Summary
L'obiettivo del presente protocollo è quello di misurare il tempo di transito di fluorescente contrassegnato cibo attraverso l'intestino di zebrafish larvale in modo elevato throughput.
Abstract
Zebrafish sono utilizzati come organismi modello alternativo per droga test di sicurezza. Tratto gastrointestinale (GI) di zebrafish ha somiglianze genetiche, neuronali e farmacologiche a quello dei mammiferi. L'intolleranza GI durante la sperimentazione clinica dei farmaci candidati è comune e può rappresentare una grave minaccia per la salute umana. Prove di tossicità GI in modelli preclinici di mammiferi può essere costosa in termini di tempo, composto in esame e manodopera. Il metodo di alto-rendimento qui presentato può essere utilizzato per prevedere i problemi di sicurezza di GI. Rispetto ai modelli dei mammiferi, questo metodo consente piu ' opportuno valutazione di prova effetti composti su GI transito durante l'utilizzo di basse quantità di composto. In questo metodo, zebrafish larvale (7 giorni dopo la fecondazione) vengono nutriti con cibo contenente un'etichetta fluorescente. Dopo la poppata, ogni pesce larvale è collocato in un pozzetto di una piastra a 96-conico-fondo-pozzetti e dosato con composto in esame (disciolto in acqua) o il veicolo. Come transito intestinale si verifica, materia fecale si accumula sul fondo dei pozzi e il tasso a cui questo accade è monitorato misurando fluorescenza dal fondo del pozzo ripetutamente nel tempo utilizzando uno spettrofotometro di piastra. La fluorescenza da larve in un gruppo dato trattamento sono media e questi valori sono rappresentati graficamente con errore standard, per ogni tempo di misura, producendo una curva che rappresenta la media transito del cibo nel corso del tempo. Effetti sul tempo di transito dell'intestino sono identificati confrontando l'area sotto la curva per ciascun gruppo di trattamento a quello del gruppo veicolo-trattato. Questo metodo ha rilevato modifiche nel tempo di transito di zebrafish GI indotto da farmaci con effetti clinici conosciuti di GI; può essere impiegato per interrogare decine di trattamenti per GI effetti al giorno. Come tale, composti più sicuri possono essere rapidamente la priorità per il test dei mammiferi, che accelera l'avanzamento di 3Rs scoperta e porge.
Introduction
Zebrafish (Danio rerio) vengono utilizzati per modellare la biologia dei vertebrati e prevedere la tossicità dei farmaci e/o efficacia; nuove applicazioni in questi campi emergono ogni anno. I vantaggi di zebrafish sopra modelli mammiferi comprendono la loro fecondità, piccole dimensioni e la trasparenza attraverso l'organogenesi. Zebrafish sono usati per predire candidato acuta tossicità dei farmaci, nonché valutare composto impatto sulla funzione dell'organo, per esempio, cardiaco, oculare, gastrointestinale (GI)1,2. Fisiologia e sviluppo di Zebrafish sono simili a quelli dei mammiferi in molti modi3 e 80% dei geni che sono associati con la malattia umana hanno un omologo di zebrafish4.
Il tratto di GI di zebrafish fisiologia simile tratto gastrointestinale dei mammiferi ma ha un' architettura più semplice5. Zebrafish non hanno nessun stomaco; la lampadina anteriore intestinale agisce come un deposito di cibo. Espressione genica in zebrafish intestino ha molte similitudini con quello del mammifero5. Come mammiferi, del sistema nervoso enterico di zebrafish controlla la motilità dell'intestino e innervazione intestinale rispecchia quella di altri vertebrati6,7. Basandosi su queste somiglianze, disturbi funzionali dell'intestino umano sono state studiate in zebrafish, utilizzando metodi derivati da modelli mammiferi8.
