यहां, हम के उत्पादन और पूर्व नैदानिक परीक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान retroviral transduction द्वारा murine CD19 कार टी कोशिकाओं के रूप में स्थापित syngeneic A20 बी सेल लिंफोमा के खिलाफ एक चिकित्सा के रूप में बालब/सी चूहों के साथ या बिना lymphodepleting प्री कंडीशनिंग.
CD19 chimeric प्रतिजन रिसेप्टर (कार) टी सेल थेरेपी के आश्चर्यजनक नैदानिक सफलता तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया (सभी) andnon-Hodgkin लिंफोमा (NHL) के लिए दो दूसरी पीढ़ी chimeric प्रतिजन रिसेप्टर्स (कारों) के अनुमोदन के लिए नेतृत्व किया है । क्षेत्र का ध्यान अब अंय रक्त द्रोह में इन सफलताओं की नकल पर है, जहां कम प्रभावशाली पूर्ण प्रतिक्रिया दरों मनाया जाता है । इसके अलावा इंजीनियरिंग की कार टी कोशिकाओं या सह-प्रशासन के अंय उपचार रूपरेखा सफलतापूर्वक अंय कैंसर सेटिंग्स में सफल चिकित्सा के लिए बाधाओं को दूर कर सकते हैं ।
इसलिए हम एक मॉडल है जिसमें दूसरों CD19 कार टी कोशिकाओं के पूर्व नैदानिक परीक्षण आयोजित कर सकते है प्रस्तुत करते हैं । इस अच्छी तरह से परीक्षण बी सेल लिंफोमा मॉडल में परिणाम के लिए जानकारीपूर्ण कार टी सेल चिकित्सा सामांय होने की संभावना है ।
इस प्रोटोकॉल के माध्यम से माउस कार टी कोशिकाओं के reproducible उत्पादन की अनुमति देता है कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक के माध्यम से बेनी-E निर्माता कोशिकाओं के MP71 retroviral का निर्माण और pCL-पारिस्थितिकी पैकेजिंग प्लाज्मिड स्रावित retroviral कणों के संग्रह के बाद और रिकॉमबिनेंट मानव fibronectin टुकड़ा और केंद्रापसारक का उपयोग transduction । retroviral transduction का सत्यापन, और कार टी कोशिकाओं की क्षमता की पुष्टि करने के लिए लक्ष्य लिंफोमा कोशिकाओं को मारने के लिए पूर्व vivo, फ्लो cytometry, luminometry और एंजाइम से जुड़े immunosorbent (एलिसा) के उपयोग के माध्यम से भी वर्णित है ।
lymphoreplete और lymphodepleted syngeneic चूहों में vivo में कार टी कोशिकाओं के परीक्षण के लिए प्रोटोकॉल, स्थापित असर, प्रणालीगत लिंफोमा वर्णित हैं । एंटी कैंसर गतिविधि vivo bioluminescence और रोग प्रगति में द्वारा निगरानी की है । हम स्थापित बी सेल लिंफोमा के उंमूलन के विशिष्ट परिणाम दिखाने के लिए जब 1st या 2 lymphodepleting पूर्व कंडीशनिंग और लंबे समय तक छूट प्राप्त चूहों के एक अल्पसंख्यक के साथ संयोजन मेंएन डी पीढ़ी कारों का उपयोग जब कार टी का उपयोग lymphoreplete चूहों में आईएल-12 एक्सप्रेस कोशिकाओं.
इन प्रोटोकॉल अलग अतिरिक्त संशोधन के साथ CD19 कार टी कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, कार टी कोशिकाओं और अन्य चिकित्सीय एजेंटों के संयोजन या अलग लक्ष्य एंटीजन के खिलाफ कार टी कोशिकाओं के उपयोग के लिए अनुकूलित.
