Summary
Vi beskriver metodene for fluorescerende merking tangentially overføre celler av electroporation og for tidsinnstilt bildebehandling merket celle bevegelsen i en flat-mount kultur for å visualisere migrere celle atferd i den utvikle chick fiberoptisk tectum .
Abstract
Tidsinnstilt bildebehandling er en kraftig metode for å analysere migrere celle atferden. Etter fluorescerende celle merking, kan bevegelsen av merket cellene i kultur registreres under video mikroskopi. For å analysere celle migrasjon i utvikle hjernen, er stykket kultur vanlig å observere celle migrasjon parallelt delen skive som radial celle migrasjon. Imidlertid kan begrenset informasjon fås fra skive kultur metoden å analysere celle migrasjon vinkelrett delen skive som tangentiell celle migrasjon. Her presenterer vi protokollene for time-lapse tenkelig å visualisere tangentiell celle migrasjon i utviklingsland chick fiberoptisk tectum. En kombinasjon av cellen merking av electroporation i ovo og en påfølgende flat-mount kultur på celle kultur innsatsen kan oppdagelsen av migreringen celle bevegelse vannrett. Dessuten Letter vår metode oppdagelsen av både enkeltcelle atferd og kollektiv handling av en cellegruppe på lang sikt. Denne metoden kan potensielt brukes for å følge endringen av fluorescerende-merket mikro-strukturen, inkludert axonal forlengelse i nevrale vev eller celle forskyvning i ikke-nevrale vev.
Introduction
Studiet av celle migrasjon har gått etter med fremmarsj teknikk for live bildebehandling. Etter fluorescerende celle merking, kan timelige bevegelsen av merkede celler i en kultur parabol eller i vivo registreres under video mikroskopi. I studiet av neural utvikling, er morfologiske endringene av migrering celler eller elongating axons analysert ved hjelp av tidsinnstilt bildebehandling. For effektiv bildebehandling er det viktig å bruke en egnet metode for fluorescerende celle merking og vev forberedelse, basert på eksperimentet og analyse. For å analysere celle migrasjon i utvikle hjernen, er slice kultur vanligvis brukt til å observere celle migrasjon parallelt delen skive som radial celle migrasjon1,2,3. Skive kultur-systemet brukes også for å oppdage tangentiell celle migrasjon4,5, men det er ikke egnet for retningsbestemt analyse i tilfeller der cellene spre vinkelrett til delen skive.
Fiberoptisk tectum består av en flerlags struktur, dannet av radial og tangentiell celle migrasjon under embryonale utviklingen. Tectal lag formasjonen avhenger hovedsakelig radial migrering av postmitotic neuronal forløper celler fra sonen ventrikkel og deres endelig destinasjon i lagene korrelerer med sine fødselsdato i ventrikkel sonen6. Som for tangentiell migrasjon rapportert vi tidligere to strømmer av overføringer i midten og overfladiske lagene i en utvikling chick fiberoptisk tectum. I de midterste lag under E6-E8 overføre bipolar cellene med en lang ledende prosess og en tynn etterfølgende prosessen på ryggen eller ventrally langs axon fasciculus av tectal efferent axons som kjører dorso-ventrally7. Etter denne axophilic overføring skille cellene i multipolar nevroner i de dype lag. I overfladisk lagene under E7-E14 spre overfører cellene vannrett ved å reformere en forgrenet ledende prosessen og scatter i flere retninger8. Etter spre migrasjon, skille sistnevnte cellene til slutt ut overfladisk nevroner i ulike morphologies. I begge tilfeller er en flat-mount kultur effektivt å observere celle bevegelse parallelt pial overflaten.
