Summary
والهدف من هذا البروتوكول قياس وقت العبور المسماة فلوريسسينتلي الغذائي من خلال القناة الهضمية الزرد اليرقات في طريقة إنتاجية عالية.
Abstract
وتستخدم الزرد كالكائنات نموذج بديل لاختبار سلامة العقاقير. وقد الهضمي (غي) من الزرد التشابه الجيني، والخلايا العصبية والدوائي للثدييات. التعصب غي أثناء التجارب السريرية للمرشحين المخدرات شائع، وقد تشكل تهديدا خطيرا لصحة الإنسان. اختبار السمية غي في نماذج الثدييات السريرية يمكن أن تكون مكلفة من حيث الوقت والاختبار المجمع، وحزب العمل. يمكن استخدام الأسلوب الفائق الذي قدم هنا للتنبؤ بالمسائل المتعلقة بسلامة معهد جوته. بالمقارنة مع نماذج الثدييات، يسمح هذا الأسلوب لتقييم أكثر ملاءمة لاختبار الآثار المركبة على العبور غي أثناء استخدام كميات منخفضة من المجمع. في هذا الأسلوب، الزرد اليرقات (7 أيام بعد الإخصاب) تتغذى على الأغذية التي تحتوي على تسمية فلورسنت. بعد الرضاعة، وضعت في بئر صفيحة 96-أسفل المخروطية-جيدا كل الأسماك اليرقات وجرعتي مع مجمع الاختبار (يذوب في الماء) أو السيارة. كما يحدث عبور القناة الهضمية، يتراكم البراز على الجزء السفلي من الآبار، ويتم رصد معدل الذي يحدث هذا بقياس الأسفار من أسفل البئر مرارا وتكرارا على مر الزمن لوحة جهاز المطياف الضوئي باستخدام. يتم حساب متوسط الأسفار من اليرقات في مجموعة معاملة، وهذه القيم هي رسوم بيانية جنبا إلى جنب مع الخطأ المعياري، لقياس كل الوقت، مما أسفر عن منحنى الذي يمثل متوسط النقل العابر للمواد الغذائية مع مرور الوقت. يتم تحديد الآثار على وقت عبور القناة الهضمية بمقارنة المنطقة تحت المنحنى لكل مجموعة العلاج لفريق المعالجة بالمركبات. هذا الأسلوب تم الكشف عن التغييرات في وقت العبور غي الزرد الناجم عن المخدرات مع الآثار غي السريرية المعروفة؛ يمكن أن تستخدم لاستجواب عشرات من العلاجات لآثار غي يوميا. على هذا النحو، مركبات أكثر أمنا يمكن بسرعة إعطاء الأولوية لاختبار الثدييات، مما يعجل النهوض 3Rs الاكتشاف وتنطوي.
Introduction
وتستخدم الزرد (دانيو rerio) لنموذج بيولوجيا الفقاريات والتنبؤ بسمية العقاقير و/أو كفاءة؛ تطبيقات جديدة في هذه الحقول تظهر كل سنة. وتشمل مزايا الزرد أكثر نماذج الثدييات خصوبتها، وصغر حجمها، والشفافية من خلال أورجانوجينيسيس. وتستخدم الزرد للتنبؤ بالمخدرات مرشح السمية الحادة، كذلك فيما يتعلق بتقييم الأثر المركب على وظيفة الجهاز، مثلاً، من القلب، والعين، والجهاز الهضمي (غي)1،2. التنمية الزرد وفسيولوجيا مماثلة للثدييات في العديد من طرق3 و 80% المورثات المرتبطة بالأمراض التي تصيب البشر قد homolog الزرد4.
الجهاز الهضمي من الزرد مماثلة فسيولوجيا الجهاز الهضمي الثدييات ولكن لديه بنية أبسط5. وقد الزرد لا المعدة؛ لمبة المعوية الأمامي يعمل كمستودع للمواد غذائية. التعبير الجيني في الأمعاء الزرد لديه العديد من أوجه التشابه إلى أن الثدييات5. مثل الثدييات، ويتحكم الجهاز العصبي المعوي من الزرد حركية القناة الهضمية، وتعصيب الأمعاء المرايا التي لغيرها من الفقاريات76،. استناداً إلى أوجه التشابه هذه، وقد درست اضطرابات وظيفية للامعاء البشرية في الزرد، استخدام أساليب مستمدة من نماذج الثدييات8.