Chimeric प्रतिजन रिसेप्टर (कार) टी-सेल थेरेपी CD19 के उपचार में आश्चर्यजनक नैदानिक सफलता+ tisagenlecleucel के लिए चूक तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकीमिया1 और axicabtagene के लिए अग्रणी दुष्टता दिखाया गया है प्रगतिशील बड़े बी के लिए ciloleucel-सेल गैर-Hodgkin लिंफोमा2 २०१७ में ।
कैंसर और दोनों रोग प्रगति और चिकित्सीय तंत्र में प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच बातचीत के महत्व को तेजी से3,4,5मांयता प्राप्त होता जा रहा है । उदाहरण के लिए, यह अच्छी तरह से प्रलेखित है कि ट्यूमर microenvironment (टीएमई) कारकों है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं6,7,8के प्रभाव कार्यों को दबा सकते है के साथ अटा पड़ा है । वैकल्पिक रूप से अंतर्जात प्रतिरक्षा कोशिकाओं और epitope प्रसार की भड़काना ट्यूमर उंमूलन और ट्यूमर चैलेंज9,10के लिए दीर्घकालिक प्रतिरोध में महत्वपूर्ण हो सकता है । इन दोनों घटनाएं xenogeneic मॉडल है कि एक प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी में मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है । इसी तरह, ट्रांसजेनिक प्रोटीन का उपयोग प्रणालियों सही प्रतिरक्षा सहिष्णुता तोड़ने जो epitope के लिए आवश्यक है11,12प्रसार की चुनौती को प्रतिबिंबित नहीं करते । एक पूरी तरह कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ एक syngeneic मॉडल है, इसलिए, कैंसर रोग प्रगति और प्रतिरक्षा चिकित्सकीय के इन महत्वपूर्ण पहलुओं मॉडलिंग के लिए सर्वोपरि है ।
कार टी के एक महत्वपूर्ण चेतावनी-सेल थेरेपी है कि lymphodepleting पूर्व कंडीशनिंग चिकित्सकीय सफलता13,14के लिए आवश्यक है । यह आमतौर पर कार टी कोशिकाओं15,16के अर्क से पहले कीमोथेरेपी प्रशासन द्वारा रोगियों में प्राप्त की है । एक मानक विधि के रूप में, आदेश में रोगी की स्थापना में इस्तेमाल किया lymphodepletion नकल करने के लिए, हम 5 Gy कुल शरीर विकिरण (TBI) lymphodepletion प्राप्त करने के लिए चिकित्सा कार टी कोशिकाओं के प्रशासन के लिए पहले चूहों असर प्रणालीगत A20 बी-सेल लिंफोमा ।
जबकि lymphodepleting पूर्व कंडीशनिंग रोगियों के बहुमत के लिए एक मुद्दा नहीं है, विषाक्तता कि कीमोथेरेपी एजेंटों के साथ आता है मतलब है कि कम प्रदर्शन स्थिति के रोगियों कार टी सेल चिकित्सा के लिए पात्र नहीं हैं. एक परीक्षण प्रणाली है कि lymphodepletion के लिए अयोग्य रोगियों का प्रतिनिधित्व करता है बनाने के लिए, हम एक lymphoreplete syngeneic माउस मॉडल है जिसमें हम मॉडल कार टी-सेल लिंफोमा के थेरेपी की स्थापना की । इस मॉडल में, हमने दिखाया है कि कार टी कोशिकाओं के भीतर से IL-12 के स्राव ~ 25%17की एक सफलता दर के साथ स्थापित लिंफोमा के उंमूलन के लिए नेतृत्व कर सकता है । इसके अलावा, हमें पता चला कि अंतर्जात प्रतिरक्षा कोशिकाओं को कैंसर उंमूलन में शामिल थे ।
यहां हम विस्तार में वर्णन माउस कार टी कोशिकाओं के उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल, syngeneic चूहों में लिंफोमा की स्थापना, और के साथ या लिंफोमा के उपचार कार टी कोशिकाओं के साथ या lymphodepleting पूर्व के उपयोग के बिना कंडीशनिंग । यह अन्य एजेंटों के साथ कार टी कोशिकाओं के संयोजन के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, अन्य transgenes के साथ कार टी कोशिकाओं का परीक्षण या लिंफोमा के खिलाफ अन्य दत्तक सेल थेरेपी या immunotherapy रणनीतियों के उपयोग के लिए.
