Här presenterar vi ett protokoll för produktion och prekliniska test av murina CD19 CAR T-celler av retrovirala transduktion och utilization som en terapi mot etablerade syngena A20 B-cells lymfom hos BALB/c-möss med eller utan lymphodepleting förkonditionering.
Den häpnadsväckande klinisk framgången av CD19 chimära antigen receptorn (bil) T-cell terapi har lett till godkännande av två andra generationens chimära antigen receptorer (bilar) för akut lymfatisk leukemi (ALL) andnon-Hodgkin lymfom (NHL). Fokus för fältet är nu på efterlikna dessa framgångar i andra hematologiska maligniteter där mindre imponerande komplett svarsfrekvens observeras. Ytterligare tekniska CAR T-celler eller samtidig administrering av andra behandlingsmetoder kan lyckas övervinna hinder för framgångsrik terapi i andra cancer inställningar.
Vi presenterar därför en modell där andra kan genomföra prekliniska tester av CD19 CAR T-celler. Resultaten i denna väl testade B-cells lymfom modell är sannolikt att vara informativ bil T-cell terapi i allmänhet.
Detta protokoll tillåter reproducerbara produktion av mus CAR T-celler genom kalciumfosfat transfection Plat-E producent celler med MP71 retrovirala konstruktioner och pCL-Eco förpackning plasmid följt av samlingen utsöndrade retrovirala partiklar och transduktion med hjälp av rekombinant human Fibronektin fragment och centrifugering. Validering av retrovirala transduktion, och bekräftelse av bil T cellernas förmåga att döda mål lymfom celler ex vivo, med hjälp av flödescytometri, luminometry och enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), beskrivs också.
Protokoll för provning CAR T-celler i vivo i lymphoreplete och lymphodepleted syngena möss, med etablerade, systemisk lymfom beskrivs. Anti cancer verksamhet övervakas av i vivo Mareld och sjukdom progression. Vi visar typiska resultat av utrotning av etablerade B-cells lymfom när utnyttja 1st eller 2nd generation bilar i kombination med lymphodepleting förkonditioneringen och en minoritet av möss att uppnå långsiktiga remissioner när utnyttja bil T celler som uttrycker IL-12 i lymphoreplete möss.
Dessa protokoll kan användas för att utvärdera CD19 CAR T-celler med olika ytterligare modifiering, kombinationer av CAR T-celler och andra terapeutiska medel eller anpassats för användning av CAR T-celler mot olika mål antigener.
Chimära antigen receptorn (bil) T-cell terapi har visat häpnadsväckande klinisk framgång vid behandling av CD19+ maligniteter leder till godkännande av tisagenlecleucel för recidiverande akut lymfoblastisk leukemi1 och axicabtagene ciloleucel för progressiv stora B-cells non-Hodgkins lymfom2 2017.
Betydelsen av interaktioner mellan cancer och immunsystemet i både sjukdomsprogression och terapeutiska mekanismer blir allt mer erkänd3,4,5. Till exempel är det väl dokumenterat att den tumör närmiljön (TME) är full med faktorer som kan dämpa de effektor funktionerna av immunceller6,7,8. Priming av endogena immunceller och epitop sprida kan alternativt vara nyckeln i tumör utrotning och långsiktiga motstånd mot tumören challenge9,10. Båda dessa fenomen kan inte utvärderas i xenogena modeller som saknar ett immunförsvar. Jämväl, system utnyttja transgen proteiner inte korrekt återspeglar utmaningen att bryta immuntolerans som krävs för epitop sprida11,12. En syngena modell med en fullt fungerande immunförsvar är därför avgörande för modellering dessa viktiga aspekter av cancer sjukdom progression och immunförsvaret therapeutics.
Ett viktigt förbehåll av bil T-cell terapi är att lymphodepleting förkonditioneringen krävs för terapeutisk framgång13,14. Detta uppnås vanligtvis hos patienter genom att administrera kemoterapi före infusion bil T celler15,16. Som standard metod, för att efterlikna lymphodepletion används i patientens inställning administrera vi 5 Gy kroppens totala bestrålning (TBI) för att uppnå lymphodepletion före administrering av terapeutiska CAR T-celler till möss med systemisk A20 B-cellslymfom.