التعصب غي أثناء التجارب السريرية للمرشحين المخدرات شائع، وقد تشكل تهديدا خطيرا لصحة الإنسان. وكشف استعراض للبرامج في شركة أدوية كبرى خلال الفترة 2005-2010 سلامة غي كالسبب الرئيسي لنسبة 9 في المائة من الانهاءات الدراسة السريرية9. اختبار السمية غي في نماذج الثدييات السريري يمكن أن يكون مكلفاً من حيث الوقت، مجمع، وحزب العمال. مقايسة الفائق تنبؤية للعبور غي يمكن توفير المرونة مجمع سمية اختبار، وتسليم 3Rs أثر. أسلوب رواية تقدم مثل هذا تحليل يرد ببروتوكول الموضحة هنا. ويمكن استخدام هذا التحليل الفائق مبكرا في تطوير العقاقير إعطاء الأولوية للمرشحين، والمساهمة في الحد سلامة غي اختبار في الأنواع الأكبر.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من AbbVie.Abbvie ويعمل تحت "الدليل معاهد الصحة الوطنية" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية في منشأة معتمدة من قبل رابطة تقييم واعتماد المختبرات الحيوانية الرعاية (آآلاك). لم تلاحظ أي شواغل الصحة الحيوانية في هذه الدراسات.
1-تولد الزرد الكبار وجمع الأجنة
- البيت وتربية الكبار الزرد استخدام تربية عامة وتربية الممارسات. على سبيل المثال، انظر ويسترفيلد10.
- إعداد متوسطة الجنين بتذويب المجففة ملح البحر (انظر الجدول للمواد) واسطة الماء بتركيز 60 مغ/لتر.
- جمع يخصب البيض من قاعة تربية الكبار، شطف جيدا مع متوسطة جنين وبيت الأجنة في حوالي 50 مل متوسطة الأجنة في أطباق بتري 10 سم (الأجنة 50 كل طبق) في 28 ± 1 درجة مئوية في 14:10 دورة ح الضوء: الظلام.
- إزالة الأجنة غير الباقين على قيد الحياة بعد 24 ساعة والملحق مع الباقين على قيد الحياة الأجنة حيث يحتوي كل صحن الأجنة 50 للطبق الواحد.
2-تدريب اليرقات لإطعام استخدام الأغذية غير مصبوغ
- على 4th يوم بعد انتهاء التسميد (4 إدارة الشرطة الاتحادية)، تغذية اليرقات في كل طبق بيتري 2 ملغ من مسحوق الأسماك اليرقات الغذاء (انظر الجدول للمواد) برش المواد الغذائية على رأس الماء.
- تسمح اليرقات 3 – 4 ح آر وثم نقلها إلى بيئة نظيفة (أي طعام) طبق بتري يحتوي على حوالي 50 مل الأجنة الطازجة المتوسطة.
- للمساعدة في نقل القليل من الطعام قدر الإمكان، شطف كل يرقة في طبق بتري يحتوي على حوالي 50 مل الأجنة الطازجة المتوسطة قبل النقل النهائي للطبق الجديد.
- تكرار الرضاعة والشطف اليرقات في إدارة الشرطة الاتحادية 5 و 6 إدارة الشرطة الاتحادية.
3-إعداد الغذاء الفلورسنت على إدارة الشرطة الاتحادية 6 وتغذية لليرقات في إدارة الشرطة الاتحادية 7
- إعداد الأغذية التي تحتوي على تسمية فلورسنت (المشار إليها كغذاء الفلورسنت، وفقا لأساليب الحقل et al. 3)-باختصار، مزيج 300 ميليلتر الفلورسنت تسمية (انظر الجدول للمواد)، 100 ميليلتر من المياه، و 200 ملغ من مسحوق غذاء اليرقات في زجاج يشاهد 10 سم.