L'intolleranza GI durante la sperimentazione clinica dei farmaci candidati è comune e può rappresentare una grave minaccia per la salute umana. Una revisione dei programmi in un'importante azienda farmaceutica nel corso del 2005 – 2010 ha rivelato GI sicurezza come la causa principale di studio clinico terminazioni9il 9%. Prove di tossicità GI in modelli preclinici di mammiferi può essere costosa in termini di tempo, composto e del lavoro. Un'analisi di alto-rendimento predittiva per transito GI può fornire flessibilità per compound test di tossicità e fornire 3Rs impatto. Un metodo novello che offre tale prova è presentato dal protocollo descritto nel presente documento. Questo test di alto-rendimento potrebbe essere impiegato presto nello sviluppo di farmaci per prioritizzare i candidati e contribuire alla riduzione della sicurezza GI test nelle specie più grandi.
Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura istituzionale degli animali ed uso Committee (IACUC) di AbbVie.Abbvie opera sotto l'istituti nazionali di salute Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio in una struttura accreditata dall'associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio animale cura (AAALAC). Nessun preoccupazioni per la salute degli animali sono state osservate in questi studi.
1. razza Zebrafish adulto e raccogliere embrioni
- Casa e razza zebrafish adulto utilizzando allevamento generale e pratiche di allevamento. Ad esempio, Vedi Westerfield10.
- Preparare il supporto di embrione sciogliendo disidratato sale marino (Vedi Tabella materiali) deionizzata in acqua ad una concentrazione di 60 mg/L.
- Raccogliere fecondate le uova dalla camera adulti da riproduzione, sciacquare bene con il mezzo di embrione e casa di embrioni in circa 50 mL di mezzo di embrione in capsule di Petri 10cm (50 embrioni per ogni piatto) in 28 ± 1 ° C su un 14:10 h luce: ciclo scuro.
- Rimuovere gli embrioni non sopravvivere dopo 24 h e integratore con embrioni di sopravvivenza in modo che ogni piatto contiene 50 embrioni per ogni piatto.
2. treno larve al Feed utilizzando cibo Non tinto
- 4th giorno post-fertilizzazione (4 dpf), nutrono le larve in ogni capsula di Petri 2 mg di cibo per pesci larvale in polvere (Vedi Tabella materiali) spruzzando il cibo in cima all'acqua.
- Consentire le larve 3 – 4 h per nutrire e poi trasferirli in un ambiente pulito (senza cibo) piatto di Petri contenente circa 50 mL di liquido di embrioni freschi.
- Per facilitare il trasferimento come poco cibo possibile, sciacquare ogni larva in una piastra Petri contenente circa 50 mL di liquido di embrioni freschi prima del trasferimento definitivo per il nuovo piatto.
- Ripetizione di alimentazione e risciacquo delle larve il dpf 5 e 6 dpf.
3. preparare alimenti fluorescenti su 6 dpf e mangimi alle larve il dpf 7
- Preparare il cibo contenente un'etichetta fluorescente (in appresso denominato cibo fluorescente, secondo metodi di campo et al. 3). mescolare brevemente, 300 µ l di fluorescente etichetta (Vedi Tabella materiali), 100 µ l di acqua deionizzata e 200 mg di larvale alimento su un vetro da orologio 10cm in polvere.
- Spatolare la pasta risultante in uno strato sottile sul vetro d'orologio. Consentire la pasta ad asciugare a temperatura ambiente al buio per > 8 h.
- Raschiare la miscela secca fuori il vetro d'orologio, schiacciare per polvere e conservare a temperatura ambiente al buio. Il cibo fluorescente è ora pronto per essere nutriti per le larve.
- Il dpf 7, dar da mangiare il cibo fluorescente per le larve nello stesso modo come fatto per le poppate precedente, che è fornire 2mg fluorescente cibo per ogni piatto (Vedi punti 2.1 – 2.2.1).
Nota: Assicurarsi che il cibo è finemente polverizzate. Sfregamento cibo fluorescente che è avvolto in carta tra pollice e indice di pesatura è un metodo utile per garantire finemente terra cibo.
