Summary
接線方向の移行の蛍光標識法について述べるエレクトロポレーション、および移行を視覚化するためにフラット マウント文化のラベルの付いたセルの動きのタイムラプス イメージング用セル セル開発ひよこ視蓋動作.
Abstract
タイムラプス イメージングは、移行細胞の挙動を分析する強力な方法です。蛍光細胞ラベリング後、ビデオ顕微鏡下文化の標識細胞の動きを記録できます。発展途上の脳細胞の移動を分析するためスライス培養、細胞遊走の放射状の細胞遊走などのスライス セクションに平行を観察する使用されます。しかし、限られた情報は、接線方向の細胞遊走などのスライス セクションに垂直セル移行を分析するスライス培養法から入手できます。ここでは、発展途上のひよこ視蓋接線細胞遊走を視覚化する時間経過イメージ投射のためのプロトコルを提案する.Ovo でエレクトロポレーションと細胞培養チップの後フラット マウント文化によって分類するセルの組み合わせにより、水平面内移行細胞運動の検出です。また、本手法は個々 のセルの動作と長期的に細胞のグループの集団行動の両方の検出を容易します。このメソッドは、蛍光マイクロ構造の非神経組織神経のティッシュか細胞の変位で軸索の伸長を含む連続した変化を検出する可能性があります適用ことができます。
Introduction
ライブ イメージングの進歩技術と細胞移動の研究が進み。蛍光細胞ラベリング後、ビデオ顕微鏡下で培養皿や生体内での標識細胞の時間的な動きを記録できます。神経系の発達の研究では、タイムラプス イメージングを用いた移行細胞または軸索伸長の形態学的変化を分析されてが。効果的なイメージング実験と解析の目的に基づく蛍光細胞ラベリングと組織の準備のための適切な方法を適用が欠かせません。発展途上の脳細胞の移動を分析するため細胞遊走細胞径移行1,2,3などのスライス セクションに平行を観察するスライス培養によく使用されています。スライス培養系も接線方向セル移行4,5の検出用、セルがスライス セクションに垂直を分散の場合指向性分析のため適していません。
視蓋は萌芽期の開発中に放射状および接した細胞移行によって形成された、多層構造で構成されます。蓋層形成心室の地帯から後の神経前駆細胞の放射状移動に主に左右心室ゾーン6生年と相関する層の彼らの最終目的地。接線方向の移動に関しては以前に発展途上のひよこ視蓋の真ん中と表面的な層の移行の 2 つのストリームを報告しました。E6 E8 の中に中間層で長い主要なプロセスと薄い後続プロセスと双極細胞は、7を実行する背腹側蓋の遠心性軸索軸索束に沿って背側または腹側を移行します。この axophilic 移行後、細胞は深い層にある多極神経細胞に分化します。E7 E14 中に表層で移行するセルは複数方向8分岐リード処理および散布を改質による水平方向に分散します。移行を分散後に、後者のセルは、最終的に様々 な形態の表面的なニューロンに分化します。両方のケースでは、フラット マウント文化は軟膜表面に平行細胞運動を観察するが効率的です。
ここでは、発展途上のひよここま7,8で接線方向細胞遊走を視覚化する時間経過イメージ投射のためのプロトコルを提案する.Ovoエレクトロポレーションと携帯文化にその後フラット マウント文化によって分類するセルの組み合わせにより、移行細胞の移動および移行の方向の検出です。このメソッドの目的は、長期と水平面内のセルのグループの集団行動の両方の個々 のセル動作の検出を容易にすることです。
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Protocol
1。Ovo でエレクトロポレーション
- 高濃度で蛍光ラベリングの発現プラスミド DNA を準備します。製造元のプロトコル (材料表) によると陰イオン交換カラムを用いたアルカリ溶解法による細菌培養の 200 mL から DNA を隔離します。PCAGGS EGFP と pCAGGS-mCherryNuc 4 μ g/μ l 各最終濃度で混ぜます。
注: プラスミド DNA 精製のエンドトキシンはエレクトロポレーションの最寄りにあります。 - 38 ° C 相対湿度 70% で水平方向に肥沃な鶏の卵を孵化させなさい。
- 2.5 日後 18 ゲージ針で 20 mL の注射器を使用して、卵の尖った側から卵白 (卵白) 5 mL を排除し、テープで針穴をシールします。
- 直径 2 cm の穴を開く (ハンバーガーとハミルトンの9のステージ 17) 実体顕微鏡下で胚の発育段階をチェックして曲線はさみで卵の殻の上部をカットします。もう一度テープで穴を塞ぐ。
注: この手順は、E2.5 E3.0 中にいつでも実行できます。1.3 と 1.4 の手順は、トップのシェルに成長する胎児の血管タイトな添付ファイルを避けるために卵の胚のレベルを下げます。 - E5.5 まで潜伏を続けてください。