- انتشار لصق الناتج في طبقة رقيقة على الزجاج مشاهدة. السماح للصق لتجف في درجة حرارة الغرفة في الظلام > ح 8.
- كشط الخليط المجففة قبالة الزجاج يشاهد، وسحق لمسحوق، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة في الظلام. الغذاء الفلورسنت جاهز الآن ليتم تغذية اليرقات.
- في إدارة الشرطة الاتحادية 7، إطعام الطعام الفلورسنت لليرقات بنفس الطريقة كما فعلت للوجبات السابقة، هو توفر 2 مغ الأغذية الفلورسنت كل طبق (انظر الخطوات 2.1-2.2.1).
ملاحظة: تأكد من أن الغذاء هو ناعما الأرض إلى مسحوق. فرك الغذاء الفلورسنت الملتفة في وزن الورق بين الإبهام والسبابة طريقة مفيدة لضمان دقة الأغذية الأرضية.
4-إعداد الحلول الجرعات المركزة لاختبار المركبات
- حل كل اختبار المركب في المتوسطة الجنين إلى تركيز هو 2 x الجرعة المستهدفة. إذا كان المطلوب هو اختبار مجموعة الجرعة، إعداد عدة حلول الجرعات المركزة التركيزات المناسبة للجرعات المطلوبة.
- إعداد ما يكفي من كل حل الجرعات المركزة حيث تتم معاملة اليرقات 24. سوف تتطلب كل يرقة 100 ميليلتر الجرعات الحل (الحجم النهائي للبئر الواحد هو 200 ميليلتر)، حتى في أقل تقدير الجرعة 2.4 مل الحل المسبق لكل مجموعة العلاج؛ وسيكون 2.5 مل حجم مناسب.
- إذا تم استخدام المذيبات (أي، ثنائي ميثيل سلفوكسيد) سولوبيليزينج الأولى من مجمع الاختبار، تعد الجرعة مراقبة المركبات المناسبة (أي نفس كمية المذيب كعلاج مركب ولكن دون المجمع). وكما حدث لكل مجموعة المعالجة بالمجمع، إعداد كافية حل مركبة لعلاج اليرقات 24.
5-نقل اليرقات إلى لوحة 96-جيدا و "تطبيق العلاج"
- بعد قد سمح اليرقات لتتغذى على الغذاء الفلورسنت ح 2، استخدام ماصة نقل لنقلها إلى طبق شطف، مثلما حدث بعد الرضاعة في الأيام السابقة.
- بعد هي تشطف كل يرقة، تسحب ذلك جنبا إلى جنب مع 100 ميليلتر الجنين المتوسطة، ونقله إلى بئر للوحة متعددة جيدا مخروطية الشكل السفلي البوليستيرين 96-جيدا (انظر الجدول للمواد)، الاستغناء عن المتوسط الجنين ميليلتر الكامل 100 في البئر مع اليرقة.
- بمجرد تم نقل الأرقام المطلوبة من اليرقات إلى 96-جيدا--اللوحة، إضافة 100 ميليلتر من 2 × تتركز الحلول الجرعات لكل بئر.
ملاحظة: يسهل استخدام ماصة متعددة القنوات 12 قناة الجرعات السريعة لليرقات (12 في الوقت). لتجنب إضافة معالجة الخطأ بطريق الخطأ، تتبع الوثيق الذي قد تم مداوي مع أي علاج اليرقات ويجب التأكد من تغيير نصائح ماصة بين العلاجات.
6-تدبير Fluorescence الأولية واللاحقة من كل بئر
- بعد إضافة حلول الجرعة، ضع 96-جيدا--اللوحة إلى جهاز المطياف الضوئي لوحة قادرة على إثارة والكشف عن انبعاثات من التسمية الفلورسنت.
ملاحظة: للأصفر والأخضر التسمية المستخدمة (انظر الجدول للمواد)، الأطوال الموجية المناسبة للضوء مثيرة في 505 نانومتر وكشفها في 515 نانومتر. - قراءة الأسفار من 96-جيدا--اللوحة من أسفل 5 مرات على التوالي الفوري دون اهتزاز اللوحة. استخدام قيمة الحد الأدنى من القراءات 5 من كل بئر الأسفار الأولى من البئر.
