Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक उच्च प्रवाह फैशन में लार्वा zebrafish के पेट के माध्यम से फ्लोरोसेंट लेबल भोजन के पारगमन समय को मापने के लिए है ।
Abstract
Zebrafish दवा सुरक्षा परीक्षण के लिए वैकल्पिक मॉडल जीवों के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं । zebrafish के जठरांत्र (सैनिक) पथ आनुवंशिक, न्यूरॉन, और स्तनधारियों की है कि औषधीय समानताएं है । दवा उंमीदवारों के नैदानिक परीक्षण के दौरान सैनिक असहिष्णुता आम है और मानव स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा पैदा कर सकता है । नैदानिक स्तनधारी मॉडल में सैनिक विषाक्तता के लिए परीक्षण समय के मामले में महंगा हो सकता है, परीक्षण यौगिक, और श्रम. यहां प्रस्तुत उच्च प्रवाह विधि सैनिक सुरक्षा के मुद्दों का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । स्तनधारी मॉडल की तुलना में, इस विधि यौगिक की कम मात्रा का उपयोग करते हुए सैनिक पारगमन पर परीक्षण यौगिक प्रभाव के अधिक समीचीन मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । इस विधि में, लार्वा zebrafish (7 दिनों के बाद निषेचन) एक फ्लोरोसेंट लेबल युक्त खाना खिलाया जाता है । भोजन के बाद, प्रत्येक लार्वा मछली एक कुआं में रखा जाता है एक ९६-शंकु के नीचे अच्छी तरह से प्लेट और परीक्षण यौगिक के साथ खुराक (पानी में घुल) या वाहन. के रूप में आंत पारगमन होता है, मल के कुओं के तल पर जमा होता है, और दर जिस पर यह होता है पर अच्छी तरह से बार-बार एक प्लेट spectrophotometer का उपयोग कर के तल से प्रतिदीप्ति को मापने के द्वारा निगरानी की जाती है । एक दिया उपचार समूह में लार्वा से प्रतिदीप्ति औसत और इन मूल्यों मानक त्रुटि के साथ ग्राफी कर रहे हैं, प्रत्येक माप समय के लिए, एक समय के साथ भोजन की औसत पारगमन का प्रतिनिधित्व वक्र उपज । आंत पारगमन समय पर प्रभाव वाहन-इलाज समूह के लिए प्रत्येक उपचार समूह के लिए वक्र के तहत क्षेत्र की तुलना करके पहचाने जाते हैं । इस विधि ज्ञात नैदानिक सैनिक प्रभाव के साथ दवाओं द्वारा प्रेरित zebrafish सैनिक पारगमन समय में परिवर्तन का पता लगाया; यह प्रति दिन सैनिक प्रभाव के लिए उपचार के दर्जनों पूछताछ करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । जैसे, सुरक्षित यौगिकों जल्दी स्तनधारी परीक्षण, जो खोज और proffers 3Rs उन्नति में तेजी लाने के लिए प्राथमिकता हो सकती है.
