Vi præsenterer her, en protokol for produktion og præ-klinisk afprøvning af murine CD19 bil T celler af retroviral transduktion og udnyttelse som en terapi mod etablerede syngeneic A20 B-celle lymfom i BALB/c mus med eller uden lymphodepleting forudgående konditionering.
CD19 kimære antigen receptor (bil) T-celle terapi forbløffende kliniske succes har ført til godkendelse af to anden generation kimære antigen receptorer (biler) for akut lymfoblastær leukæmi (alle) og Hodgkin lymfom (NHL). Fokus for feltet er nu på at efterligne disse succeser i andre hematological maligniteter hvor mindre imponerende komplet responsrater overholdes. Yderligere engineering bil T-celler eller fælles administration af andre behandlingsmodaliteter kan med held overvinde hindringer for vellykkede terapi i andre kræft indstillinger.
Derfor præsenterer vi en model, som andre kan foretage præ-klinisk afprøvning af CD19 bil T-celler. Resultaterne i denne gennemtestede B-celle lymfom model er tilbøjelige til at være informative bil T-celle terapi i almindelighed.
Denne protokol giver reproducerbare produktion af musen bil T celler gennem calciumphosphat Transfektion af Plat-E producent celler med MP71 retroviral konstruktioner og pCL-Eco emballage plasmid efterfulgt af indsamling af udskilles retroviral partikler og transduktion ved hjælp af Rekombinante humane fibronektin fragment og centrifugering. Validering af retroviral transduktion, og bekræftelsen af evne til bil T-celler til at dræbe target lymfom celler ex vivo, ved hjælp af flowcytometri, luminometry og enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA), er også beskrevet.
Protokoller for at teste bilen T-celler i vivo i lymphoreplete og lymphodepleted syngeneic mus, forsynet med etablerede, systemisk lymfom er beskrevet. Anticancer aktivitet er overvåget af i vivo bioluminescens og sygdom progression. Vi viser typiske resultater af udryddelse af etablerede B-celle lymfom, når udnytte 1st eller 2nd generation biler i kombination med lymphodepleting før conditioning og et mindretal af mus at opnå langsigtet remissioner når udnytte bil T celler, der udtrykker IL-12 i lymphoreplete mus.
Disse protokoller kan bruges til at evaluere CD19 bil T celler med forskellige yderligere ændring, kombinationer af bil T-celler og andre terapeutiske agenter eller tilpasset til brug for bil T celler mod forskellige mål antigener.
Kimære antigen receptor (bil) T-celle terapi har vist forbløffende kliniske succes i behandlingen af CD19+ maligne sygdomme fører til godkendelse af tisagenlecleucel for recidiverende akut lymfoblastær leukæmi1 og axicabtagene ciloleucel for progressive store B-celle ikke Hodgkin lymfom2 i 2017.
Betydningen af samspillet mellem kræft og immunsystem i både sygdomsprogression og terapeutiske mekanismer bliver i stigende grad anerkendt3,4,5. For eksempel, er det veldokumenteret at tumor mikromiljø (TME) er oversvømmet med faktorer der kan undertrykke effektor funktion af immunceller6,7,8. Alternativt kan priming af endogene immunceller og epitop spredning være nøglen i tumor udryddelse og lang sigt modstand mod tumor udfordring9,10. Begge disse fænomener kan ikke evalueres i xenogene modeller, der mangler et immunsystem. Ligeledes afspejler systemer udnytter transgene proteiner ikke præcist udfordringen at bryde immuntolerance, hvilket er nødvendigt for epitop sprede11,12. En syngeneic model med et fuldt funktionelt immunsystem er derfor altafgørende for modellering disse vigtige aspekter af kræft sygdom progression og immun therapeutics.
En vigtig advarsel af bil T-celle terapi er, at lymphodepleting før conditioning er nødvendig for terapeutiske succes13,14. Dette opnås typisk i patienter ved administration af kemoterapi før infusion af bil T celler15,16. Som en standardmetode for at efterligne lymphodepletion anvendes i patient-indstillingen kan administrere vi 5 Gy kroppens samlede bestråling (TBI) at opnå lymphodepletion forud for dets indgift af terapeutiske bil T celler til mus forsynet med systemisk A20 B-celle lymfom.