- エレクトロポレーション、前に述べられたプラスミド DNA の色付きの高速グリーン (25 mg/mL)、0.5 μ 10 mL をオートクレーブ処理したリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (100 単位/ml) ペニシリンとストレプトマイシン (100 μ g/mL)、製マイクロ ピペットを含む 10 μ L を準備します。ガラス毛細管ピペット プロセッサを使用します。注射用 DNA の量によって孔の適切なサイズを作るにピペットの先端をカットします。
- 穴径 2.5 cm を再び開いて、安定したステレオの顕微鏡の下で卵を設定にハサミでシールのトップのシェルをカットします。卵に PBS を数滴を追加します。2 つの微細鉗子を用いた出血せず、胚を覆う尿膜をはがします。胚の頭から、羊膜を削除します。
- Microspatula で頭を回しながら注入 0.1-1 μ L マイクロ ピペットを使用して左の視蓋の心室に着色された DNA の吸引管に接続されています。
注: DNA の注入量は、実験の目的によって異なります。DNA 溶液をシンク、心室の壁に沿って取り付けます。 - 光 tectumis のターゲット領域 (図 1、ステップ 1) の間に配置されるように鉗子型電極 (7 mm と 3 mm 正方形電極) のペアを配置します。
注: DNA は陽極側に electroporated です。 - 30 V の前のパルス、1 ms の 5 ms 間隔と 6 V の 4 つ後のパルス、パルス発生器を使用する 10 ms 間隔で 5 ms を充電します。
注: 電子の状態は、電極の距離とサイズに依存します。効率的な遺伝子導入を達成するために十分に強いべきであることが、それは標的組織の正常な発達を保証するために十分な謙虚でなければなりません。 - 穴をテープでふさぐし、潜伏を続けます。プラスチックの皿に歯間ブラシで卵白を削除する PBS で電極を浸します。それぞれの卵に 1.7 1.11 を繰り返します。
2. フラット マウント文化セルの挿入
- フラット マウント文化前日準備被覆細胞文化挿入。10 cm の細胞培養皿で蒸留水をフロートいくつかの細胞培養は、オートクレーブに挿入します。8 μ G/ml ラミニンと 80 μ g/mL ポリ-L-リジン挿入をカバーし、37 ° C でセル文化 CO2インキュベーターで一晩フロート挿入のままのソリューションを読み込みます。
注: 次の日にコーティングされた挿入格納できる 4 ° C で - E7.0 で文化の日、挿入からラミニン ポリ-L-リジンのソリューションを削除し、1.1 ml 培養液 (60% 減少血清中、20 %10 10% 牛胎児血清、f12 キーのガラス底皿 (図 1の手順 2) に挿入を置きます50 単位/mL ペニシリン、50 μ g/mL ストレプトマイシン % ニワトリ血清)。37 ° C でセル文化 CO2インキュベーターで皿を保つ
注: 媒体を変更することがなく 3 日間の培養期間中使用できます。 - 文化のセットアップを準備します。40% O2と 5% CO2 (ガス コント ローラー) 38 ° C (温度コント ローラー) でのガス流れと倒立顕微鏡に湿気の多い室内ユニットを設定します。
- 胎児の頭をハサミでカットします。冷たいハンクス平衡塩類溶液 (HBSS) 6 cm 細胞培養皿の中に鉗子を頭をつまみます。
- 2 つの微細鉗子を用いた electroporated 視蓋を分離します。冷たい HBSS でいっぱい別皿にプラスチック スポイトを蓋を転送します。切断のための受け皿としてブラック シリコンによる凹面ガラスの皿を使用します。
- 蛍光実体顕微鏡下でラベルの位置を確認します。蓋組織の顕微鏡下のナイフでラベルの領域を周囲をカットします。組織の方向性の確認蓋 (前方-後方、背腹軸) します。
- ぴあ側が挿入に接続されるので挿入するプラスチック スポイトがラベルの付いたティッシュを転送します。目的の方向に蓋組織を置き、余分な HBSS (図 1、手順 2) を取り外します。
- 同じ他の組織を準備するために 2.4 2.7 挿入を繰り返します。倒立の共焦点顕微鏡 (図 1、手順 3) に prewarmed の商工会議所に料理を配置します。
3. タイムラプス イメージング
- 蛍光ラベルをチェックし、倒立顕微鏡でミクロな場に焦点を当てます。レーザー共焦点ユニットを起動し、フィールドに X および y 軸に沿って組織の位置や方向を調整する共焦点スキャンをサンプリングしようとします。10 X または浸漬油なし 20 × 対物レンズ使用します。
- スキャン サイズを選択 (例えば512 x 512 dpi)。間隔および z 軸に沿って共焦点スキャンの全範囲を決定します。100 μ m の範囲の 5 〜 10 μ m の間隔を取る。共焦点レーザー顕微鏡とイメージングの期間 (例えば、 10 分間隔 48 時間以上) 合計の時間間隔を決定します。