Introduction
Zebrafish (ढाणियो rerio) हड्डीवाला जीवविज्ञान मॉडल और दवा विषाक्तता की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं और/ इन क्षेत्रों में नए आवेदन हर साल उभर रहे हैं । स्तनधारी मॉडल पर zebrafish के लाभ उनके fecundity, छोटे आकार, और पारदर्शिता organogenesis के माध्यम से शामिल हैं । Zebrafish दवा उंमीदवार तीव्र विषाक्तता की भविष्यवाणी करने के लिए, साथ ही अंग समारोह पर यौगिक प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है, जैसे , कार्डियक, नेत्र, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (सैनिक)1,2. Zebrafish विकास और फिजियोलॉजी कई मायनों में स्तनधारियों के उन लोगों के समान है3 और ८०% जीन है कि मानव रोग के साथ जुड़े रहे है एक Zebrafish homolog4है ।
zebrafish के सैनिक पथ स्तनधारी सैनिक पथ के लिए समान फिजियोलॉजी है, लेकिन एक सरल वास्तुकला5है । Zebrafish के पास पेट नहीं है; पूर्वकाल आंत्र बल्ब एक खाद्य डिपो के रूप में कार्य करता है । zebrafish आंत में जीन अभिव्यक्ति5स्तनधारियों की है कि कई समानताएं है । स्तनधारियों की तरह, zebrafish नियंत्रण आंत गतिशीलता के दर्जी तंत्रिका तंत्र, और आंत्र इन्नेर्वतिओन दर्पण कि अंय रीढ़6,7। इन समानताओं के आधार पर, मानव आंत के कार्यात्मक विकारों zebrafish में अध्ययन किया गया है, स्तनधारी मॉडल8से व्युत्पंन तरीकों का उपयोग कर ।
दवा उंमीदवारों के नैदानिक परीक्षण के दौरान सैनिक असहिष्णुता आम है और मानव स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा पैदा कर सकता है । 2005 के दौरान एक प्रमुख दवा कंपनी में कार्यक्रमों की समीक्षा-2010 नैदानिक अध्ययन समाप्ति9% के लिए मुख्य कारण के रूप में सैनिक सुरक्षा से पता चला । नैदानिक स्तनधारी मॉडल में सैनिक विषाक्तता के लिए परीक्षण समय, यौगिक, और परिश्रम के मामले में महंगा हो सकता है । एक पूर्वानुमान सैनिक पारगमन के लिए उच्च प्रवाह परख के लिए यौगिक विषाक्तता परीक्षण लचीलापन प्रदान कर सकते हैं, और 3Rs प्रभाव उद्धार । एक उपंयास ऐसी एक परख की पेशकश विधि प्रोटोकॉल द्वारा प्रस्तुत की गई है यहां वर्णित है । इस उच्च प्रवाह परख दवा के विकास में जल्दी नियोजित किया जा सकता है उंमीदवारों को प्राथमिकता है, और बड़ी प्रजातियों में सैनिक सुरक्षा परीक्षण की कमी में योगदान ।
Protocol
सभी विधियां यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है AbbVie. AbbVie के लिए एसोसिएशन द्वारा मांयता प्राप्त एक सुविधा में प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के तहत संचालित प्रयोगशाला पशु परिचर्या (AAALAC) का मूल्यांकन और प्रत्यायन । इन अध्ययनों में कोई पशु स्वास्थ्य चिंताओं को मनाया गया ।
1. नस्ल वयस्क Zebrafish और इकट्ठा भ्रूण
- घर और नस्ल वयस्क सामांय पशुपालन और प्रजनन पद्धतियों का उपयोग कर zebrafish । उदाहरण के लिए,10Westerfield देखें ।