Mens lymphodepleting pre conditioning ikke er et problem for fleste patienter, betyder toksicitet, der kommer med kemoterapeutika, at patienter med lav ydeevne status ikke er berettiget til bil T-celle terapi. For at skabe et testsystem, der repræsenterer patienter udelukket fra lymphodepletion, etablerede vi en lymphoreplete syngeneic musemodel, hvor vi model bil T-celle terapi af lymfom. I denne model, vi viste at sekretion af IL-12 fra inden for bil T celler kan føre til udryddelse af etablerede lymfom med en succesrate på ~ 25%17. Endvidere viste vi, at endogene immunceller var involveret i kræft udryddelse.
Her beskriver vi i detaljer af protokollen til produktion af musen bil T celler, oprettelse af lymfom i syngeneic mus, og behandling af lymfom med bil T celler med eller uden brug af lymphodepleting pre conditioning. Dette kan bruges til kombination undersøgelser af bil T celler med andre agenter, test bilen T celler med andre transgener eller andre adoptivforældre celle terapi eller immunterapi strategier mod lymfom.
Syngeneic musemodeller giver mulighed for afprøvning af sygdomsprogression og terapi samtidig opretholde en intakt immunsystemet. Det er altafgørende, når det kommer til behandlingsformer, der interagerer med immunsystemet og i særdeleshed for immunterapeutisk agenter.
Protokollen beskrevet her har to kritiske arbejdsstrømme, den ene er genetisk ændring af mus T celle for at udtrykke biler. Dette kræver 7 dage fra indledningen til validering af transduktion. Samtidig med produktion af bil T celler er oprettelsen af systemisk lymfom hos mus. Skal bilen T celle produktion mislykkes, eller kvalitet at være utilstrækkelig, der ikke er typisk nok tid til at producere udskiftning celler før mus bukke under for lymfom. Derfor er det afgørende, at forskere bruger disse modeller præcist udføre tumor dosering og sygdom progression undersøgelser for at med held tid produktion af bil T-celler til terapeutiske administration.
Typiske årsager til lav T-celle transduktion effektivitet omfatter dårlig Transfektion effektivitet af producent celler, typisk forårsaget af dårlig plasmid renhed eller unøjagtige bestemmelse af pH-værdien af Transfektion medier. Det anbefales at kontrollere effektiviteten af producent celle Transfektion inden vi går videre med den fulde protokol som fattige Transfektion vil begrænse effektiviteten af T-celle transduktion. Rekombinante humane fibronektin fragmenter kan indsamles og opbevares ved-20 ° C til genbrug, men flere fryse-smelter resultere i reducerede transduktion effektivitet. Hurtig behandling af musen milt efter samling er også vigtige for at opnå høje udbytter af levedygtige T celler.
Det skal bemærkes, at protokollen beskrevet her udnytter A20 celler udtrykker luciferase. Det foretrækkes, da det giver mulighed for at måle systemisk tumor byrde af bioluminescens billeddannelse. Men i nærværelse af en funktionel immunsystemet, svar til luciferase kunne skew resultaterne. Vi har tidligere testet immun reaktioner af overlevende mus markør transgener17. Det er nøglen til at replikere centrale eksperimenter ved hjælp af A20 celler gratis af transgener til at validere som disse ikke spiller en væsentlig rolle i tumor udryddelse af immunceller.
Mens kliniske agenter kan kun være brugt i vivo i immun-mangelfuld mus, tillader brug af mus bil T celler mod mus kræftceller os at vurdere bidragene fra immunsystemet til terapeutisk virkning eller sygdom progression. Denne protokol kunne udnyttes til præ-klinisk evaluering af biler målretning B-celle lymfom eller andre biler med yderligere ændringer såsom sekretion af IL-12 som beskrevet her. Det skal bemærkes, at selv om samspillet mellem immunceller kan evalueres i syngeneic musemodeller, ikke kan de præcist sammenfatte interaktion i mennesker i vivo. Især bemærke, menneskelige og mus biler vil variere i den struktur, der kan få downstream konsekvenser; optimal aktivering og celle kultur betingelser for vækst af T-celler er forskellige20, væv distribution af target antigen udtryk kan variere mellem mennesker og mus og erfarne toksicitet kan være radikalt anderledes. Det er derfor vigtigt at udnytte ex vivo og xenogene modeller til at underbygge resultater.
