需的治疗成功13,14。这通常是在患者通过管理化疗之前, 输液的汽车 T 细胞15,16。作为一种标准方法, 为了模拟患者设置中使用的 lymphodepletion, 我们在治疗性汽车 T 细胞对 A20 B 细胞淋巴瘤的小鼠进行管理之前, 对其进行5的全身照射 (TBI), 以达到 lymphodepletion。
虽然 lymphodepleting 预调理不是一个问题, 对大多数患者来说, 化疗药物带来的毒性意味着低性能状态的患者不符合汽车 T 细胞治疗的资格。为了创建一个测试系统, 代表不符合 lymphodepletion 的患者, 我们建立了一个 lymphoreplete 同源模型, 在其中我们模型汽车 T 细胞治疗淋巴瘤。在这个模型中, 我们表明, 从汽车 T 细胞内 IL-12 的分泌可能导致根除已建立的淋巴瘤, 成功率为 25%17。此外, 我们发现内源免疫细胞参与了根除癌症。
在这里, 我们详细描述了生产小鼠汽车 t 细胞的协议, 在同源小鼠中建立淋巴瘤, 以及用或不使用 lymphodepleting 预调理的汽车 T 细胞治疗淋巴瘤。这可以用于汽车 t 细胞与其他药物的组合研究, 测试汽车 t 细胞与其他转基因或使用其他领养细胞疗法或免疫治疗策略对抗淋巴瘤。
同源鼠标模型允许测试疾病进展和治疗, 同时保持完整的免疫系统。这是最重要的, 当涉及到治疗, 与免疫系统, 特别是免疫治疗剂的互动。
这里描述的协议有两个关键的工作流, 第一个是基因修改鼠标 T 细胞, 以表达汽车。这需要7天从启动到转导的验证。伴随着汽车 T 细胞的生产是小鼠全身性淋巴瘤的建立。如果汽车 T 细胞生产失败, 或质量不足, 通常没有足够的时间来生产替换细胞之前, 老鼠屈服于淋巴瘤。因此, 研究人员使用这些模型准确地执行肿瘤剂量和疾病进展研究, 以便成功地生产用于治疗管理的汽车 T 细胞是至关重要的。
低 T 细胞转导效率的典型原因包括生产者细胞的转染效率较差, 通常是由于质粒纯度差或转染培养基 pH 值不准确所致。建议检查生产者细胞转染的效率, 然后再进行完整的协议, 差转染将限制 T 细胞转导的效率。重组人纤维连接蛋白碎片可以收集和存储在-20 摄氏度, 以供重复使用, 然而, 多次冻结解冻导致转导效率降低。快速处理小鼠脾收集后, 也非常重要的是获得高产量的可行 T 细胞。
应该指出, 这里描述的协议使用 A20 细胞表达荧光素酶。这是首选, 因为它提供的能力, 测量系统肿瘤负担的生物发光成像。然而, 在功能性免疫系统的存在, 对荧光素酶的反应可能会扭曲结果。我们以前测试过存活的老鼠对标记转基因17的免疫反应。使用无转基因的 A20 细胞复制关键实验是关键, 以验证这些在免疫细胞根除肿瘤方面没有发挥重要作用。
虽然临床药物只能在免疫缺陷小鼠体内使用, 但使用小鼠汽车 T 细胞对抗小鼠癌细胞可以使我们评估免疫系统对治疗功效或疾病进展的贡献。该协议可用于针对 B 细胞淋巴瘤或其他汽车的临床前评估, 如 IL-12 的分泌物, 如下所述。必须指出的是, 虽然免疫细胞之间的相互作用可以在同源小鼠模型中进行评估, 但它们可能无法准确地重述人体体内的相互作用。特别值得注意的是, 人类和小鼠汽车的结构可能会有下游的后果;T 细胞生长的最佳活化和细胞培养条件不同20, 靶抗原表达的组织分布可能因人和小鼠而异, 有经验的毒性可能截然不同。因此, 必须利用体内和异种模型来证实结果。
总之, 淋巴瘤的同源 lymphodepleted 和 lymphoreplete 模型概括了没有事先化疗/放疗的患者。这提供了一个模型系统, 在其中模拟临床设置, 允许测试一系列的治疗策略, 这将是重要的新的免疫治疗剂的未来浪潮。
使用预调理, 将注意到所有的老鼠通常清除淋巴瘤。在人类中, 高达90% 的完整响应率, 这是代表。然而, CD19 汽车 T 细胞治疗的挑战将取决于防止经常 CD19 的复发的高频率。在这个模型中没有观察到复发, 而且通常超过100天。对模拟在临床上看到的复发的修改可以帮助 CD19 汽车 T 细胞治疗的未来挑战。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢 Bloodwise 资助这项研究 (赠款 13031) 和 CRUK 曼彻斯特生物资源单位, 成像和细胞术和分子生物学核心设施支持这项工作。
0.2 µm syringe filter | Appleton Woods | FC121 | |
0.45 µm syringe filter | Appleton Woods | FC122 | |
1.5ml pestle and microtube | VWR | 431-0098 | |
100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Gibco | 10378016 | |
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350–010 | |
Blasticidine S hydrochloride | Sigma- Aldrich | 15205 | |
Bottle Top Filter (0.2 µm) | Scientific Laboratory Supplies | FIL8192 | |
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100759 | 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7 |
Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100552 | 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5 |
Calcium chloride dihydrate | Sigma- Aldrich | C7902 | |
Cell counting beads – CountBright absolute counting beads | Molecular Probes | C36950 | |
Cell Strainer 100μm | VWR | 734-0004 | |
Cyclophosphamide Monohydrate | Merck | 239785-1GM | |
Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) – High Glucose | Sigma Aldrich | D6546 | |
Dynabeads | Gibco | 11131D | |
Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-03 | Sold by Sigma- Aldrich |
Flow cytometer – LSR Fortessa x20 | BD Biosciences | 658222R1 | |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
Haemacytometer | Appleton Woods | HC001 | |
HEPES solution | Sigma- Aldrich | H0887 | |
IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit | Invitrogen | 88-7121-76 | |
IL2, Proleukin | Novartis | PL 00101/0936 | |
in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system | Bruker | T149094 | |
Ionomycin Calcium Salt | Sigma- Aldrich | I0634 | |
Live/dead stain – Zombie Violet Fixable Viability Kit | BioLegend | 423114 | 1 in 100 staining dilution |
Luminometer – Lumistart Omega | BMG Labtech | 415-301 | |
Murine IFN-γ ELISA kit | Diaclone | 861.050.010 | |
Paraformaldehyde | Sigma- Aldrich | 16005 | |
pCL-Eco | Novus Biologicals | NBP229540 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma- Aldrich | P8139 | |
Platinum E cell line | Cell Biolabs | RV-101 | (RRID:CVCL_B488) |
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | Clone 37.51 |
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε | BD Biosciences | 553057 | Clone 145-2C11 |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2 |
Puromycin Dihydrochloride | Sigma- Aldrich | P8833 | |
Recombinant human fibronectin fragment – RetroNectin Reagent | TaKaRa | T100B | |
Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) | BioLegend | 577806 | |
Red cell lysis buffer | eBioscience | 004-4333-57 | |
RPMI 1640 Medium | Lonza | BE12-167F | |
Trypsin – EDTA solution | Sigma- Aldrich | T3924 | |
XenoLight D-Luciferin | Perkin Elmer | 122799 |