4. preparare soluzioni concentrate dosaggio di sostanze da testare
- Sciogliere ogni test composto nel mezzo di embrione ad una concentrazione che è 2 volte la dose di destinazione. Se si desidera la sperimentazione di una gamma della dose, preparare più soluzioni concentrate di dosaggio delle concentrazioni adeguate per le dosi di desiderata.
- Preparare abbastanza di ogni soluzione concentrata di dosaggio in modo che 24 larve possono essere trattate. Ogni larva richiederà 100 µ l di soluzione (il volume finale per pozzetto è 200 µ l), di dosaggio così alla dose di meno, 2,4 mL soluzione è necessaria per ciascun gruppo di trattamento; 2,5 mL sarebbe un volume adeguato.
- Se un solvente (cioè, dimetilsolfossido) è stato usato per solubilizzare iniziale del composto in esame, preparare la dose di controllo veicolo appropriato (cioè, stessa quantità di solvente come il trattamento composto ma senza il composto). E, come è stato fatto per ogni gruppo composto-trattati, preparare soluzione abbastanza veicolo per trattare 24 larve.
5. trasferire le larve in una piastra a 96 pozzetti e applicare trattamenti
- Dopo le larve sono stata autorizzate a nutrirsi di cibo fluorescente per 2 h, è possibile utilizzare una pipetta di trasferimento per spostarli in un piatto di lavaggio in controcorrente, come è stato fatto dopo l'alimentazione nei giorni precedenti.
- Dopo ogni larva è risciacquato, ritirarlo insieme a mezzo di embrione 100 µ l e spostarlo in un pozzetto di una piastra multi-pozzetto di fondo conico 96 pozzetti in polistirolo (Vedi Tabella materiali), il mezzo di embrione di 100 µ l di erogazione nel pozzo con la larva.
- Una volta che i numeri richiesti delle larve sono stati trasferiti alla piastra a 96 pozzetti, aggiungere 100 µ l di 2 × concentrato soluzioni di dosaggio ad ogni pozzetto.
Nota: L'uso di una pipetta multicanale 12 canali facilita il dosaggio rapido delle larve (12-a-a-tempo). Per evitare di aggiungere accidentalmente il trattamento sbagliato, tenere traccia stretta di cui le larve sono state dosate con quale trattamento ed essere sicuri di cambiare puntali fra i trattamenti.
6. la misura iniziale e successivo fluorescenza da ciascun pozzetto
- Dopo aver aggiunto le soluzioni di dose, posizionare la piastra a 96 pozzetti in uno spettrofotometro piastra capace di eccitante e rilevare le emissioni dall'etichetta fluorescente.
Nota: Per l'etichetta di colore giallo-verde (Vedi la Tabella materiali), le lunghezze d'onda appropriate di luce sono entusiasmanti a 505 nm e rilevazione a 515 nm. - Leggere la fluorescenza della piastra a 96 pozzetti dal fondo 5 volte in successione immediata senza agitare la piastra. Utilizzare il valore minimo delle 5 letture da ogni pozzetto come la fluorescenza iniziale dal pozzo.
Nota: Il motivo per cui 5 letture avvengono ogni volta che la piastra è leggere è che larve talvolta nuotare nel percorso della luce di eccitazione e il cibo nel loro intestino emette un segnale molto grande che è rappresentativo delle feci rilasciate. Prendendo il minimo del 5 legge può aiutare a evitare l'uso di misure artificialmente elevate dal cibo non-transitato. - Leggere la fluorescenza della piastra a 96 pozzetti (come è stato fatto per la lettura iniziale) ogni 20 min per i primi 2 h dopo la somministrazione, ogni 30 min per ore 3 e 4 dopo il dosaggio e poi una volta ogni ora per ore 5, 6, 7 e 8 dopo la somministrazione.
- Prendere cautela per non disturbare (agitando la piastra a 96 pozzetti) si stabilì di materia fecale tra letture e incubare le larve a 28 ± 1 ° C tra letture.