Her presenterer vi en protokoll for time-lapse tenkelig å visualisere tangentiell celle migrasjon i utviklingsland chick fiberoptisk tectum7,8. Kombinasjonen av cellen merking på electroporation i ovo, og en påfølgende flat-mount kultur på celle kultur innsatsen kan påvisning av overfører celle bevegelse og migrasjon retning. Målet med denne metoden er å lette oppdagelsen av både enkeltcelle atferd i langsiktig og kollektiv handling av en gruppe celler vannrett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Electroporation i Ovo
- Forberede uttrykk plasmider DNA fluorescerende merking i høy konsentrasjon. Isolere DNA fra 200 mL bakteriell kultur av alkaliske lysis metoden bruker anion exchange kolonner i henhold til produsentens protokollen (Tabell for materiale). Bland pCAGGS-EGFP og pCAGGS-mCherryNuc i en endelig konsentrasjon av 4 µg/µL hver.
Merk: Endotoxin-gratis plasmider DNA rensing kan være foretrukket for electroporation. - Inkuber fertile chicken egg vannrett på 38 ° C i 70% relativ fuktighet.
- Etter 2,5 dager, eliminere 5 mL albumen (egg hvit) fra spiss siden av egg bruke 20 mL sprøyte med en 18 gauge nål og forsegle nål hullet med tape.
- Skjær toppen av egg shell med buet saks til å åpne et hull 2 cm i diameter og sjekk det utviklingen scenen av embryoet under stereomicroscope (scenen 17 Hamburger og Hamilton9). Tette hullet igjen med tape.
Merk: Dette trinnet kan utføres når som helst under E2.5-E3.0. Trinn 1.3 og 1.4 lavere nivå av embryoet i egget til å unngå en stram vedlegg av voksende fosteret og blodårene til toppen skallet. - Fortsette inkubasjon til E5.5.
- Før electroporation, forberede 10 µL av nevnte plasmider DNA farget med 0,5 µL av Fast grønt (25 mg/mL), 10 mL autoklaveres fosfat bufret saltvann (PBS) med penicillin (100 enheter/mL) og streptomycin (100 μg/mL) og Mikropipetter laget av glass kapillær rør med en brønnene prosessor. Klipp den distale tuppen på brønnene å gjøre en passende størrelse av pore avhengig av DNA for injeksjon.
- Klippe den forseglede overdelen med saks å åpne et hull 2,5 cm i diameter og angi egg stabilt under stereo mikroskop. Legg noen dråper PBS i egget. Løsner allantoic membranen dekker embryoet uten blødning ved hjelp av to fine pinsett. Fjerne amnion fra leder av fosteret.
- Mens du slår hodet med en microspatula, injisere 0.1-1 μL farget DNA inn i ventrikkel hulrommet i den venstre fiberoptisk tectum ved hjelp av brønnene koblet til en luftpumpe.
Merk: Mengden av DNA injisert, avhenger av formålet med eksperimentet. Konsentrert DNA løsning skal synke og fest langs ventrikkel veggen. - Plass et par tang-type elektroder (3 mm firkantet elektroder med 7 mm avstand) slik at målområdet for fiberoptisk tectumis plassert mellom (figur 1trinn 1).
Merk: DNA er electroporated til anode side. - Belaste en pre puls 30 V, 1 ms med et 5 ms intervall og fire påfølgende pulser av 6 V, 5 ms med en 10 ms intervall bruke puls generator.
Merk: Elektronisk tilstanden avhenger av størrelsen og avstand på elektrodene. Det bør være sterk nok til å oppnå effektiv hva, men det må være beskjedne nok å sikre normal utvikling av vevet. - Tette hullet med tape og fortsette inkubasjon. Suge elektrodene i PBS fjerne albumen med en interdental pensel i plast parabol. Gjenta 1.7-1.11 for hvert egg.
2. flat-Mount kultur på Sett inn celle
- En dag før flat-mount kultur, forberede belagt celle kultur innsatsen. Flyt noen celle kultur setter på autoklaveres destillert vann i 10 cm celle kultur parabol. Last 8 µg/mL laminin og 80 µg/mL poly-L-lysine å dekke skivene og la fløt skivene i celle kultur CO2 inkubator på 37 ° C over natten.