- निर्जलित समुद्र नमक भंग द्वारा भ्रूण मध्यम तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) में ६० मिलीग्राम/L की एकाग्रता पर पानी में ।
- वयस्क प्रजनन कक्ष से निषेचित अंडे ले लीजिए, भ्रूण मध्यम और घर भ्रूण के बारे में 10 सेमी पेट्री व्यंजन (डिश प्रति ५० भ्रूण) में 28 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर एक 14:10 एच लाइट पर के बारे में ५० मिलीलीटर में अच्छी तरह कुल्ला: डार्क साइकिल ।
- 24 ज और जीवित भ्रूण के साथ पूरक के बाद गैर जीवित भ्रूण निकालें ताकि प्रत्येक डिश पकवान प्रति ५० भ्रूण शामिल हैं ।
2. ट्रेन लार्वा गैर रंगे भोजन का उपयोग कर फ़ीड करने के लिए
- 4वें दिन के बाद-निषेचन (4 dpf) पर, प्रत्येक पेट्री पकवान 2 मिलीग्राम पाउडर लार्वा मछली खाना ( सामग्री की तालिकादेखें) में लार्वा फ़ीड पानी के ऊपर खाना छिड़क द्वारा ।
- लार्वा 3-4 ज को खिलाने की अनुमति दें और फिर उन्हें एक साफ (कोई खाना नहीं) पेट्री डिश के बारे में ५० मिलीलीटर ताजे भ्रूण के माध्यम से युक्त स्थानांतरण करें ।
- संभव के रूप में छोटे भोजन के रूप में स्थानांतरित करने में सहायता करने के लिए, एक पेट्री डिश में प्रत्येक लार्वा कुल्ला के बारे में ५० मिलीलीटर ताजा भ्रूण नई डिश के लिए अंतिम हस्तांतरण से पहले मध्यम ।
- 5 dpf और 6 dpf पर लार्वा की फीडिंग और कुल्ला को दोहराएं ।
3.6 dpf पर फ्लोरोसेंट खाना तैयार करें और 7 dpf पर लार्वा को खिलाएं
- तैयार एक फ्लोरोसेंट लेबल युक्त भोजन (इसके बाद फ्लोरोसेंट भोजन के रूप में निर्दिष्ट, क्षेत्र एट अल के तरीकों के अनुसार । 3). संक्षेप में, फ्लोरोसेंट लेबल के ३०० µ एल मिश्रण ( सामग्री की तालिकादेखें), १०० µ पानी की एल, और एक 10 सेमी घड़ी कांच पर पाउडर लार्वा भोजन के २०० मिलीग्राम ।
- आने वाले पेस्ट को वॉच ग्लास पर एक पतली परत में फैलाएं । के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर सूखे के लिए पेस्ट की अनुमति दें > 8 एच ।
- देखो गिलास बंद सूखे मिश्रण परिमार्जन, पाउडर को कुचलने, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर दुकान । अब फ्लोरोसेंट खाने से लार्वा को खिलाया जाने की तैयारी है ।
- 7 dpf पर, पिछले भक्षण के लिए किया के रूप में एक ही तरीके से लार्वा के लिए फ्लोरोसेंट भोजन फ़ीड, कि 2 पकवान प्रति मिलीग्राम फ्लोरोसेंट खाना प्रदान कर रहा है (देखें कदम 2.1-2.2.1) ।
नोट: यह सुनिश्चित करें कि भोजन बारीकी से एक पाउडर के लिए जमीन है । मलाई फ्लोरोसेंट खाना है कि अंगूठे और तर्जनी के बीच कागज वजन में लिपटे है पतले भूमि भोजन सुनिश्चित करने के लिए एक उपयोगी तरीका है ।
4. परीक्षण यौगिकों के केंद्रित खुराक समाधान तैयार
- एक एकाग्रता है कि लक्ष्य खुराक 2x है करने के लिए भ्रूण माध्यम में प्रत्येक परीक्षण यौगिक भंग. एक खुराक रेंज का परीक्षण वांछित है, तो वांछित खुराक के लिए उपयुक्त सांद्रता के कई केंद्रित खुराक समाधान तैयार.
