Her presenterer vi en protokoll for produksjon og pre-klinisk testing av murine CD19 bil T celler ved retroviral signaltransduksjon og utnyttelse som en behandling mot etablerte syngeneic A20 B-celle lymfom i BALB/c mus med eller uten lymphodepleting pre condition.
Forbløffende klinisk suksessen av CD19 chimeric antigen reseptor (bil) T-celle terapi har ført til godkjenning av to andre generasjon chimeric antigen reseptorer (biler) for akutt lymfatisk leukemi (alle) andnon-Hodgkin lymfom (NHL). Fokus for feltet er nå på emulere disse suksessene i andre Hematologisk malignitet der mindre imponerende komplett svarprosenten er observert. Videre prosjektering av bilen T celler eller co administrasjon for andre behandlingsmåter kan med hell overvinne hindringer for vellykket behandling i andre kreft innstillinger.
Derfor presenterer vi en modell der andre kan utføre pre-klinisk testing av CD19 bil T celler. Resultatene i denne godt B-celle lymfom modellen er sannsynlig å være informativ bil T-cellen terapi generelt.
Denne protokollen tillater reproduserbar produksjon av mus bilen T celler gjennom kalsium fosfat transfection Plat-E produsent celler med MP71 retroviral konstruksjoner og pCL-Eco emballasje plasmider etterfulgt av samling av utskilles retroviral partikler og signaltransduksjon rekombinant menneskelige fibronectin fragment og sentrifugering. Validering av retroviral signaltransduksjon, og bekreftelse av at bilen T celler å drepe målet lymfom celler ex vivo, bruk av flowcytometri, luminometry og enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA), er også beskrevet.
Protokoller for å teste bilen T celler i vivo i lymphoreplete og lymphodepleted syngeneic mus, bærer etablerte, systemisk lymfom beskrives. Anti-kreft aktivitet overvåkes av i vivo bioluminescens og sykdom progresjon. Vi viser typiske resultater av fjerning av etablerte B-celle lymfom når utnytte 1st eller 2nd generasjon biler i kombinasjon lymphodepleting før og et mindretall av mus oppnår langsiktige remissions når benytter bilen T celler uttrykke IL-12 i lymphoreplete mus.
Disse protokollene kan brukes til å evaluere CD19 bil T-celler med forskjellige ytterligere modifisering, kombinasjoner av bil T celler og andre terapeutiske agenter eller tilpasset for bruk av bil T-celler mot ulike antigener.
Chimeric antigen reseptor (bil) T-cellen terapi har vist forbløffende klinisk suksess i behandling av CD19+ malignitet fører til godkjennelse av tisagenlecleucel for tilbakefall akutt lymfatisk leukemi1 og axicabtagene ciloleucel for progressiv stor B-celle non-Hodgkins lymfom2 i 2017.
Betydningen av samspillet mellom kreft og immunsystemet i både sykdomsprogresjon og terapeutiske mekanismer blir stadig mer anerkjent3,4,5. For eksempel, er det godt dokumentert at svulsten microenvironment (TME) er full av faktorer som kan undertrykke funksjoner effektor av immunceller6,7,8. Alternativt kan fylling av endogene immunceller og epitope spre inntaste svulst fjerning og langsiktig motstand mot svulst challenge9,10. Begge disse fenomenene kan ikke evalueres i xenogeneic modeller som mangler en immun system. Likeledes gjenspeiler systemer som utnytter transgene proteiner ikke nøyaktig utfordringen med å bryte immun toleranse som kreves for epitope spre11,12. En syngeneic modell med en fullt fungerende immunsystem er derfor avgjørende for modellering disse viktige aspekter av kreft sykdom progresjon og immun therapeutics.
En viktig påminnelse av bilen T-cellen terapi er at lymphodepleting før condition kreves for terapeutisk suksess13,14. Dette oppnås vanligvis hos pasienter ved å tilsette kjemoterapi før infusjonen bil T celler15,16. Som standard, for å etterligne lymphodepletion brukes i innstillingen pasienten administrere vi 5 Gy hele kroppen bestråling (TBI) å oppnå lymphodepletion før administrasjon av terapeutiske bil T-celler til mus bærer systemiske A20 B-celle lymfom.