- Incubare le larve tutta la notte a 28 ± 1 ° C e leggere la fluorescenza dalla piastra a 96 pozzetti la mattina seguente intorno allo stesso tempo che le larve sono state dosate il giorno prima. Utilizzare questa misura come la fluorescenza di 24 h dopo la somministrazione.
7. analizzare i dati
Nota: Qui calcoliamo accumulo per pozzetto e gruppo medie per ogni punto di tempo.
- Per calcolare l'accumulo per pozzetto, utilizzando valori solo minimi da ciascuno dei 5 legge, sottrarre il valore iniziale dal valore di ogni punto di tempo. Eseguire questo calcolo per il valore iniziale pure (questo provoca un'accumulazione iniziale pari a zero per ogni pozzetto).
- Se l'accumulo in un pozzo presso il punto di tempo di 24 ore è inferiore a 150 unità relative fluorescente, escludere cosi ' bene da ulteriori analisi; questi valori bassi sono molto probabilmente a causa di bassa o nessuna assunzione dell'alimento fluorescente dalle larve durante l'allattamento, e così quelli larve non sono buoni oggetti per misurare il tempo di transito.
- Per ogni punto di tempo, calcolare l'accumulo medio per pozzetti contenenti larve-trattate con co, come pure l'errore standard di quelle medie.
- Tracciare l'accumulo medio sull'asse y contro ora l'asse x per ogni gruppo di trattamento e confrontare le aree sotto le curve (AUC).
Nota: Trattamenti che significativamente rallentare o accelerano il tempo di transito avrà AUC significativamente inferiori o superiori, rispettivamente, rispetto al gruppo di veicolo-trattati.
Representative Results
Questo metodo, che utilizza la piastra-base spettrofotometria per valutare GI transito, può essere utilizzato come un sostituto di alto-rendimento di microscopia fluorescente, che è un metodo di rendimento inferiore per valutare la funzione stessa (Figura 1). Per generare i dati nella Figura 1, pesce identicamente trattati sono stati analizzati per transito GI mediante microscopia a fluorescenza (immagini rappresentative indicati) o spettrofotometria a 4 punti di tempo, 0, 4, 8 e 24 h dopo la somministrazione; confronto dei dati da tali esperimenti hanno dato risultati altamente correlate (regressione lineare dei dati r2 = 0.95). La regressione lineare ha una pendenza negativa perché il segnale di fluorescenza mantenuto di misure di microscopia e spettrofotometria misure il segnale transitato.
Gli effetti dei composti di meccanismi disparati, con consolidata attività di GI in esseri umani, possono essere rilevati in zebrafish usando l'analisi spettrofotometria (Figura 2). Confrontato ai comandi veicolo-trattati, atropina (4,2 µM) e amitriptilina (5 µM) rallentato transito GI, mentre tegaserod (3,3 µM) e metoclopramide (33 µM) ha accelerato i tempi di transito. Eritromicina (14 µM), dovrebbe accelerare il tempo di transito non ha avuto effetto come misurato da questo metodo. Dimensioni del gruppo di trattamento erano 24 prima di rimozione di dati da larve con no o molto basso segnale. L'AUC per il segnale medio per punto di tempo è stato confrontato fra gruppi composto-trattati e veicolo-trattati utilizzando onestamente differenza significativa di Tukey per tipo-1-errore di controllo. Gli effetti sono stati considerati significativo solo quando p ≤ 0,05. Le concentrazioni utilizzate per i trattamenti di cui sopra sono stati il massimo tollerato dosi, determinata in un esperimento preliminare e definito come la più alta dose senza effetto avverso osservabile tramite l'osservazione lordo.
Il dosaggio di spettrofotometria può misurare gli effetti dose-dipendente dei composti. Figura 3 fornisce dati che dimostrano che l'atropina rallenta transito GI dose-dipendente nelle larve di zebrafish. La dose più bassa di atropina testato, 0,042 µM, non hanno avuto effetto, mentre le due concentrazioni superiori ha avuto un impatto significativo, 0.42 µM avendo meno di un effetto di 4,2 µM.