I Resumé sammenfatte syngeneic lymphodepleted og lymphoreplete model af lymfom patienter med og uden forudgående kemo/strålebehandling. Dette giver et modelsystem til at efterligne de kliniske indstillinger for at tillade afprøvning af en række terapeutiske strategier, der vil være vigtigt med den kommende bølge af nye immun terapi agenter.
Med brugen af forudgående konditionering, vil det bemærkes, at alle mus typisk klare lymfom. Med er op til 90% komplet svarprocenter i mennesker, dette repræsentativt. Dog udfordringer for CD19 bil T-celle terapi vil afhænge af, at forebygge den høje frekvens af tilbagefald observeret, der ofte CD19. Tilbagefald er ikke blevet observeret i denne model op til, og ofte mere end 100 dage. Ændringer til at efterligne tilbagefald ses i klinikken kunne hjælpe med de fremtidige udfordringer i CD19 bil T-celle terapi.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Bloodwise for finansieringen af denne forskning (grant 13031) og de CRUK Manchester biologiske resource enhed, billedbehandling og flowcytometri og molekylærbiologi core faciliteter til støtte for dette arbejde.
0.2 µm syringe filter | Appleton Woods | FC121 | |
0.45 µm syringe filter | Appleton Woods | FC122 | |
1.5ml pestle and microtube | VWR | 431-0098 | |
100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Gibco | 10378016 | |
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350–010 | |
Blasticidine S hydrochloride | Sigma- Aldrich | 15205 | |
Bottle Top Filter (0.2 µm) | Scientific Laboratory Supplies | FIL8192 | |
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100759 | 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7 |
Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100552 | 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5 |
Calcium chloride dihydrate | Sigma- Aldrich | C7902 | |
Cell counting beads – CountBright absolute counting beads | Molecular Probes | C36950 | |
Cell Strainer 100μm | VWR | 734-0004 | |
Cyclophosphamide Monohydrate | Merck | 239785-1GM | |
Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) – High Glucose | Sigma Aldrich | D6546 | |
Dynabeads | Gibco | 11131D | |
Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-03 | Sold by Sigma- Aldrich |
Flow cytometer – LSR Fortessa x20 | BD Biosciences | 658222R1 | |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
Haemacytometer | Appleton Woods | HC001 | |
HEPES solution | Sigma- Aldrich | H0887 | |
IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit | Invitrogen | 88-7121-76 | |
IL2, Proleukin | Novartis | PL 00101/0936 | |
in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system | Bruker | T149094 | |
Ionomycin Calcium Salt | Sigma- Aldrich | I0634 | |
Live/dead stain – Zombie Violet Fixable Viability Kit | BioLegend | 423114 | 1 in 100 staining dilution |
Luminometer – Lumistart Omega | BMG Labtech | 415-301 | |
Murine IFN-γ ELISA kit | Diaclone | 861.050.010 | |
Paraformaldehyde | Sigma- Aldrich | 16005 | |
pCL-Eco | Novus Biologicals | NBP229540 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma- Aldrich | P8139 | |
Platinum E cell line | Cell Biolabs | RV-101 | (RRID:CVCL_B488) |
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | Clone 37.51 |
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε | BD Biosciences | 553057 | Clone 145-2C11 |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2 |
Puromycin Dihydrochloride | Sigma- Aldrich | P8833 | |
Recombinant human fibronectin fragment – RetroNectin Reagent | TaKaRa | T100B | |
Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) | BioLegend | 577806 | |
Red cell lysis buffer | eBioscience | 004-4333-57 | |
RPMI 1640 Medium | Lonza | BE12-167F | |
Trypsin – EDTA solution | Sigma- Aldrich | T3924 | |
XenoLight D-Luciferin | Perkin Elmer | 122799 |