Lymphodepleting før condition er ikke et problem for fleste pasienter, betyr toksisitet som følger med chemotherapeutic agenter at pasienter med lav ytelse ikke er kvalifisert for bil T-cellen terapi. Hvis du vil opprette en test som representerer pasientene ikke berettiget til lymphodepletion, etablerte vi en lymphoreplete syngeneic musemodell der vi modell bil T-cellen terapi lymfom. I denne modellen vi viste at utskillelsen av IL-12 fra i bilen T celler kan føre til utryddelse av etablerte lymfom med en suksessrate på ~ 25%17. Videre viste vi at endogene immunceller var involvert i kreft utrydding.
Her beskrive vi i detalj protokollen for produksjon av mus bilen T celler, etablere lymfom i syngeneic mus og behandling av lymfom med bil T-celler med eller uten bruk av lymphodepleting før condition. Dette kan brukes for kombinasjon studier av bilen T-celler med andre agenter, teste bilen T-celler med andre effekter av transgener eller bruk av andre adoptivforeldre cellen terapi eller immunterapi strategier mot lymfom.
Syngeneic musen modeller kan testing av sykdomsprogresjon og terapi samtidig opprettholde et intakt immunforsvar. Dette er viktig når det gjelder behandling som samhandler med immunsystemet og spesielt for immunterapeutisk agenter.
Protokollen beskrevet her har to viktige arbeidsflyter, den første som er genetisk modifisere musen T celle for å uttrykke biler. Dette krever 7 dager fra initiering til validering av signaltransduksjon. Samtidig med produksjon av bilen T celler er etableringen av systemisk lymphoma i mus. Bør bil T celleproduksjon mislykkes eller kvalitet å være utilstrekkelig, det ikke er vanligvis nok tid til å produsere erstatte celler før mus la lymfom. Det er derfor viktig at forskere bruker disse modellene nøyaktig utføre svulst dosering og sykdom progresjon studier for å vellykket tid produksjonen av bilen T celler for terapeutisk administrasjon.
Vanlige årsaker til lav T-celle signaltransduksjon effektivitet inkluderer dårlig transfection effektiviteten av produsent celler, vanligvis forårsaket av dårlig plasmider renhet eller unøyaktig fastsettelse av pH i hva media. Det anbefales å sjekke effektiviteten av produsent celle transfection før du fortsetter med full protokollen som dårlig transfection vil begrense effektiviteten av T-celle signaltransduksjon. Rekombinant menneskelige fibronectin fragmenter kan samles og lagres på 20 ° C for gjenbruk, men flere fryse-thaws resulterer i redusert signaltransduksjon effektivitet. Rask behandling av musen spleens etter collection er også viktig for å oppnå høy gir av levedyktig T-celler.
Det bør bemerkes at protokollen beskrevet her benytter A20 celler uttrykke luciferase. Dette er foretrukket som det gir muligheten til å måle systemisk svulst byrden av bioluminescens tenkelig. Men i nærvær av en funksjonell immunsystemet, kan Svar å luciferase forskyve resultatene. Vi har tidligere testet immunreaksjoner overlevende mus markør effekter av transgener17. Det er nøkkelen å gjenskape nøkkel eksperimenter ved hjelp av A20 celler gratis effekter av transgener til å validere at dette ikke spille en betydelig rolle i svulst fjerning av immunceller.
Mens klinisk agenter kan bare brukes i vivo i immun mangelfull mus, tillater bruk av mus bilen T-celler mot musen kreftceller oss å vurdere bidrag av immunsystemet til terapeutisk effekt eller sykdom progresjon. Denne protokollen kunne brukes for pre-klinisk vurdering av biler målretting B-celle lymfom eller andre biler med ytterligere endringer som utskillelsen av IL-12 som beskrevet her. Det må bemerkes at selv om samspillet mellom immunceller kan evalueres i syngeneic musen modeller, de ikke kan nøyaktig er recapitulate samhandling i mennesker i vivo. Spesielt oppmerksom på menneskelige og mus biler vil variere i strukturen som kan ha nedstrøms konsekvenser; optimale aktivisering og celle kultur forhold for vekst av T-celler er forskjellige20, vev distribusjon av antigen måluttrykk kan variere mellom mennesker og mus og erfarne toksisitet kan være radikalt forskjellige. Derfor er det viktig å benytte ex vivo og xenogeneic modeller for å bekrefte resultatene.
