Summary
Describimos los métodos de etiquetado fluorescente tangencial migrar las células por electroporación y para Time-lapse de imágenes del movimiento celular marcada en una cultura de plano-montaje para visualizar migración celular comportamiento en El tectum óptico de chick en desarrollo .
Abstract
Proyección de imagen de Time-lapse es un método poderoso para analizar el comportamiento de células migratorias. Después de etiquetado fluorescente de la célula, el movimiento de las células marcadas en la cultura puede grabarse bajo microscopia video. Para el análisis de migración de la célula en el cerebro en desarrollo, sector cultura se utiliza comúnmente para observar la migración de la célula paralela a la sección de corte, como la migración de la célula radial. Sin embargo, la información limitada puede obtenerse desde el método de cultura rebanada para analizar la migración de la célula perpendicular a la sección de corte, como migración tangencial. Aquí, presentamos los protocolos para Time-lapse de imágenes para visualizar la migración de la célula tangencial en El tectum óptico de chick en vías de desarrollo. Una combinación de etiquetado celular por electroporación de ovo y una cultura de plano-montaje posterior en la inserción de la cultura de célula permite la detección de movimiento de migración celular en el plano horizontal. Además, nuestro método facilita la detección de comportamiento de células individuales y la acción colectiva de un grupo de células a largo plazo. Potencialmente, este método puede aplicarse para detectar el cambio secuencial de la etiqueta fluorescente micro-estructura, incluyendo la elongación axonal en el desplazamiento de tejido o células neuronal en el tejido no neural.
Introduction
El estudio de la migración de la célula ha sido avanzando con la técnica de avance de la proyección de imagen vivo. Después de etiquetado fluorescente de la célula, el movimiento temporal de células marcadas en una placa de cultivo o en vivo puede grabarse bajo microscopia video. En el estudio del desarrollo neuronal, se han analizado los cambios morfológicos de migración de las células o alarga axones usando proyección de imagen de Time-lapse. Para la proyección de imagen efectiva, es esencial aplicar un método adecuado para la preparación de tejido y etiquetado fluorescente de la célula, basado en el propósito del experimento y el análisis. Para el análisis de migración de la célula en el cerebro en desarrollo, sector cultura se ha utilizado comúnmente para observar la migración de la célula paralela a la sección de corte, como célula radial migración1,2,3. El sistema de cultivo del sector también se utiliza para detectar células tangenciales migración4,5, pero no es adecuado para análisis direccional en casos donde las células dispersan perpendicular a la sección de corte.
El tectum óptico se compone de una estructura multicapa, formada por la migración radial y tangencial de la célula durante el desarrollo embrionario. Formación de la capa tectal depende principalmente de la migración radial de las células precursoras neuronales postmitotic desde la zona ventricular y su destino final en las capas se correlaciona con su fecha de nacimiento en la zona ventricular6. En cuanto a la migración tangencial, habían divulgado previamente dos flujos de migraciones en las capas intermedias y superficiales en un tectum óptico de chick en vías de desarrollo. En las capas medias en E6-E8, las células bipolares con un líder largo proceso y un proceso final fino migran dorsal o ventralmente a lo largo de la Unión de axon de tectal axones eferentes que dorso-ventralmente7. Después de esta migración de axophilic, las células se diferencian en neuronas multipolares situadas en las capas profundas. En las capas superficiales durante E7-E14, migración de las células dispersa horizontalmente por reformar un proceso principal ramificado y dispersión en múltiples direcciones8. Después de la dispersión de la migración, las últimas células eventualmente se diferencian en neuronas superficiales de diferentes morfologías. En ambos casos, una cultura de plano-montaje es eficaz para observar movimiento celular paralela a la superficie pial.
Aquí, presentamos un protocolo para Time-lapse de imágenes para visualizar la migración de la célula tangencial en El tectum óptico polluelo en desarrollo7,8. Combinación de etiquetado celular por electroporación de ovoy una cultura de plano-montaje posterior en la inserción de la cultura de célula permite la detección de migración dirección de movimiento y migración de célula. El objetivo de este método es facilitar la detección de ambos comportamiento de células individuales en el largo plazo y la acción colectiva de un grupo de células en el plano horizontal.
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Protocol
1. Electroporación de Ovo
- Preparar el ADN del plásmido de expresión etiquetado fluorescente en alta concentración. Aislar ADN de 200 mL de cultivo bacteriano por el método de lisis alcalina mediante columnas de intercambio según protocolo del fabricante (Tabla de materiales). Mezcla pCAGGS-EGFP y pCAGGS-mCherryNuc a una concentración final de 4 μg/μl cada una.
Nota: Purificación de DNA de plásmido libre de endotoxina puede ser preferido para la electroporación. - Incubar huevos de gallina fértiles horizontalmente en 38 ° C en 70% de humedad relativa.