- प्रत्येक केंद्रित खुराक समाधान के लिए पर्याप्त तैयार है कि 24 लार्वा इलाज किया जा सकता है । प्रत्येक लार्वा की आवश्यकता होगी १०० µ l खुराक समाधान (अंतिम मात्रा प्रति अच्छी तरह से २०० µ एल है), तो बहुत कम से कम, २.४ मिलीलीटर खुराक समाधान प्रत्येक उपचार समूह के लिए आवश्यक है; २.५ मिलीलीटर एक उपयुक्त मात्रा होगी ।
- यदि एक विलायक (यानी, dimethyl sulfoxide) परीक्षण यौगिक के प्रारंभिक solubilizing के लिए इस्तेमाल किया गया था, उचित वाहन नियंत्रण खुराक तैयार (यानी, यौगिक उपचार के रूप में विलायक के एक ही राशि है, लेकिन यौगिक के बिना). और, जैसा कि प्रत्येक यौगिक-इलाज समूह के लिए किया गया था, 24 लार्वा के इलाज के लिए पर्याप्त वाहन समाधान तैयार करें ।
5. एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट के लिए लार्वा स्थानांतरण और उपचार लागू
- लार्वा के बाद 2 घंटे के लिए फ्लोरोसेंट भोजन पर फ़ीड की अनुमति दी गई है, एक पिपेट हस्तांतरण का उपयोग करने के लिए उंहें एक धोने पकवान के लिए कदम, के रूप में पहले दिन पर खिलाने के बाद किया गया था ।
- प्रत्येक लार्वा कुल्ला करने के बाद, इसे १०० µ एल भ्रूण माध्यम के साथ वापस ले, और यह एक ९६-अच्छी तरह से polystyrene शंकु-नीचे बहु अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से स्थानांतरित ( सामग्री की मेजदेखें), लार्वा के साथ अच्छी तरह से पूर्ण १०० µ l भ्रूण मध्यम वितरण ।
- एक बार लार्वा की अपेक्षित संख्या ९६-अच्छी तरह से प्लेट को हस्तांतरित किया गया है, एक अच्छी तरह से 2 × केंद्रित खुराक समाधान के १०० µ एल जोड़ें ।
नोट: एक 12-चैनल मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग लार्वा की तेजी से खुराक की सुविधा देता है (12-at-a-समय). गलती से गलत उपचार जोड़ने से बचने के लिए, बंद ट्रैक रखें जिनमें से लार्वा की खुराक ली गई है और उपचार के बीच पिपेट युक्तियों को परिवर्तित करना सुनिश्चित करें ।
6. एक अच्छी तरह से प्रारंभिक और बाद प्रतिदीप्ति उपाय
- खुराक समाधान जोड़ने के बाद, एक थाली में ९६ अच्छी तरह से थाली प्लेस रोमांचक और फ्लोरोसेंट लेबल से उत्सर्जन का पता लगाने में सक्षम spectrophotometer ।
नोट: पीले-हरे रंग के लिए इस्तेमाल किया लेबल ( सामग्री की तालिकादेखें), प्रकाश की उचित तरंग दैर्ध्य ५०५ एनएम पर रोमांचक और ५१५ एनएम में पता लगाने रहे हैं । - ९६ के प्रतिदीप्ति को अच्छी तरह से प्लेट में मिलाने के बिना तत्काल उत्तराधिकार में 5 बार नीचे से प्लेट में पढ़ें । अच्छी तरह से प्रारंभिक प्रतिदीप्ति के रूप में एक अच्छी तरह से 5 रीडिंग के ंयूनतम मूल्य का उपयोग करें ।
नोट: कारण यह है कि 5 रीडिंग ले लिया जाता है जब भी थाली पढ़ा है कि लार्वा उत्तेजना प्रकाश के मार्ग में कई बार तैरने और उनके पेट में भोजन का उत्सर्जन एक बहुत बड़े संकेत है जो जारी मल का प्रतिनिधि है । 5 के न्यूनतम ले पढ़ता संयुक्त राष्ट्र से पारगमन भोजन कृत्रिम रूप से उच्च माप का उपयोग करने से बचने के लिए मदद कर सकते हैं. - ९६ के प्रतिदीप्ति पढ़ें-अच्छी तरह से प्लेट (के रूप में प्रारंभिक पढ़ने के लिए किया गया था) पहले 2 घंटे के बाद खुराक के लिए हर 20 मिनट, हर घंटे के लिए 30 मिनट 3 और 4 पोस्ट खुराक, और फिर एक बार हर घंटे के लिए 5, 6, 7, और 8 के बाद खुराक.