Merk: På dagen-belagt skivene, kan lagres på 4 ° C. - På dagen for kultur på E7.0, fjerner laminin-poly-L-lysine løsningen på Sett inn og plasser innsatsen i et glass bunn rett (figur 1trinn 2) fylt med 1,1 mL kultur medium (60% redusert serum medium, 20% F12, 10% fosterets bovin serum, 10 % chick serum, 50 enheter/mL penicillin, 50 μg/mL streptomycin). Holde parabolen i celle kultur CO2 inkubator på 37 ° C.
Merk: Medium kan brukes i hele kultur perioden i tre dager uten endring. - Forberede kultur oppsettet. Angi en fuktig kammer-enhet på en invertert AC confocal mikroskop med en gass-flyt av 40% O2 og 5% CO2 (gass kontroller) på 38 ° C (temperatur kontroller).
- Kutte hodet av embryoet med saks. Knip hodet ut med tang i det iskalde Hanks' balansert Salt løsning (HBSS) i 6 cm celle kultur parabol.
- Isolere electroporated fiberoptisk tectum med to fine tang. Overfør tectum med en plast dropper til en annen tallerken fylt med iskald HBSS. Bruk hul glass retten basert med svart silikon som en skål for skjæring.
- Kontroller posisjonen til merking under fluorescens stereoskopisk mikroskop. Kuttet ut tectal vevet rundt merking området med Mikrokirurgiske kniv. Kontroller at retning av vevet i tectum (anterior-posterior, rygg-ventrale).
- Overføre merket vevet med en plast dropper til sette inn slik at siden pia er knyttet til innsatsen. Lå tectal vevet i ønsket retning og fjerne overflødig HBSS (figur 1trinn 2).
- Gjenta 2.4-2.7 for å forberede andre vev på samme sett. Plass rett i prewarmed kammer i invertert AC confocal mikroskopet (figur 1trinn 3).
3. tidsinnstilt bildebehandling
- Kontroller fluorescerende merkingen og fokusere mikroskopiske feltet i det inverterte AC confocal mikroskopet. Start laser AC confocal enhetene og prøv prøvetaking AC confocal skanningen for å justere retningen og posisjonen til vevet langs X- og y-aksen i-feltet. Bruke 10 X eller 20 X linsen uten neddyppingsolje.
- Velg skanning størrelsen (f.eks 512 x 512 PPT). Bestemme intervall og total rekkevidde på AC confocal skanningen langs z-aksen. Ta en 5 eller 10 µm intervall for 100 µm området. Bestemme tidsintervallet AC confocal imaging og totalt imaging varighet (f.eks 10 min intervaller over 48 timer).
Merk: For å unngå laser Phototoksisitet, begrense skanning i høy skanning størrelse kort z-intervaller for lang z-området eller korte tidsintervaller i løpet av lang tenkelig varigheten. For eksempel når du bruker en høy skanning størrelse (f.eks 1024 x 1024 PPT), redusere antall skanninger langs z-aksen. - Angi parametrene av AC confocal programmet beskrevet i 3.2 og starte imaging.
- Etter avbildning, kan du kombinere AC confocal bilder på forskjellige z å gi z-stakk bilder fokal finjustering på hvert tidspunkt.
- Tilføyer z-stakk bilder på forskjellige tidspunkt og konstruere en time-lapse film i AVI-format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser visualisert overfladisk tangentiell overføringen i en flat-mount kultur i en tidsperiode (0, 9, 18, 27 h) etter utbruddet av innspillingen. Film 1 er en time-lapse film av 10 min intervaller over en periode på 28 h og 50 minutter. Rammen er valgt for å fokusere på overfører cellene fra merket nederst i venstre hjørne av rammen til umerkede plass (figur 3A). Nasjonalsosialistenes bevegelse migrere cellene (GFP, øvre venstre panel, film 1) og deres kjerner (mCherry-Nuc, øvre høyre panel) kan observeres med flettede filmen (nedre panel, film 1). Retningen av celle migrasjon kan undersøkes ved å fokusere på de dispersing cellene fra merket center til alle retninger (Movie 2 figur 3B).