Lymphodepleting förkonditioneringen är inte en fråga för flesta patienter, innebär toxicitet som kommer med kemoterapeutika att patienter med låg prestandastatus inte är berättigade för bil T-cell terapi. För att skapa ett testsystem som representerar patienterna som är berättigade till lymphodepletion, etablerade vi en lymphoreplete syngena musmodell där vi modell bil T-cell terapi av lymfom. I denna modell, vi har visat att utsöndringen av IL-12 från inom CAR T-celler kan leda till utrotning av etablerade lymfom med en framgång på ~ 25%17. Dessutom visade vi att endogena immunceller var inblandade i cancer utrotning.
Här beskriver vi i detalj protokollet för produktion av mus CAR T-celler, om lymfom i syngena möss, och behandling av lymfom med CAR T-celler med eller utan användning av lymphodepleting förkonditioneringen. Detta kan användas för kombinationsstudier av CAR T-celler med andra agenter, testning CAR T-celler med andra transgener eller för användning av andra adoptivföräldrar cell terapi eller immunterapi strategier mot lymfom.
Syngena musmodeller tillåter testning av sjukdomsprogression och terapi samtidigt som ett intakt immunsystem. Detta är av största vikt när det gäller behandlingar som samverkar med immunförsvaret och i synnerhet för immunoterapeutisk agenter.
Protokollet beskrivs här har två kritiska arbete strömmar, ena är genetiskt modifiera mus T-cell för att uttrycka bilar. Detta kräver 7 dagar från initiering till validering av transduktion. Samtidig med produktionen av CAR T-celler är inrättandet av systemisk lymfom hos möss. Bör bil T cellproduktion misslyckas, eller kvalitet är otillräcklig, det inte är normalt tillräckligt med tid att producera ersättning celler innan möss duka till lymfom. Det är därför viktigt att forskare som använder dessa modeller korrekt utför tumör progression studier dosering och sjukdom för att framgångsrikt tid produktionen av CAR T-celler för terapeutiska administrering.
Typiska skäl för låga T-cell transduktion effektivitet inkluderar dålig transfection effektivitet av producenten celler, orsakas oftast av dålig plasmid renhet eller felaktig bestämning av pH-värdet i transfection media. Det är rekommenderat att kontrollera effektiviteten i producent cell transfection innan du fortsätter med det fullständiga protokollet som fattiga transfection kommer att begränsa effektiviteten i T-cell transduktion. Rekombinant humant Fibronektin fragment kan samlas och lagras vid-20 ° C för återanvändning, dock flera frysa-töar resultera i minskad transduktion effektivitet. Snabb behandling av mus mjälte efter samling är också viktigt för att få hög avkastning av livskraftiga T-celler.
Det bör noteras att protokollet beskrivs här använder A20 celler som uttrycker luciferas. Detta är att föredra eftersom det ger möjlighet att mäta systemisk tumör bördan av Mareld imaging. I närvaro av ett fungerande immunförsvar, kunde dock Svaren till luciferas förvränga resultaten. Vi har tidigare testat immunreaktioner överleva möss till markör transgener17. Det är nyckeln till replikera nyckelexperiment använder A20 celler gratis av transgener för att validera som dessa inte spelar en betydande roll i tumör utrotning av immunceller.
Medan kliniska agenter kan endast användas i vivo i immun-brist möss, tillåter användning av musen CAR T-celler mot mus cancerceller oss att utvärdera bidrag från immunförsvaret att terapeutisk effekt eller sjukdom progression. Detta protokoll skulle kunna utnyttjas för preklinisk utvärdering av bilar som riktar sig till B-cells lymfom eller andra bilar med ytterligare ändringar, till exempel utsöndring av IL-12 som beskrivs här. Det måste noteras att även om samspelet mellan immunceller kan utvärderas i syngena musmodeller, de inte kan korrekt sammanfatta interaktion i människor i vivo. Av särskilt Observera, mänskliga och mus bilar varierar i strukturen som kan få nedströms konsekvenser; optimal aktivering och cell kultur villkoren för tillväxt av T-celler är olika20, vävnadsdistribution mål antigen uttryck kan variera mellan människor och möss och erfarna toxicitet kan vara radikalt annorlunda. Det är därför nödvändigt att utnyttja ex vivo och xenogena modeller att bekräfta resultaten.