ملاحظة: هو السبب في أن تؤخذ القراءات 5 كلما اللوحة للقراءة أن يرقات تسبح أحياناً في مسار الضوء الإثارة والطعام في القناة الهضمية ما تنبعث إشارة كبيرة جداً وغير تمثيلي البراز المفرج عنهم. اتخاذ الحد الأدنى من 5 على ما يلي يمكن أن تساعد على تجنب استخدام قياسات ارتفاع مصطنع من الأغذية غير العابرة. - قراءة الأسفار من 96-جيدا--اللوحة (كما كان الحال في القراءة الأولى) كل 20 دقيقة ح 2 الأولى بعد انتهاء الجرعات كل 30 دقيقة لساعة 3 و 4 بعد الجرعات، وبعد ذلك مرة كل ساعة لمدة ساعة 5، 6 و 7 و 8 بعد الجرعات.
- اتخاذ الحذر عدم الإزعاج (التي تهز 96-جيدا--اللوحة) استقر البراز بين القراءات واحتضان اليرقات في 28 ± 1 درجة مئوية بين القراءات.
- احتضان اليرقات طوال الليل في 28 ± 1 درجة مئوية، وقراءة الأسفار من 96-جيدا--اللوحة في صباح اليوم التالي في نفس الوقت تقريبا الذي كانت جرعتي اليرقات في اليوم السابق. استخدام هذا القياس الأسفار الجرعة بعد 24 ساعة.
7-تحليل البيانات
ملاحظة: هنا نقوم بحساب تراكم كل بئر ومجموعة المتوسطات لكل نقطة في الوقت.
- لحساب تراكم الواحدة كذلك، باستخدام قيم الحد الأدنى فقط من كل من يقرأ 5، طرح القيمة الأولية من قيمة كل نقطة الوقت. إجراء هذه العملية الحسابية للقيمة الأولية، وكذلك (وهذا يؤدي إلى تراكم أولية من الصفر لكل بئر).
- إذا التراكم في بئر في النقطة الزمنية ح 24 أقل من 150 وحدات الفلورسنت النسبي، يستبعد ذلك جيدا من مزيد من التحليل؛ هذه القيم المنخفضة على الأرجح سبب منخفضة أو لا تناول الطعام الفلورسنت باليرقات خلال تغذية، وهكذا تلك اليرقات ليست مواضيع جيدة لقياس وقت العبور.
- لكل نقطة من الزمن، حساب تراكم متوسط للآبار المحتوية على اليرقات شارك المعالجة، فضلا عن الخطأ القياسي لتلك المعدلات.
- مؤامرة تراكم متوسط على المحور الصادي مقابل الوقت على المحور السيني لكل مجموعة في المعاملة والمقارنة بين المناطق الواقعة تحت تلك المنحنيات (أوكس).
ملاحظة: سيكون العلاجات التي بطيئة بشكل ملحوظ أو تسريع وقت العبور أوكس إلى حد كبير أصغر أو أكبر، على التوالي، من المجموعة المعالجة بالمركبات.
Representative Results
يمكن استخدام هذا الأسلوب، الذي يستخدم كانت تستند إلى لوحة لتقييم غي المرور العابر، كبديل الفائق للفحص المجهري نيون، وأسلوب إنتاجية أقل لتقييم نفس الوظيفة (الشكل 1). لتوليد البيانات في الشكل 1، تم تحليل الأسماك المعالجة مطابق تماما للعبور غي استخدام fluorescence مجهرية (الممثل الصور المعروضة) أو كانت في نقاط زمنية 4، 0، 4 و 8 و 24 ساعة بعد انتهاء الجرعات؛ مقارنة البيانات من تلك التجارب أعطت نتائج عالية مرتبطة (الانحدار الخطي للبيانات r2 = 0.95). الانحدار الخطي بمنحدر سلبية لتدابير الفحص المجهري إشارة fluorescence المحتفظ بها وكانت تدابير الإشارة العابرة.