De klare bildene av kjernefysiske bevegelsen (Movie 2, mCherry-Nuc, høyre panel) tillater oss å spore celle kjernefysiske overføringen av automatisk sporing ved hjelp av en partikkel Tracker plugin10 av en Fiji bildebehandling anvendelse av ImageJ11 (Filmen 3 figur 3B). Temporal endringer i baner av tangentiell overføringen kan visualiseres for å bevise dispersing overføringen i omni-retninger.
Enkeltcelle opptreden med sekvensiell morfologiske endring av ledende prosessen, etterfølgende prosessen og kjerner kan være manifestert med høyere forstørrelse bilder av 5 min-intervaller (Movie 4, Figur 3 c).
En annen type tangentiell migrasjon i midten lag7 kan visualiseres ved hjelp av en lignende protokoll (film 5, figur 3D). Toveis lineær migrasjon langs axon fasciculus kjører dorsal ventrale (topp ned) er tydelig7.
Figur 1. Protokollen flytskjema. Trinn 1: Electroporation i ovo. Trinn 2: Legge tectal vev slik at siden pia er knyttet til innsatsen. Trinn 3: Invertert mikroskop fluorescerende med laser AC confocal enhet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Visualisering av overfladiske tangentiell migrasjon i flatskjerm-mount kultur. Tangentially migrere cellene (GFP, øvre panel) og kjernen (mCherry-Nuc, nedre panel) i overfladisk lagene på fiberoptisk tectum vises på 0, 9, 18, 27 h etter utbruddet av kulturen fra E7.0. Cellene i nedre venstre hjørne av rammen er merket på 0 h (se figur 3A). Skala bar: 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Skjematisk figur illustrerer mount betingelsene for tidsinnstilt bildebehandling. Formen på fluorescerende merkingen (grønn), første retning av celle migrasjon (rosa) og videorammen (svarte firkanten) ble illustrert med forstørrelse av linsen (obj) og digital zoom (zoom) i feltet øvre med dagen i electroporation (EP ) og utbruddet av kultur (kultur) i feltet nederst. (A) film 1, (B) film 2 og 3, (C) Movie 4, (D) film 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1. Visualisering av overfladiske tangentiell overføringen i en flat-mount kultur. Bevegelse av tangentially migrere cellene (GFP, øvre venstre panel) og deres kjerner (mCherry-Nuc, øvre høyre panel) i overfladisk lagene på fiberoptisk tectum etter utbruddet av kulturen fra E7.0. Det sammenslåtte bildet vises i nedre panel. Cellene i nedre venstre hjørne av rammen er merket på 0 h (se figur 3A), og time-lapse bildene ble tatt over 28 h og 50 min. skala bar: 100 µm. Klikk her for å vise denne videoen. Høyreklikk for å laste ned.
Film 2. Spre bevegelse av tangentially migrere cellene (GFP, venstre panel) og deres kjerner (mCherry-Nuc, høyre panel) fra sentrum av både panelene vises over 48 timer (se figur 3B). Skala bar: 100 µm. Klikk her for å vise denne videoen. Høyreklikk for å laste ned.
Filmen 3. Baner av tangentiell migrasjon. Forskyvning av cellekjernen (det høyre panelet på Movie 2) ble sporet for å visualisere baner av tangentiell overføringen. Skala tittellinjen. 100 µm. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. Høyreklikk for å laste ned.
Film 4. Enkeltcelle atferd i høyere forstørrelse. Bevegelse av de enkelte cellene (GFP, venstre panel) og deres kjerner (mCherry-Nuc, høyre panel) vises i høyere forstørrelse over 24 timer (se Figur 3 c). Forgrening prosessen med ledende prosessen kan gjenkjennes. Skala bar: 100 µm. Klikk her for å vise denne videoen. Høyreklikk for å laste ned.