- सावधानी रखना परेशान नहीं करने के लिए (९६-अच्छी तरह से मिलाते हुए प्लेट) पढ़ता के बीच मल बात बसे और 28 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर लार्वा की मशीन पढ़ता है ।
- 28 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर रात में लार्वा की मशीन और ९६ से प्रतिदीप्ति पढ़ें-अच्छी तरह से एक ही समय है कि लार्वा दिन पहले खुराक थे चारों ओर सुबह की थाली । 24 एच के बाद खुराक प्रतिदीप्ति के रूप में इस माप का उपयोग करें ।
7. डेटा का विश्लेषण करें
नोट: यहां हम हर समय बिंदु के लिए अच्छी तरह से और समूह औसत प्रति संचय की गणना ।
- प्रति अच्छी तरह से संचय की गणना करने के लिए, प्रत्येक 5 पढ़ता से केवल न्यूनतम मान का उपयोग कर, प्रत्येक समय बिंदु के मान से प्रारंभिक मान घटाना. प्रारंभिक मान के लिए इस परिकलन के रूप में अच्छी तरह से (यह एक अच्छी तरह के लिए शूंय का एक प्रारंभिक संचय में परिणाम) ।
- यदि एक अच्छी तरह से 24 घंटे बिंदु पर संचय १५० सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाइयों से कम है, कि आगे विश्लेषण से अच्छी तरह से बाहर; इन कम मूल्यों के कारण सबसे अधिक होने की संभावना है या नहीं दूध पिलाने के दौरान लार्वा द्वारा फ्लोरोसेंट भोजन का सेवन, और इस प्रकार उन लार्वा पारगमन समय को मापने के लिए अच्छे विषय नहीं हैं ।
- हर समय बिंदु के लिए, सह इलाज लार्वा, साथ ही उन औसत के मानक त्रुटि युक्त कुओं के लिए औसत संचय की गणना ।
- प्रत्येक उपचार समूह के लिए एक्स अक्ष पर समय बनाम Y-अक्ष पर औसत संचय और उन curves (AUCs) के तहत क्षेत्रों की तुलना प्लाट ।
नोट: उपचार है कि काफी धीमी गति से या पारगमन समय में तेजी लाने के AUCs काफी छोटे या बड़े क्रमशः, वाहन से इलाज किया समूह की तुलना में होगा ।
Representative Results
इस विधि, जो प्लेट आधारित spectrophotometry का उपयोग करता है सैनिक पारगमन का आकलन करने के लिए, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का एक उच्च प्रवाह प्रतिस्थापन, जो एक ही समारोह (चित्रा 1) का आकलन करने के लिए एक कम प्रवाह विधि है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । 1 चित्रामें डेटा उत्पन्न करने के लिए, हूबहू इलाज मछली सैनिक पारगमन के लिए विश्लेषण किया गया या तो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग (प्रतिनिधि चित्र दिखाया गया) या spectrophotometry 4 समय अंक, 0, 4, 8, और 24 एच के बाद खुराक; उन प्रयोगों से डेटा की तुलना अत्यधिक संबंधित परिणाम दिया (डेटा r2 = ०.९५ के रैखिक हीनता) । रैखिक प्रतिगमन एक नकारात्मक ढलान है क्योंकि सूक्ष्म उपाय बनाए रखा प्रतिदीप्ति संकेत और spectrophotometry पारगमन संकेत उपाय ।
मानव में अच्छी तरह से स्थापित सैनिक गतिविधि के साथ अलग तंत्र के यौगिकों के प्रभाव, spectrophotometry परख (चित्रा 2) का उपयोग कर zebrafish में पता लगाया जा सकता है । वाहन के इलाज के नियंत्रण की तुलना में, atropine (४.२ µ मीटर) और ऐमिट्रिप्टिलाइन (5 µ मीटर) धीमा सैनिक पारगमन, जबकि tegaserod (३.३ µ मीटर) और मटॉक्लोप्रॅमाइड (३३ µ मीटर) त्वरित पारगमन समय । इरिथ्रोमाइसिन (14 µ m), पारगमन समय में तेजी लाने की उंमीद के रूप में इस पद्धति से मापा कोई प्रभाव नहीं था । उपचार समूह के आकार 24 नहीं या बहुत कम संकेत के साथ लार्वा से डेटा को हटाने से पहले थे । समय बिंदु प्रति औसत संकेत के लिए ईमेज-1-त्रुटि नियंत्रण के लिए Tukey की ईमानदारी से महत्वपूर्ण अंतर का उपयोग करते हुए यौगिक-उपचारित और वाहन-स्वास्थ्यकर्मी समूहों के बीच तुलना की गई । प्रभाव महत्वपूर्ण माना जाता था जब पी ≤ ०.०५ । इसके बाद के संस्करण उपचार के लिए इस्तेमाल किया सांद्रता अधिकतम सहन खुराक थे, एक पूर्व प्रयोग में निर्धारित और सकल प्रेक्षण द्वारा कोई चौकस प्रतिकूल प्रभाव के साथ उच्चतम खुराक के रूप में परिभाषित किया ।