- Después de 2,5 días, eliminar 5 mL de albúmina (clara de huevo) desde el lado puntiagudo del huevo utilizando jeringa de 20 mL con una aguja de 18 calibre y sellar el agujero con cinta.
- Cortar la parte superior de la cáscara de huevo con una tijera curva para abrir un orificio de 2 cm de diámetro y para comprobar la etapa de desarrollo del embrión bajo el estereomicroscopio (fase 17 de Hamburger y Hamilton9). Selle el orificio nuevamente con cinta.
Nota: Este paso puede realizarse en cualquier momento durante E2.5-E3.0. Los pasos 1.3 y 1.4 bajan el nivel del embrión en el huevo para evitar que un accesorio apretado del embrión creciente y los vasos sanguíneos a la carcasa superior. - Continuar la incubación hasta E5.5.
- Antes de la electroporación, prepare 10 μl del plásmido mencionado ADN de color con 0,5 μl de verde Fast Green (25 mg/mL), 10 mL de tampón fosfato autoclave salino (PBS) que contenga penicilina (100 unidades/mL) y estreptomicina (100 μg/mL) y Micropipetas de tubos capilares de vidrio usando un procesador de la micropipeta. Cortar el extremo distal de la micropipeta para hacer una tamaño adecuado del poro dependiendo de la cantidad de ADN para la inyección.
- Cortar la cáscara superior sellada con unas tijeras para abrir un agujero de 2,5 cm de diámetro y el huevo estable bajo el microscopio estéreo. Añadir unas gotas de PBS en el huevo. Pele apagado la membrana alantoidea que cubre el embrión sin hemorragia usando dos pinzas finas. Quitar el amnion de la cabeza del embrión.
- Mientras gira la cabeza con un microspatula, inyectar 0.1-1 μL de ADN coloreado en la cavidad ventricular de la izquierda tectum óptico utilizando una micropipeta conectada a un tubo de succión.
Nota: La cantidad de ADN inyectado depende del propósito del experimento. Solución concentrada de la DNA debe hundirse y coloque a lo largo de la pared ventricular. - Coloque un par de electrodos tipo pinza (electrodos cuadrados de 3 mm con distancia de 7 mm) para que el área de la blanco de la tectumis óptica colocada entre (figura 1paso 1).
Nota: El ADN es electroporated hacia el ánodo. - Cargar un pulso previo de 30 V, 1 ms con un intervalo de 5 ms y cuatro pulsos posteriores de 6 V, 5 ms, con un intervalo de 10 ms con el generador de impulsos.
Nota: La condición electrónica depende del tamaño y distancia de los electrodos. Debe ser lo suficientemente fuerte como para lograr la transfección eficiente, pero debe ser suficientemente modesta para asegurar el desarrollo normal de los tejidos de destino. - Selle el orificio con cinta y continuar la incubación. Sumerja los electrodos en PBS para eliminar la albúmina con un cepillo interdental en un plato plástico. Repita 1.7-1.11 para cada huevo.
2. cultura de planos de montaje de la cubierta celular
- Un día antes de la cultura de Monte plano, preparar la cubierta de la célula cultura insertar. Flotan algunos insertos de cultura de célula en el agua destilada esterilizado en una placa de cultivo celular de 10 cm. Cargar una solución de 8 μg/mL laminina y 80 μg/mL poly-L-lisina para cubrir los insertos y dejan los insertos flotados en la incubadora de CO2 la cultura de célula a 37 ° C durante la noche.
Nota: Al día siguiente, los insertos recubiertos pueden almacenarse a 4 ° C. - En el día de la cultura en E7.0, retirar la solución de laminina-poli-L-lisina de la estufa y colocar el relleno en un plato de fondo de vidrio (figura 1paso 2) con 1,1 mL de medio de cultivo (medio reducido suero 60%, 20% F12, suero bovino fetal 10%, 10 % de suero de pollo, 50 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 50 de μg/mL). Mantener el plato en la incubadora de la célula cultura CO2 a 37 ° C.
Nota: El medio puede utilizarse durante todo el período de cultura durante tres días sin cambio. - Preparar la configuración de la cultura. Establecer una unidad de cámara húmeda en un microscopio confocal invertido con un flujo de gas de 40% O2 y 5% CO2 (regulador de gas) a 38 ° C (regulador de temperatura).
- Cortar la cabeza del embrión con tijeras. El sujetador de la cabeza con el fórceps en solución de sal equilibrada de la helada Hanks (HBSS) en una placa de cultivo celular de 6 cm.
- Aislar El tectum óptico del electroporated usando dos pinzas finas. Transferir El tectum con un gotero de plástico en otro plato llenado con HBSS helada. Utilizar el plato de vidrio cóncava con silicio negro como un platillo para el corte.
- Comprobar la posición de la etiqueta bajo el microscopio estereoscópico de fluorescencia. Corte el tectal tejido que rodea el área de etiquetado con un cuchillo de microcirugía. Asegúrese de que la dirección del tejido en El tectum (antero-posterior, dorsal-ventral).