I sammendraget recapitulate syngeneic lymphodepleted og lymphoreplete modell lymfom pasienter med og uten forutgående kjemoterapi/strålebehandling. Dette gir et modellsystem å etterligne de kliniske for å tillate testing av en rekke strategier som vil være viktige med den kommende bølgen av nye immun terapi agenter.
Med bruk av pre condition, vil det bemerkes at alle mus vanligvis fjerner lymfekreft. Med er opptil 90% fullført svarprosenten hos mennesker, dette representant. Men utfordringene for CD19 bil T-celle terapi vil hengslene på forebygging av den høye frekvensen av relapses observert som ofte CD19. Relapses har ikke vært observert i denne modellen til, og ofte utover 100 dager. Modifikasjoner å etterligne relapses sett i klinikken kunne hjelpe med fremtidige utfordringer CD19 bil T-cellen terapi.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Bloodwise for denne forskningen (grant 13031) og CRUK Manchester biologiske ressurs enhet, bildebehandling og cytometri og molekylærbiologi kjernen fasiliteter for å støtte dette arbeidet.
0.2 µm syringe filter | Appleton Woods | FC121 | |
0.45 µm syringe filter | Appleton Woods | FC122 | |
1.5ml pestle and microtube | VWR | 431-0098 | |
100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Gibco | 10378016 | |
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350–010 | |
Blasticidine S hydrochloride | Sigma- Aldrich | 15205 | |
Bottle Top Filter (0.2 µm) | Scientific Laboratory Supplies | FIL8192 | |
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100759 | 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7 |
Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100552 | 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5 |
Calcium chloride dihydrate | Sigma- Aldrich | C7902 | |
Cell counting beads – CountBright absolute counting beads | Molecular Probes | C36950 | |
Cell Strainer 100μm | VWR | 734-0004 | |
Cyclophosphamide Monohydrate | Merck | 239785-1GM | |
Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) – High Glucose | Sigma Aldrich | D6546 | |
Dynabeads | Gibco | 11131D | |
Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-03 | Sold by Sigma- Aldrich |
Flow cytometer – LSR Fortessa x20 | BD Biosciences | 658222R1 | |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
Haemacytometer | Appleton Woods | HC001 | |
HEPES solution | Sigma- Aldrich | H0887 | |
IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit | Invitrogen | 88-7121-76 | |
IL2, Proleukin | Novartis | PL 00101/0936 | |
in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system | Bruker | T149094 | |
Ionomycin Calcium Salt | Sigma- Aldrich | I0634 | |
Live/dead stain – Zombie Violet Fixable Viability Kit | BioLegend | 423114 | 1 in 100 staining dilution |
Luminometer – Lumistart Omega | BMG Labtech | 415-301 | |
Murine IFN-γ ELISA kit | Diaclone | 861.050.010 | |
Paraformaldehyde | Sigma- Aldrich | 16005 | |
pCL-Eco | Novus Biologicals | NBP229540 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma- Aldrich | P8139 | |
Platinum E cell line | Cell Biolabs | RV-101 | (RRID:CVCL_B488) |
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | Clone 37.51 |
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε | BD Biosciences | 553057 | Clone 145-2C11 |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2 |
Puromycin Dihydrochloride | Sigma- Aldrich | P8833 | |
Recombinant human fibronectin fragment – RetroNectin Reagent | TaKaRa | T100B | |
Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) | BioLegend | 577806 | |
Red cell lysis buffer | eBioscience | 004-4333-57 | |
RPMI 1640 Medium | Lonza | BE12-167F | |
Trypsin – EDTA solution | Sigma- Aldrich | T3924 | |
XenoLight D-Luciferin | Perkin Elmer | 122799 |