spectrophotometry परख यौगिकों के खुराक पर निर्भर प्रभाव उपाय कर सकते हैं । चित्रा 3 zebrafish लार्वा में atropine सैनिक पारगमन खुराक-निर्भर धीमा कर देती है कि प्रदर्शन डेटा प्रदान करता है. atropine परीक्षण की सबसे कम खुराक, ०.०४२ µ मीटर, कोई महत्वपूर्ण प्रभाव था, जबकि दो उच्च सांद्रता प्रत्येक महत्वपूर्ण प्रभाव था, ०.४२ µ एम ४.२ µ एम से एक प्रभाव के कम होने.
एक नई परख सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण परीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, कि है, यौगिकों के लिए सक्रिय और निष्क्रिय क्रमशः लक्ष्य प्रणाली में जाना जाता है (इस मामले में लक्ष्य प्रणाली स्तनधारी सैनिक पारगमन है) । spectrophotometry परख के लिए, 18 सक्रिय (सकारात्मक) नियंत्रण और 6 निष्क्रिय (नकारात्मक) नियंत्रण का परीक्षण किया गया । इन प्रयोगों के आधार पर, spectrophotometry परख उच्च सकारात्मक पूर्वानुमान मूल्य (९०.९%), लेकिन कम संवेदनशीलता (५५.६%) और नकारात्मक पूर्वानुमान मूल्य (३८.५%) ये मान तालिका 1में प्रस्तुत किए गए डेटा से प्राप्त होते हैं । वे व्यवहार में प्रतिबिंबित, कि यदि zebrafish पारगमन समय एक उपचार द्वारा प्रभावित है, स्तनधारी पारगमन प्रभावित होने की संभावना है । हालांकि, अगर वहां zebrafish पारगमन समय पर कोई प्रभाव नहीं है, यह स्तनधारी प्रभाव का पूर्वानुमान नहीं है ।
चित्रा 1: फ्लोरोसेंट खाद्य पारगमन सूक्ष्म इमेजिंग से संकेत की हानि और प्लेट द्वारा संकेत में एक इसी लाभ के रूप में पता चला है आधारित spectrophotometry । (क) atropine के विश्लेषण से प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियों (४.२ µ मी) सैनिक पारगमन समय पर प्रभाव । (ख) सूक्ष्म छवियों से औसत संकेत quantified उच्च (नकारात्मक) हूबहू इलाज मछली से अशक्त मल पदार्थ (spectrophotometry) से संकेत के साथ संबंधित है । atropine-इलाज मछली से डेटा लाल रंग में हैं । यह आंकड़ा Cassar एट अल से अनुमति के साथ नकल की । 11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 : एक बहु से समय पर फ्लोरोसेंट संकेत संचय का विश्लेषण अच्छी तरह से थाली उपचार की पहचान की अनुमति देता है कि परिवर्तन सैनिक पारगमन दर । तारांकन (*) वाहन-इलाज मछली की तुलना में काफी अलग ईमेज इंगित करता है । त्रुटि पट्टियां प्रति समय बिंदु उपचार समूह में लार्वा के लिए माध्य संकेत की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । यह आंकड़ा Cassar एट अल से अनुमति के साथ प्रयोग किया गया है । 11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 : Atropine खुराक-निर्भर समय के साथ मल संचय के फ्लोरोसेंट spectrophotometry द्वारा परिलक्षित के रूप में zebrafish आंत पारगमन समय धीमा कर देती है । तारांकन (*) वाहन-इलाज मछली की तुलना में काफी अलग ईमेज इंगित करता है । त्रुटि पट्टियां प्रति समय बिंदु उपचार समूह में लार्वा के लिए माध्य संकेत की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । यह आंकड़ा Cassar एट अल से अनुमति के साथ प्रयोग किया जाता है । 11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
तालिका 1: स्तनधारी और मछली में 24 यौगिकों के सैनिक गतिविधि । इस तालिका Cassar एट अल से अनुमति के साथ प्रयोग किया जाता है । 11.