Film 5. Midterste laget migrasjon. Bevegelse av tangentially migrere cellene (GFP, venstre panel) og deres kjernen (mCherry-Nuc, høyre panel) i tectal midten lagene vises over 24 timer etter utbruddet av kulturen fra E6.0 (se figur 3D). Lineær migrasjon langs dorso-ventrale aksen (topp ned) er bemerkelsesverdig. Skala bar: 100 µm. Klikk her for å vise denne videoen. Høyreklikk for å laste ned.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet ovenfor er optimalisert for å oppdage celle migrasjon i overfladisk lag6,8. Det gjelder for å oppdage midterste laget migrasjon bekker (film 5)6,7, bare ved å flytte tidspunktet for electroporation (E5.5 til E4.5) og utbruddet av kultur og imaging (E7.0 til E6.0).
Presentert prosedyren består av celle merking av electroporation i ovo, flat-mount kultur og tidsinnstilt AC confocal bildebehandling (figur 1). Først av alt, er det en forutsetning at kultur betingelsene skal være optimalisert for å holde vevet sunn og voksende normalt som in vivo. Det er også avgjørende for å sikre at retningen av vev er egnet for å oppdage celle migrasjon. For slike formål bruker vi en flat-mount kultur på cellen setter inn, som forenkler observasjon av horisontale celle spredning og leverer rik medium med høy oksygen. Etter å sikre kultur tilstand og retning, er det avgjørende for visualisering å justere motstridende betingelsene for bedre fluorescerende merking med den minste elektronisk og foto skader. For bedre merking, vi kan velge en uttrykk vektor med en effektiv arrangøren og electroporate konsentrert DNA. For å oppnå minst skade, er det viktig å moderat elektrisk tilstanden til electroporation lavere DNA konsentrasjonen og minimere den totale tiden for laser irradiation.
En fordel med denne protokollen bruker flat-mount kulturen på cellen innsatsen er at vi kan observere tangentiell celle migrasjon på lang sikt. Vanligvis er det vanskelig å fastslå hvor lenge vevet i kultur opprettholder de fysiologiske forholdene i forhold til at i ovo. I det minste overfladisk tangentiell migrasjon fortsetter over 72 h etter utbruddet av kultur på E7.0, som viser vanlige mobilnettet spredning ligner på at i ovo-8. I tillegg er ferskt vev utarbeidet i starten av kultur og tenkelig å observere migrasjon ved senere stadier. Det er også en fordel at cellen forskyvning kan følges over lang fordi cellene forblir beveger seg horisontalt i overfladisk flat ark med tectum, som ligger i nærheten av linsen. Bruke AC confocal systemet også muliggjør sporing celle bevegelse langs z-aksen. På den annen side, er en ulempe med denne metoden at flat-mount kulturen kanskje ikke gjelder recapitulate andre typer overføring slik som radial migrasjon. Når metoden brukes for å observere radial migrasjon i tectal sektoren på innsatsen, øker tykkelsen på tectal vevet ikke så raskt som det i ovo. Metoden skive kultur i kollagen gel kan være bedre å recapitulate slik lag utvikling.
Siden våre metoden gjør det mulig for observasjon av horisontal bevegelse parallelt kultur innsatsen, det kan potensielt brukes for å oppdage sekvensiell endring av fluorescerende-merket mikro-strukturen, inkludert axonal forlengelse i nevrale vev eller cellen forskyvning i ikke-nevrale vev. For eksempel etter merking commissural axons i den utvikle medfødte av electroporation, kan bevegelser av pre- og post krysset axons over gulvplaten visualiseres i åpen bok kultur incising taket plate. Forutsatt at riktig kultur tilstanden på cellen innsatsen er tilgjengelig for avspilling i vivo forhold, gir våre metoden en effektiv teknikk for å visualisere vannrett bevegelser av ulike celletyper og strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI bevilgning nummer 15K 06740 til Y.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