注: レーザー光毒性を避けるためには、高スキャン サイズ長い z 範囲の z - 間隔が短いまたは長いイメージング期間中に短い時間間隔でのスキャンを禁止します。たとえば、高スキャン サイズ (1024 x 1024 dpiなど) を適用すると、z 軸に沿ってスキャンの数を減らします。 - セット共焦点実行中のパラメーターは、プログラムに記載されている 3.2 とイメージングを開始します。
- イメージング後、すべての時点で焦点微調整で z のイメージを提供する別の z 軸の共焦点画像を組み合わせます。
- 異なる時点で z の画像を追加し、AVI 形式でコマ撮りムービーを作成します。
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Representative Results
図 2は、記録の発症後経過時間 (0、9、18、27 h) でフラット マウント文化で可視化された表面的な接線方向の移動を示します。映画1は 28 時間 50 分の間 10 分間隔のインターバル撮影ムービーです。フレームは、フレームのラベル左下隅からラベルのない領域 (図 3 a) 移行の細胞に焦点を当てに対して選択されます。移行細胞 (GFP; 上部左側のパネル、映画 1) の質量の運動 (mCherry Nuc; 右上のパネル)、原子核を結合されたムービー (下のパネル、映画 1) で観察できるし、。細胞移動の方向性は、ラベル センターからすべての方向 (映画 2図 3 b) 分散の細胞に焦点を当てて調べることができます。
核の運動 (ムービー 2; mCherry-Nuc、右側のパネル) のクリア画像粒子追跡プラグイン10フィジー画像処理 ImageJ11 のアプリケーションを使用して自動追跡による細胞核移行をトレースすることができます。(映画 3図 3 b)。接線方向の移動の軌道の変化は、オムニ方向分散移行を証明するために視覚化できます。
主要なプロセス、末尾のプロセスおよび核の逐次形態変化を個々 のセル動作 5 分間隔 (映画 4図 3) の高倍率画像で明らかにすることができます。
別の種類の中間層7の接線方向の移動は、同様のプロトコル (映画 5図 3 D) を使用して視覚化できます。背腹側 (上から下へ) 実行して軸索束に沿って双方向線形移行は明らかに7です。
図 1。プロトコルのフロー チャート。ステップ 1: ovo でエレクトロポレーション。ステップ 2: は、ぴあ側は挿入に取り付けられている蓋組織を敷設します。ステップ 3: 倒立蛍光顕微鏡レーザー共焦点ユニット。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。フラット マウント文化の表面的な接線方向の移動の可視化0、9、18、27 h E7.0 から文化の発症後に接線方向に移行する細胞 (GFP; 上部パネル) や視蓋の浅層における核 (mCherry Nuc; 下のパネル) が表示されます。フレームの左下隅にあるセルは 0 h ( 3 a の図を参照) で表示されます。スケール バー: 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。タイムラプス イメージング用マウント条件を示す模式図。(緑)、細胞遊走 (マゼンタ)、およびビデオ フレーム (黒い正方形) の最初の方向は、エレクトロポレーション (EP の日、上の欄に対物レンズ (obj) とデジタル ズーム (ズーム) の倍率が説明された蛍光標識の形状) と下側のフィールドで文化 (文化) の発症。()映画 1, (B)ムービー 2 と 3、(C)ムービー 4、(D)映画 5。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ムービー 1。フラット マウント文化の表面的な接線方向の移動の可視化します。E7.0 から文化の発症後視蓋の表層での核 (mCherry Nuc; 右上のパネル) と接線方向に移行する細胞 (GFP; 上部左側のパネル) の動き。差し込み画像は、下部のパネルに表示されます。0 h にラベルの付いたフレームの左下隅にあるセル (参照図 3 a)、以上 28 時間と 50 分スケール バーを捕獲され、コマ撮り画像: 100 μ mしてくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。右クリックしてダウンロードします。
ムービー 2。48 h 以上のとおり両方のパネルの中心から接線方向に移行するセル (GFP; 左側のパネル) と (mCherry Nuc; 右側のパネル)、原子核の運動を分散(図 3B参照)。スケール バー: 100 μ mしてくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。右クリックしてダウンロードします。