Discussion
zebrafish लार्वा सैनिक पारगमन समय को मापने के लिए उपंयास spectrophotometry विधि, यहां प्रस्तुत है, एक कुशल परख कि स्तनधारी सैनिक पर उपचार प्रभाव-समारोह की भविष्यवाणी कर सकते है । हालांकि परख कम संवेदनशीलता है, यह उच्च सकारात्मक predictivity है, जो प्रथम स्तर के उंमीदवार विषाक्तता12के आधार पर उपचार की संख्या नीचे कतरन के लिए कार्यरत परख के लिए स्वीकार्य है । इस विधि को क्रियांवित करने के लिए आसान है, उच्च प्रवाह है, और कम फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी से निपटने के पशु हैंडलिंग कदम का उपयोग करता है ।
इस विधि में निहित तकनीकी चुनौतियां हैं । फ्लोरोसेंट खाना खिलाने और उंहें व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरित करने के बाद व्यक्तिगत लार्वा को पकड़ने पहली बार में चुनौती दे रहा है । हालांकि, अभ्यास के साथ, एक कुशल तकनीशियन से कम 15 मिनट में एक ९६ अच्छी तरह से थाली भर सकते हैं । यदि, किसी दिए गए समय बिंदु पर, प्लेट अकस्मात हिल रहा है और मल की बात पढ़ने से पहले कुएँ के नीचे से बसाया, संचय में कमी दिखाई देगी. इस प्लेट (ओं) को ध्यान से हिलाने के बिना, ले जाने से बचा जा सकता है । हमारे अनुभव में, कि थाली spectrophotometer मोटर दराज के सहित सामांय आंदोलन, परख परेशान नहीं किया । प्लेट एक हीटर के साथ सुसज्जित पाठकों (यानी, प्लेट को माप के बीच मशीन को लौट नहीं है), और परख प्रयोगशाला बेंच के पास स्थित अशांति की कम संभावना के लिए अनुकूलित सकता है, लेकिन यह हमारे अनुभव में आवश्यक नहीं था ।
विधि में प्रारंभिक प्रयासों को परख के पहले दिन पर खिला शामिल नहीं था । उन ' अभ्यास ' भक्षण के बिना, लार्वा की कम संख्या उपचार आवेदन से पहले की अनुमति दी समय के दौरान पर्याप्त फ्लोरोसेंट भोजन का सेवन किया । उन प्रयासों में, उपचार समूहों के भीतर भिन्नता अधिक थी, और समय के साथ कम/कोई संकेत संचय के कारण अधिक डेटा अनुपयोगी था । यहां तक कि अभ्यास खिलाने के साथ, कुछ लार्वा फ्लोरोसेंट भोजन की पर्याप्त मात्रा का उपभोग नहीं करते, उन लार्वा से डेटा को छोड़कर समूहों के भीतर भिन्नता कम हो जाती है और उपचार प्रभाव की पहचान करने की क्षमता बढ़ जाती है । बड़ा समूह आकार के साथ शुरू (यानी, 24 बनाम 12) लार्वा की पर्याप्त संख्या के लिए अनुमति देता है विश्लेषण करने के लिए उपयोगी डेटा योगदान ।
फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी से पता चलता है कि भोजन पारगमन लगभग 24 atropine में एच इलाज लार्वा (दिखाया नहीं), लेकिन अंतिम समय बिंदु से microplate डेटा atropine समूह में कम अंतिम संकेत प्रतिबिंबित, वाहन समूह की तुलना में पूरा किया गया । इसके विपरीत, उच्च अंतिम microplate प्रतिदीप्ति उपचार है कि त्वरित पारगमन समय के साथ जुड़ा हुआ था, भले ही वाहन का इलाज लार्वा जाहिरा तौर पर अंतिम समय बिंदु से पहले अपने सैनिक पथ voided है । यादृच्छिक काम पर आधारित लार्वा का उपचार करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट भोजन के समतुल्य खपत, औसत पर, उपचार समूहों के बीच ग्रहण । इस को देखते हुए, और ऊपर वर्णित पैटर्न के आधार पर, मल बात से प्रतिदीप्ति लार्वा सैनिक पथ या तेजी से पारगमन में खर्च समय के साथ गिरावट आती है मल को किसी भी तरह प्रतिदीप्ति कहते हैं । वास्तविक कारण अज्ञात है और पूछताछ नहीं किया गया है, लेकिन परख अभी भी मापने और समूहों के बीच पारगमन समय की तुलना करने में सक्षम है ।