Syngeneic माउस मॉडल रोग प्रगति और चिकित्सा के परीक्षण की अनुमति है जबकि एक बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली को बनाए रखने । यह सर्वोपरि है जब यह चिकित्सा कि प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ और विशेष रूप से immunotherapeutic एजेंटों के लिए बातचीत करने के लिए आता है ।
प्रोटोकॉल यहां वर्णित दो महत्वपूर्ण काम धाराओं है, पहले एक आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस टी सेल के लिए कारों एक्सप्रेस है । इस transduction के सत्यापन के लिए दीक्षा से 7 दिन की आवश्यकता है । कार टी कोशिकाओं के उत्पादन के साथ सहवर्ती चूहों में प्रणालीगत लिंफोमा की स्थापना है । कार टी सेल उत्पादन में विफल होना चाहिए, या गुणवत्ता अपर्याप्त जा रहा है, वहां आम तौर पर पर्याप्त समय के प्रतिस्थापन कोशिकाओं का उत्पादन करने से पहले चूहों लिंफोमा का शिकार नहीं है । इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि शोधकर्ताओं ने इन मॉडलों का उपयोग सही ट्यूमर खुराक और रोग प्रगति अध्ययन करने के क्रम में सफलतापूर्वक चिकित्सकीय प्रशासन के लिए कार टी कोशिकाओं के उत्पादन के लिए समय है ।
कम टी के लिए विशिष्ट कारण-सेल transduction क्षमता उत्पादक कोशिकाओं के गरीब अभिकर्मक दक्षता, आम तौर पर गरीब प्लाज्मिड शुद्धता या अभिकर्मक मीडिया के पीएच के गलत निर्धारण के कारण होता है शामिल हैं । यह पूर्ण प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले निर्माता सेल अभिकर्मक की दक्षता की जांच करने के लिए सिफारिश की है के रूप में गरीब अभिकर्मक टी सेल transduction की क्षमता को सीमित करेगा । रिकॉमबिनेंट मानव fibronectin टुकड़े एकत्र किया जा सकता है और पुन: उपयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, हालांकि, कम transduction क्षमता में कई फ्रीज-गल परिणाम । वसूली के बाद माउस तिल्ली के स्विफ्ट प्रसंस्करण भी व्यवहार्य टी कोशिकाओं की उच्च पैदावार प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल A20 luciferase व्यक्त कोशिकाओं का इस्तेमाल करता है । यह bioluminescence इमेजिंग द्वारा प्रणालीगत ट्यूमर बोझ को मापने की क्षमता प्रदान करता है के रूप में पसंद किया जाता है. हालांकि, एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली की उपस्थिति में, luciferase प्रतिक्रियाओं परिणाम विषम सकता है । हम पहले transgenes17मार्कर के लिए चूहों जीवित की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का परीक्षण किया है । यह महत्वपूर्ण है A20 कोशिकाओं transgenes से मुक्त का उपयोग करने के लिए मांय है कि इन प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा ट्यूमर उंमूलन में एक महत्वपूर्ण भूमिका नहीं निभाने के प्रयोग को दोहराने की कुंजी है ।
जबकि नैदानिक एजेंटों केवल vivo में प्रतिरक्षा की कमी चूहों में इस्तेमाल किया जा सकता है, माउस कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ माउस कार टी कोशिकाओं का उपयोग हमें चिकित्सीय प्रभावकारिता या रोग प्रगति के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली के योगदान का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल पूर्व के लिए उपयोग किया जा सकता है बी-सेल लिंफोमा या ऐसे आईएल के स्राव के रूप में अतिरिक्त संशोधनों के साथ अंय कारों को लक्षित कारों के नैदानिक मूल्यांकन-12 के रूप में यहां वर्णित है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यद्यपि प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच परस्पर क्रिया syngeneic माउस मॉडलों में मूल्यांकन किया जा सकता है, वे सही नहीं हो सकता है vivo मेंमनुष्य में बातचीत दोहराऊंगा । विशेष रूप से ध्यान दें, मानव और माउस कारों संरचना जो बहाव के परिणाम हो सकता है में भिंन होगा; टी कोशिकाओं के विकास के लिए इष्टतम सक्रियण और सेल संस्कृति की स्थिति अलग20हैं, लक्ष्य प्रतिजन अभिव्यक्ति के ऊतक वितरण मनुष्यों और चूहों के बीच भिन्न हो सकते हैं और अनुभवी विषाक्तता मौलिक अलग हो सकता है । यह इसलिए पुष्ट परिणाम के लिए पूर्व vivo और xenogeneic मॉडल का उपयोग करने के लिए आवश्यक है ।