يمكن الكشف عن آثار مركبات آليات متباينة، مع نشاط غي الراسخة في البشر، في الزرد باستخدام مقايسة كانت (الشكل 2). مقارنة بعناصر المعالجة بالمركبات، الأتروبين (4.2 ميكرومتر) واميتربتيلين (5 ميكرون) تباطأ غي العبور، بينما تيجاسيرود (3.3 ميكرومتر) وتسارع ميتوكلوبراميد (33 ميكرومتر) وقت العبور. الاريثروميسين (14 ميكرومتر)، يتوقع لتسريع وقت العبور ليس أثر مقاسا بهذا الأسلوب. وكانت معاملة مجموعة أحجام 24 قبل إزالة البيانات من اليرقات مع عدم وجود أو جداً منخفض إشارة. أوك للإشارة متوسط كل الوقت نقطة مقارنة بين المجموعات المعالجة بالمجمع، والمعالجة بالمركبات استخدام توكي في "فرق كبير بصراحة" للتحكم في نوع-1-خطأ. تعتبر الآثار الهامة فقط عندما p ≤ 0.05. وكانت التركيزات المستخدمة للعلاجات المذكورة أعلاه الحد الأقصى للتسامح مع الجرعات والعزم في تجربة سابقة ويعرف أعلى جرعة مع أي تأثير ضار ملحوظ بالرصد الإجمالي.
يمكن قياس الإنزيم كانت آثار الجرعة تعتمد على المركبات. الشكل 3 يوفر البيانات التي تبين أن الأتروبين تبطئ العبور غي جرعة [دبندنتلي] في الزرد اليرقات. اختبار, ميكرومتر 0.042 أدنى جرعة من الأتروبين، لم يكن لها تأثير كبير، بينما كان اثنان أعلى تركيزات كل أثر كبير، 0.42 ميكرون بعد أقل من تأثير من 4.2 ميكرومتر.
ويمكن تقييم مقايسة جديدة عن طريق اختبار الضوابط الإيجابية والسلبية، هي المركبات التي من المعروف أن النشطة وغير النشطة على التوالي في النظام الهدف (في هذه الحالة هو نظام الهدف بعبور غي الثدييات). للمقايسة كانت، تم اختبار 18 نشاطا (الإيجابية) فرض ضوابط و 6 غير نشط (السلبية). وبناء على هذه التجارب، قد المقايسة كانت عالية القيمة التنبؤية الإيجابية (90.9%)، ولكن حساسية منخفضة (55.6 في المائة) والقيمة التنبؤية السلبية (38.5%). تشتق هذه القيم من البيانات المقدمة في الجدول 1. وهي تعكس، في الممارسة العملية، أنه إذا تأثر وقت العبور الزرد بعلاج، العابر الثدييات من المحتمل أن تتأثر. ومع ذلك، إذا لم يكن هناك أي تأثير على وقت العبور الزرد، هذا ليس من التنبؤية لتأثير الثدييات.
الشكل 1: الكشف عن عبور الغذاء فلوري كفقدان إشارة من التصوير المجهري وربح مقابلة في إشارة التي كانت تستند إلى لوحة- (أ) الصور المجهرية الممثل من تحليل لتأثير الأتروبين (4.2 ميكرومتر) في وقت العبور غي. إشارة (ب) متوسط كمية من الصور المجهرية عالية (سلبا) مرتبطة بإشارة من البراز الملغاة (كانت) من الأسماك المعالجة مطابق تماما. بيانات من الأسماك معاملة الأتروبين باللون الأحمر. وهذا الرقم نسخها بإذن من كسار et al. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تحليل الإشارات الفلورسنت تراكم على مر الزمن من لوحة متعددة جيدا يتيح تحديد العلاجات التي تغير معدل العبور غي- تشير العلامة النجمية (*) إلى أوك تختلف اختلافاً كبيرا من الأسماك المعالجة بالمركبات. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ القياسي لإشارة يعني لليرقات في مجموعة العلاج كل مرة نقطة. وهذا الرقم قد تم استخدامها بإذن من كسار et al. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الأتروبين الجرعة-[دبندنتلي] يؤدي إلى إبطاء وقت عبور القناة الهضمية الزرد كما تعكسه الفلورية كانت تراكم البراز مع مرور الوقت- تشير العلامة النجمية (*) إلى أوك تختلف اختلافاً كبيرا من الأسماك المعالجة بالمركبات. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ القياسي لإشارة يعني لليرقات في مجموعة العلاج كل مرة نقطة. وهذا الرقم يتم استخدامها بإذن من كسار et al. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: غي نشاط مركبات 24 في الثدييات والأسماك- يتم إعادة استخدام هذا الجدول بإذن من كسار et al. 11.