I sammanfattning recapitulate det syngena lymphodepleted och lymphoreplete modell av lymfom patienter med och utan tidigare chemo/strålbehandling. Detta ger ett modellsystem att efterlikna de kliniska inställningarna för att tillåta testning av en rad terapeutiska strategier som kommer att vara viktigt med den kommande vågen av nya immun terapi agenter.
Med användning av förkonditioneringen, kommer det noteras att alla möss normalt klara lymfom. Med är upp till 90% komplett svarsfrekvens hos människor, detta representativt. Men utmaningarna för CD19 bil T-cell terapi kommer gångjärn på att förhindra den höga frekvensen av skov observerades som är ofta CD19. Skov har inte observerats i den här modellen upp till, och ofta mer än 100 dagar. Ändringar att efterlikna de skov som sett i kliniken kunde hjälpa med de framtida utmaningarna av CD19 bil T-cell terapi.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Bloodwise för att finansiera denna forskning (grant 13031) och cancer Research UK Manchester biologisk resurs enhet, imaging och flödescytometri och molekylärbiologi corefaciliteter för att stödja detta arbete.
0.2 µm syringe filter | Appleton Woods | FC121 | |
0.45 µm syringe filter | Appleton Woods | FC122 | |
1.5ml pestle and microtube | VWR | 431-0098 | |
100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Gibco | 10378016 | |
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350–010 | |
Blasticidine S hydrochloride | Sigma- Aldrich | 15205 | |
Bottle Top Filter (0.2 µm) | Scientific Laboratory Supplies | FIL8192 | |
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100759 | 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7 |
Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100552 | 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5 |
Calcium chloride dihydrate | Sigma- Aldrich | C7902 | |
Cell counting beads – CountBright absolute counting beads | Molecular Probes | C36950 | |
Cell Strainer 100μm | VWR | 734-0004 | |
Cyclophosphamide Monohydrate | Merck | 239785-1GM | |
Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) – High Glucose | Sigma Aldrich | D6546 | |
Dynabeads | Gibco | 11131D | |
Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-03 | Sold by Sigma- Aldrich |
Flow cytometer – LSR Fortessa x20 | BD Biosciences | 658222R1 | |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
Haemacytometer | Appleton Woods | HC001 | |
HEPES solution | Sigma- Aldrich | H0887 | |
IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit | Invitrogen | 88-7121-76 | |
IL2, Proleukin | Novartis | PL 00101/0936 | |
in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system | Bruker | T149094 | |
Ionomycin Calcium Salt | Sigma- Aldrich | I0634 | |
Live/dead stain – Zombie Violet Fixable Viability Kit | BioLegend | 423114 | 1 in 100 staining dilution |
Luminometer – Lumistart Omega | BMG Labtech | 415-301 | |
Murine IFN-γ ELISA kit | Diaclone | 861.050.010 | |
Paraformaldehyde | Sigma- Aldrich | 16005 | |
pCL-Eco | Novus Biologicals | NBP229540 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma- Aldrich | P8139 | |
Platinum E cell line | Cell Biolabs | RV-101 | (RRID:CVCL_B488) |
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | Clone 37.51 |
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε | BD Biosciences | 553057 | Clone 145-2C11 |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2 |
Puromycin Dihydrochloride | Sigma- Aldrich | P8833 | |
Recombinant human fibronectin fragment – RetroNectin Reagent | TaKaRa | T100B | |
Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) | BioLegend | 577806 | |
Red cell lysis buffer | eBioscience | 004-4333-57 | |
RPMI 1640 Medium | Lonza | BE12-167F | |
Trypsin – EDTA solution | Sigma- Aldrich | T3924 | |
XenoLight D-Luciferin | Perkin Elmer | 122799 |