Una nuova analisi può essere valutata da prova controlli positivi e negativi, vale a dire composti noti per essere attivi e inattivi rispettivamente nel sistema di destinazione (in questo caso il sistema di destinazione è il transito GI dei mammiferi). Per il dosaggio di spettrofotometria, 18 controlli attivi (positivi) e 6 controlli inattivi (negativi) sono stati testati. Basato su questi esperimenti, il saggio di spettrofotometria ha elevato valore predittivo positivo (90,9%), ma bassa sensibilità (55,6%) e valore predittivo negativo (38,5%). Questi valori sono derivati dai dati presentati in tabella 1. Essi riflettono, in pratica, che se il tempo di transito di zebrafish è percosso da un trattamento, mammiferi transito rischia di essere influenzato. Tuttavia, se non c'è alcun effetto sul tempo di transito di zebrafish, questo non è predittivo dell'effetto dei mammiferi.
Figura 1: transito di cibo fluorescente viene rilevato come una perdita di segnale da formazione immagine microscopica e un corrispondente aumento di segnale mediante spettrofotometria piastra-base. (A) rappresentante immagini microscopiche dall'analisi dell'effetto dell'atropina (4,2 µM) il tempo di transito di GI. (B) media del segnale quantificata da immagini microscopiche è altamente correlata (negativamente) con segnale dalla materia fecale annullato (spettrofotometria) dai pesci trattati in modo identico. Dati da atropina-trattati pesce sono in rosso. Questa figura copiata con permesso da Cesana et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Analisi accumulo di segnale fluorescente nel tempo da una piastra multi-pozzetto permette l'identificazione di trattamenti che cambiare tasso di transito GI. Asterisco (*) indica AUC significativamente differente rispetto pesce veicolo-trattati. Barre di errore rappresentano la deviazione standard del segnale medio per le larve nel gruppo del trattamento al punto di tempo. Questa figura è stata riutilizzata con permesso da Cesana et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Atropina dose-dipendente rallenta il tempo di transito dell'intestino zebrafish come riflesso dalla spettrofotometria fluorescente di accumulazione fecale nel corso del tempo. Asterisco (*) indica AUC significativamente differente rispetto pesce veicolo-trattati. Barre di errore rappresentano la deviazione standard del segnale medio per le larve nel gruppo del trattamento al punto di tempo. Questa cifra viene riutilizzata con permesso da Cesana et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Attività di GI di 24 composti nei mammiferi e pesci. Questa tabella viene riutilizzata con permesso da Cesana et al. 11.
Discussion
Il metodo di romanzo spettrofotometria per misurare il tempo di transito di zebrafish larve GI, qui presentato, è un'analisi efficiente che può predire gli effetti del trattamento su mammiferi GI-funzione. Anche se il saggio ha bassa sensibilità, ha alta predittività positiva, che è accettabile per primo livello dosaggi impiegati per paring giù il numero di candidati trattamenti basati su tossicità12. Questo metodo è più facile da eseguire, ha un throughput più elevato e utilizza meno animale gestire passaggi di microscopia fluorescente.
Ci sono sfide tecniche inerenti a questo metodo. Cattura di larve individuale dopo l'alimentazione il cibo fluorescente e trasferirli in singoli pozzetti è difficile all'inizio. Tuttavia, con la pratica, un tecnico specializzato può riempire una piastra a 96 pozzetti in meno di 15 min. Se, in un punto determinato momento, la piastra è accidentalmente scosso e sconvolto la materia fecale dal fondo dei pozzi prima della lettura, l'accumulo sembrano diminuire. Questo può essere evitato spostando le piastre con attenzione, senza agitazione. Nella nostra esperienza, movimento normale, compresa quella del cassetto motorizzato piastra spettrofotometro, non disturbare il dosaggio. Piastra di lettori dotati di un riscaldatore (cioè, la piastra non sono da restituire all'incubatore tra misurazioni) e si trova vicino il dosaggio banco di laboratorio potrebbe ottimizzare per minore probabilità di dispersione, ma questo non era necessario nella nostra esperienza.