Discussion
كانت الرواية أسلوب قياس الزرد اليرقات وقت العبور غي، المعروضة هنا، هو فحص كفاءة التي يمكن التنبؤ بآثار العلاج على وظيفة غي الثدييات. على الرغم من الفحص لديه حساسية منخفضة، فقد بريديكتيفيتي إيجابية عالية، ومقبول لفحوصات الطبقة الأولى المستخدمة للتقشير أسفل عدد العلاجات المرشح استناداً إلى السمية12. هذا الأسلوب هو أسهل لتنفيذ ولديه أعلى من الناتج ويستخدم أقل الحيوان التعامل مع الخطوات من مجهر فلوري.
وهناك تحديات التقنية الملازمة لهذا الأسلوب. اصطياد اليرقات الفردية بعد إطعام الطعام الفلورسنت وتحويلها إلى الآبار الفردية يمثل تحديا في البداية. ومع ذلك، مع الممارسة، يمكن ملء أحد الفنيين مهرة صفيحة 96-جيدا في أقل من 15 دقيقة. إذا، في نقطة زمنية معينة، وهو اللوحة تهتز بطريق الخطأ وغير مستقر البراز من الجزء السفلي من الآبار قبل القراءة، سوف تظهر التراكم الانخفاض. ويمكن تجنب هذا بالانتقال plate(s) بعناية، دون المصافحة. في تجربتنا، عدم الإزعاج الحركة العادية، بما في ذلك جهاز المطياف الضوئي لوحة درج المزودة بمحركات، التحليل. لوحة القراء مزودة بسخان (أياللوحة لم يتم إرجاعها إلى حاضنة بين القياسات)، ويقع قرب المقايسة البدلاء المختبر يمكن الأمثل لأدنى فرصة للاضطراب، ولكن هذا ليس ضروريا في تجربتنا.
لم تشمل المحاولات المبكرة في الطريقة التغذية في الأيام التي سبقت المقايسة. دون تلك الوجبات 'الممارسة'، تستهلك عدد أقل من اليرقات الغذاء الفلورسنت كافية خلال الوقت المسموح به قبل تطبيق العلاج. في هذه المحاولات، تباين داخل المجموعات المعاملة كان أكبر، ومزيد من البيانات غير قابلة للاستخدام بسبب إشارة منخفضة/لا تراكم على مر الزمن. حتى مع ممارسات التغذية، لا يتناولون كميات كافية من الأغذية الفلورسنت بعض اليرقات، باستثناء البيانات من تلك اليرقات إنقاص التباين داخل المجموعات ويزيد من القدرة على تحديد آثار العلاج. بدءاً بأحجام أكبر مجموعة (أي 24 مقابل 12) يسمح لعدد كاف من اليرقات المساهمة بيانات مفيدة للتحليل.
مجهر فلوري يكشف أن عبور المواد الغذائية قد أوشك على الاكتمال قبل 24 ساعة في يرقات معاملة الأتروبين (غير معروضة)، بيد أن تعكس البيانات الميكروسكوبية من النقطة الزمنية النهائية أدنى إشارة النهائي في المجموعة الأتروبين، مقارنة بمجموعة مركبة. على العكس من ذلك، أعلى الميكروسكوبية النهائي fluorescence ارتبط بالعلاجات التي تسارع الوقت العابر، على الرغم من أن اليرقات المعالجة بالمركبات قد باطلة على ما يبدو على الجهاز الهضمي قبل الوقت النهائي النقطة. بناء على الإحالة العشوائية إلى معاملة اليرقات تغذيها الغذاء الفلورسنت، نفترض ما يعادل استهلاك الأغذية الفلورسنت، في المتوسط، بين مجموعات العلاج. ونظرا لذلك، واستنادا إلى الأنماط المذكورة أعلاه، الأسفار من البراز ينخفض مع الوقت الذي يقضيه في الجهاز الهضمي اليرقات أو العبور أسرع يضيف الأسفار إلى البراز بطريقة ما. السبب الحقيقي غير معروف وقد تم استجوابهم لا، لكن ما زال التحليل قادر على قياس ومقارنة وقت العبور بين المجموعات.