ムービー 3。接線方向の移動の軌跡。細胞核 (ムービー 2の右側のパネル) の変位は、接線方向の移動の軌跡を視覚化する追跡されました。スケール バー;100 μ mしてくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。右クリックしてダウンロードします。
ムービー 4。高倍率で個々 のセル動作します。高倍率 (図 3参照) h 24 以上 (GFP; 左のパネル)、個々 の細胞とその核 (mCherry Nuc; 右側のパネル) の動きが表示されます。主要なプロセスの分岐過程を認識できます。スケール バー: 100 μ mしてくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。右クリックしてダウンロードします。
ムービー 5。中間層の移行。接線方向に移行するセル (GFP; 左側のパネル) と蓋の中間層で彼らの核 (mCherry Nuc; 右側のパネル) の動きは E6.0 から文化の発症後 24 時間以上を示しています (図 3D参照)。背腹軸 (上から下へ) に沿った線形移行は顕著です。スケール バー: 100 μ mしてくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。右クリックしてダウンロードします。
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Discussion
上記で説明したプロトコルは、浅層6,8で細胞の移動を検出に最適です。エレクトロポレーション (E4.5、E5.5) のタイミングと文化の始まりをシフト イメージング (E6.0 に E7.0) だけで中間層の移行ストリーム (映画 5)6、7を検出が可能です。
提示された手順ovo でエレクトロポレーション、フラット マウント文化とタイムラプス顕微鏡を用いたイメージング (図 1) によって分類するセルで構成されます。まず第一に、健康と通常として生体内で成長して、組織を維持する培養条件を最適化するべきであることの前提条件です。また、ティッシュの向きは細胞遊走の検出に適していることを確認することが重要です。そのような目的のため我々 は水平細胞分散の観察を容易にし、高い酸素の豊富な媒体を供給するセル挿入にフラット マウント文化を適用します。培養条件と方向を確認した後、それは少なくとも電子の良い蛍光ラベルの競合する条件を調整し、写真に可視化のために重要な損害。良いラベリング効率的なプロモーターの発現ベクターを選択でき、DNA が electroporate に集中しています。少なくともダメージを達成するため、中程度のエレクトロポレーションの電気的条件、DNA 濃度を下げ、レーザー照射の合計時間を最小限に抑えることが重要です。
セルの挿入時にフラット マウント文化を使用してこのプロトコルの利点は、我々 が長期的に接した細胞移動を観察することです。一般的に、どのくらい文化の組織維持、 ovo に比較して生理的条件を決定することは困難です。非常には、少なくとも、表面的な接線方向の移動は E7.0 表わす正常細胞分散がovo で8のように文化の発症後 72 h 以上続けて。さらに、新鮮な組織は、後の段階で移行を観察する文化とイメージングの開始時に用意しています。また、有利なセルのまま対物レンズの近くにある蓋の表面的なフラット シートで水平方向に移動するためにセル変位を長い期間にわたって続くことができることです。共焦点システムを使用して追跡を容易にもセルの z 軸に沿って移動します。その一方で、この方法の欠点は、フラット マウント文化ない常にこと他のタイプの放射状の移行などの移行を要約に関連します。挿入時に蓋のスライスの放射状移動を観察する方法を適用すると、蓋組織の厚さは、 ovo でとして急速に、増加しません。コラーゲン ・ ゲルのスライス培養法は、このような層の開発を要約するほうがよい。
本手法が水平運動文化挿入に平行を見極め、それ可能性があります適用すること蛍光マイクロ構造、神経組織の軸索の伸長を含む逐次変更を検出するためまたは非神経組織の細胞移動距離。たとえば、屋根板を切開開く本の文化で、電気穿孔法による成長の神経管の交連神経軸索をラベル付け後、床面上の前と後交差軸索の動きを視覚化できます。セルの挿入時に適切な培養条件が生体内での条件を再現可能である私たちのメソッドは、さまざまなセルタイプおよび構造の水平方向の動きを可視化する効果的な手法を提供します。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、日本学術振興会科研費助成数によって支えられた Y.W. に 15 K 06740
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
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