सारांश में, syngeneic lymphodepleted और lymphoreplete मॉडल के साथ लिंफोमा दोहराऊंगा रोगियों और बिना पूर्व chemo/ यह एक मॉडल प्रणाली है जिसमें नैदानिक सेटिंग्स की नकल करने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों कि नई प्रतिरक्षा चिकित्सा एजेंटों के आने की लहर के साथ महत्वपूर्ण होगा की एक श्रृंखला के परीक्षण की अनुमति प्रदान करता है ।
पूर्व कंडीशनिंग के उपयोग के साथ, यह ध्यान दिया जाएगा कि सभी चूहों आमतौर पर लिंफोमा स्पष्ट । मनुष्यों में ९०% पूर्ण प्रतिक्रिया दरों के साथ, यह प्रतिनिधि है । हालांकि, CD19 कार टी सेल थेरेपी के लिए चुनौतियां पलटा हुआ है कि अक्सर CD19 है की उच्च आवृत्ति को रोकने पर टिका होगा । पलटा इस मॉडल में नहीं देखा गया है अप करने के लिए, और अक्सर १०० दिनों से परे । क्लीनिक में देखा पलटा नकल करने के लिए संशोधनों CD19 कार टी सेल थेरेपी के भविष्य की चुनौतियों के साथ मदद कर सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
हम इस अनुसंधान (अनुदान १३०३१) और इस काम के समर्थन के लिए CRUK मैनचेस्टर जैविक संसाधन इकाई, इमेजिंग और cytometry और आणविक जीवविज्ञान कोर सुविधाओं के वित्तपोषण के लिए Bloodwise शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
0.2 µm syringe filter | Appleton Woods | FC121 | |
0.45 µm syringe filter | Appleton Woods | FC122 | |
1.5ml pestle and microtube | VWR | 431-0098 | |
100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Gibco | 10378016 | |
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350–010 | |
Blasticidine S hydrochloride | Sigma- Aldrich | 15205 | |
Bottle Top Filter (0.2 µm) | Scientific Laboratory Supplies | FIL8192 | |
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100759 | 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7 |
Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100552 | 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5 |
Calcium chloride dihydrate | Sigma- Aldrich | C7902 | |
Cell counting beads – CountBright absolute counting beads | Molecular Probes | C36950 | |
Cell Strainer 100μm | VWR | 734-0004 | |
Cyclophosphamide Monohydrate | Merck | 239785-1GM | |
Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) – High Glucose | Sigma Aldrich | D6546 | |
Dynabeads | Gibco | 11131D | |
Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-03 | Sold by Sigma- Aldrich |
Flow cytometer – LSR Fortessa x20 | BD Biosciences | 658222R1 | |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
Haemacytometer | Appleton Woods | HC001 | |
HEPES solution | Sigma- Aldrich | H0887 | |
IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit | Invitrogen | 88-7121-76 | |
IL2, Proleukin | Novartis | PL 00101/0936 | |
in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system | Bruker | T149094 | |
Ionomycin Calcium Salt | Sigma- Aldrich | I0634 | |
Live/dead stain – Zombie Violet Fixable Viability Kit | BioLegend | 423114 | 1 in 100 staining dilution |
Luminometer – Lumistart Omega | BMG Labtech | 415-301 | |
Murine IFN-γ ELISA kit | Diaclone | 861.050.010 | |
Paraformaldehyde | Sigma- Aldrich | 16005 | |
pCL-Eco | Novus Biologicals | NBP229540 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma- Aldrich | P8139 | |
Platinum E cell line | Cell Biolabs | RV-101 | (RRID:CVCL_B488) |
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | Clone 37.51 |
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε | BD Biosciences | 553057 | Clone 145-2C11 |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2 |
Puromycin Dihydrochloride | Sigma- Aldrich | P8833 | |
Recombinant human fibronectin fragment – RetroNectin Reagent | TaKaRa | T100B | |
Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) | BioLegend | 577806 | |
Red cell lysis buffer | eBioscience | 004-4333-57 | |
RPMI 1640 Medium | Lonza | BE12-167F | |
Trypsin – EDTA solution | Sigma- Aldrich | T3924 | |
XenoLight D-Luciferin | Perkin Elmer | 122799 |