I primi tentativi il metodo non hanno incluso alimentazione nei giorni che precedono il test. Senza quelle poppate 'pratica', i numeri più bassi delle larve consumato cibo sufficiente fluorescente durante il tempo consentito prima dell'applicazione del trattamento. In quei tentativi, variazione all'interno di gruppi di trattamento era maggiore, e più dati erano inutilizzabili a causa di accumulo di basso/no segnale nel tempo. Anche con la pratica di alimentazione, alcune larve non consumano una quantità sufficiente di cibo fluorescente, escludendo i dati da tali larve diminuisce variazione all'interno di gruppi e aumenta la capacità di identificare gli effetti del trattamento. A partire con dimensioni maggiori di gruppo (cioè, 24 contro 12) consente un numero sufficiente di larve contribuendo dati utili all'analisi.
La microscopia fluorescente rivela che transito di cibo era quasi completa di 24 h in larve atropina-trattati (non mostrato), tuttavia i dati di micropiastre dal punto finale tempo rifletteranno segnale finale inferiore nel gruppo atropina, rispetto al gruppo di veicolo. Al contrario, maggiore finale micropiastra fluorescenza è stato associato con trattamenti che ha accelerato i tempi di transito, anche se le larve di veicolo-trattati hanno apparentemente annullata loro tratto di GI prima del punto di tempo finale. Basato sull'assegnazione casuale al trattamento delle larve nutrite con cibi fluorescenti, assumiamo equivalente consumo dell'alimento fluorescente, in media, tra i gruppi di trattamento. Dato questo e sulla base degli schemi descritti sopra, fluorescenza da materia fecale diminuisce con il tempo trascorso nel tratto GI larvale o transito più veloce aggiunge fluorescenza per le feci, in qualche modo. La vera causa è sconosciuta e non è stata interrogata, tuttavia ancora il dosaggio è in grado di misurare e comparare il tempo di transito tra gruppi.
L'impiego di questo metodo nella rilevazione di effetti tossici di GI da composti di piccola molecola è una sola applicazione. Altre possibili applicazioni includono modellazione di malattia (ad es., sindrome dell'intestino irritabile) e scoperta nuova terapia per tali malattie, o di scoperta composti pro-cinetico. Inoltre, accoppiato con modelli transgenici, questo metodo potrebbe essere utilizzato per interrogare il ruolo dei geni nella normale transito GI, come pure disturbi del transito, compreso la carenza di neuroni enterici. La larva di pesce zebra offre una piattaforma di tutto l'organismo su una scala che si approssima a quella della coltura delle cellule, ma poiché ci sono più tipi di cella una miriade funzionamento insieme in zebrafish e tessuti, domande di biologia di sistemi possono essere chiesto e ha risposto utilizzando questo modello.
Con gli avanzamenti nella tecnologia e nuove applicazioni della stessa, l'efficienza nello svolgimento delle prove di tossicità di zebrafish continuerà a migliorare. Zebrafish larvale manipolazione metodi e saggi stanno continuando a migliorare in termini di maggiore velocità effettiva13,14. Il romanzo metodo presentato qui è un esempio di un miglioramento che può fare studi di zebrafish più incisivo.
Disclosures
Il design, i comportamenti di studio e sostegno finanziario per questa ricerca sono stati forniti da AbbVie. AbbVie ha partecipato nell'interpretazione dei dati, la revisione e l'approvazione del manoscritto. S. Cassar, X. Huang e T. Cole sono dipendenti di AbbVie e non hanno nessun ulteriori conflitti di interesse a divulgare.
Acknowledgments
Simon Cassar di carpetbones.com progettato e creato la figura animata utilizzata per illustrare la procedura di in-vita del dosaggio transito GI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wild type zebrafish breeding pair | Various sources - for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
| 1.7 L Breeding Tank - Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
| Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
| First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
| Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
| V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
| Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
| Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
| Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
| Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |
References
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