छोटे अणु यौगिकों से विषाक्त सैनिक प्रभाव का पता लगाने में इस पद्धति का रोजगार एक आवेदन है. अन्य संभव अनुप्रयोगों में शामिल हैं रोग मॉडलिंग (जैसे, चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम) और इस तरह के रोगों के लिए उपन्यास चिकित्सा खोज, या प्रो-काइनेटिक यौगिकों की खोज के लिए. इसके अलावा, ट्रांसजेनिक मॉडल के साथ युग्मित, इस विधि के लिए सामांय सैनिक पारगमन में जीन की भूमिका, साथ ही साथ पारगमन विकारों, प्रवेश ंयूरॉन कमी सहित पूछताछ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । zebrafish लार्वा एक पैमाने पर एक पूरे जीव मंच प्रदान करता है कि अनुमानित है कि सेल संवर्धन, लेकिन बाद से वहां कई ऊतकों और असंख्य कोशिका zebrafish में एक साथ कार्य प्रकार, सिस्टंस जीवविज्ञान प्रश्न और कहा जा सकता है इस का उपयोग कर जवाब मॉडल.
प्रौद्योगिकी के रूप में प्रगति के साथ, और उसके नए अनुप्रयोगों, zebrafish विषाक्तता परीक्षण के संचालन में दक्षता में सुधार जारी रहेगा । लार्वा zebrafish हैंडलिंग तरीकों और परख के लिए उच्च प्रवाह13,14के मामले में सुधार जारी है । उपंयास विधि यहां प्रस्तुत एक सुधार है कि zebrafish अध्ययन कर सकते है और अधिक प्रभाव का एक उदाहरण है ।
Disclosures
इस शोध के लिए डिजाइन, अध्ययन का आयोजन और वित्तीय सहायता AbbVie द्वारा प्रदान की गई । AbbVie डेटा, समीक्षा की व्याख्या में भाग लिया, और पांडुलिपि के अनुमोदन । एस Cassar, एक्स हुआंग, और टी कोल AbbVie के कर्मचारी है और ब्याज की कोई अतिरिक्त संघर्ष का खुलासा किया है ।
Acknowledgments
शमौन carpetbones.com के Cassar डिजाइन और एनिमेटेड के लिए सैनिक पारगमन परख के जीवन की प्रक्रिया को प्रदर्शित करते थे आंकड़ा बनाया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wild type zebrafish breeding pair | Various sources - for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
| 1.7 L Breeding Tank - Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
| Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
| First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
| Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
| V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
| Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
| Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
| Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
| Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |
References
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