توظيف هذا الأسلوب في الكشف عن آثار غي سمية من المركبات جزيء صغير من تطبيق واحد. وتشمل التطبيقات المحتملة الأخرى النمذجة المرض (مثلاً، القولون العصبي) واكتشاف رواية العلاج لمثل هذه الأمراض، أو لاكتشاف مركبات برو-الحركية. وعلاوة على ذلك، إلى جانب نماذج معدلة وراثيا، يمكن استخدام هذا الأسلوب لاستجواب دور الجينات في العبور غي العادية، فضلا عن اضطرابات العابر، بما في ذلك نقص العصبية المعوية. اليرقة الزرد يوفر منبرا الكائن حي كله على نطاق ويقترب من استزراع الخلايا، ولكن نظراً لوجود متعددة الأنسجة وأنواع الخلايا العديدة تعمل معا في الزرد، أسئلة بيولوجيا الأنظمة يمكن أن يطلب والرد عليها باستخدام هذا نموذج.
مع التقدم في التكنولوجيا، وتطبيقات جديدة منه، سوف تستمر الكفاءة في إجراء اختبارات السمية الزرد تحسين. الزرد اليرقات التعامل مع أساليب وفحوصات مستمرة لتحسين من حيث أعلى سرعة نقل13،14. أسلوب الرواية المقدمة هنا مثال واحد من التحسن قد تجعل الدراسات الزرد أكثر تأثيراً.
Disclosures
تصميم وإجراء الدراسة، وتقديم الدعم المالي لهذا البحث قدمت أبفيي. وشارك أبفيي في تفسير البيانات والمراجعة والموافقة على هذه المخطوطة. س. كسار، X. Huang، وكول ت. غير العاملين أبفيي ولا تضارب إضافية في الكشف عن.
Acknowledgments
سيمون كسار من carpetbones.com تصميم وإنشاء الرقم متحركة تستخدم لإثبات إجراءات الفحص العابر غي في الحياة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wild type zebrafish breeding pair | Various sources - for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
| 1.7 L Breeding Tank - Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
| Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
| First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
| Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
| V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
| Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
| Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
| Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
| Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |
References
- Berghmans, S., et al. Zebrafish based assays for the assessment of cardiac, visual, and gut function - Potential safety screens for early drug discovery. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 58 (1), 59-68 (2008).
- Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterology and Motility. 21, 304-312 (2009).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Shepherd, I., Eisen, J. Development of the zebrafish enteric nervous system. Methods in Cell Biology. 101, 143-160 (2011).
- Holmberg, A., Olsson, C., Holmgren, S. The effects of endogenous and exogenous nitric oxide on gut motility in zebrafish Danio rerio embryos and larvae. The Journal of Experimental Biology. 209, 2472-2479 (2006).
- Olsson, C., Holmber, A., Holmgren, S. Development of enteric and vagal innervation of the zebrafish (Danio rerio) gut. The Journal of Comparative Neurology. 508, 756-770 (2008).
- Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: A feasibility study. Inflammatory Bowel Disease. 16 (7), 1162-1172 (2010).
- Cook, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five-dimensional framework. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. Eugene, OR, USA. (2000).
- Cassar, S., Huang, X., Cole, T. A high-throughput method for predicting drug effects on gut transit time using larval zebrafish. Journal of Pharmacolical and Toxicological Methods. 76, 72-75 (2015).
- McKim, J. M. Building a tiered approach to in vitro predictive toxicity screening: A focus on assays with in vivo relevance. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 13 (2), 188-206 (2010).
- Bruni, G., Lakhani, P., Kokel, D. Discovering novel neuroactive drugs through high-throughput behavior-based chemical screening in the zebrafish. Frontiers in Pharmacology. 5, 153 (2014).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17, 66-74 (2012).