- Transferir el tejido marcado con un gotero plástico el prospecto para que el lado de pia se une a la inserción. Coloque el tejido tectal en la dirección deseada y quitar exceso HBSS (figura 1paso 2).
- Repita Inserte 2.4-2.7 para preparar otros tejidos en el mismo. Colocar el plato en la cámara precalentada en el microscopio confocal invertido (figura 1paso 3).
3. la proyección de imagen Time-lapse
- Compruebe el etiquetado fluorescente y enfocar el campo microscópico en el microscopio confocal invertido. Comienzan las unidades de láser confocal y trate de muestreo la exploración confocal para ajustar la dirección y la posición de los tejidos a lo largo de la X y el eje y en el campo. Utilice 10 X o 20 X objetivo sin aceite de inmersión.
- Seleccionar el tamaño de exploración (por ejemplo, 512 x 512 dpi). Decidir el intervalo y rango total de la exploración confocal a lo largo del eje z. Tomar un intervalo μm 5 o 10 para el rango de 100 μm. Decidir el intervalo de tiempo de la proyección de imagen confocal y total duración (p. ej., intervalos de 10 minutos más de 48 horas) la proyección de imagen.
Nota: Para evitar el láser fototoxicidad, prohibir la exploración en el alto tamaño escaneado con z-intervalos cortos para la gama z larga, o con intervalos de tiempo corto durante el tiempo de duración. Por ejemplo, al aplicar un análisis de alta tamaño (por ejemplo, 1024 x 1024 dpi), disminuir el número de exploraciones a lo largo del eje z. - Conjunto de los parámetros del funcionamiento de confocal programa descrita en 3.2 y empieza la proyección de imagen.
- Después de la proyección de imagen, combinar las imágenes confocales en diferente z-eje para proporcionar imágenes z-pila con ajuste fino focal en cada punto del tiempo.
- Anexar las imágenes z-stack en diferente momento y construir una película de lapso de tiempo en formato AVI.
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Representative Results
La figura 2 muestra la migración tangencial superficial visualizada en una cultura de plano-montaje en un tiempo transcurrido (0, 9, 18, 27 h) después del inicio de la grabación. Película 1 es una película de lapso de tiempo de 10 min-intervalos durante un periodo de 28 h y 50 min. El marco está seleccionado para centrarse en la migración de las células de la etiqueta esquina inferior izquierda del cuadro al espacio sin etiqueta (Figura 3A). El movimiento masivo de la migración de las células (GFP; panel izquierdo superior, película 1) y sus núcleos (mCherry Nuc; panel derecho superior) pueden ser observados con la película combinada (panel inferior, película 1). Direccionalidad de la migración de la célula puede ser examinado por centrarse en las células dispersión desde el centro marcado en todas las direcciones (película 2, figura 3B).
Las imágenes claras del movimiento nuclear (película 2; mCherry-Nuc, panel derecho) nos permite rastrear la migración nuclear de la célula de seguimiento automático utilizando un rastreador de partículas plugin10 a Fiji de procesamiento de imágenes aplicación de ImageJ11 (Película 3, figura 3B). Cambios temporales de las trayectorias de la migración tangencial pueden visualizarse para probar la migración de dispersión en omni-direcciones.
Comportamiento de la célula individual con el cambio secuencial morfológico del proceso principal, perdiendo el proceso y los núcleos puede manifestarse con más imágenes de aumento de intervalos de 5 min (película 4, figura 3).
Otro tipo de migraciones tangenciales en las capas medias7 se puede visualizar utilizando un protocolo similar (película 5, figura 3D). Migración lineal bidireccional a lo largo de la Unión de axón que dorsal ventral (arriba a abajo) es evidente7.
Figura 1. Diagrama de flujo del protocolo. Paso 1: electroporación en ovo. Paso 2: Colocación tejido tectal de aumento para que el lado de pia se une a la inserción. Paso 3: Microscopio fluorescente invertido unidad de confocal laser. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Visualización de la migración tangencial superficial en la cultura de plano de montaje. Las migración tangencial de las células (GFP, panel superior) y el núcleo (Nuc mCherry, panel inferior) en las capas superficiales del tectum óptico se muestran en 0, 9, 18, 27 h después del inicio de la cultura de E7.0. Las células en la esquina inferior izquierda del marco están etiquetadas en 0 h (ver Figura 3A). Barra de escala: 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Figura esquemática que ilustra las condiciones de montaje Time-lapse imagen. La forma de la etiqueta fluorescente (verde), dirección inicial de la migración celular (magenta) y fotogramas de vídeo (cuadrado negro) fueron ilustrados con la ampliación de la lente del objetivo (obj) y zoom digital (zoom) en el campo superior, con el día de la electroporación (EP ) y el inicio de la cultura (cultura) en el campo inferior. Película 1, (B) Movie 2 y 3, (C) película 4, (D) película 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película de 1. Visualización de la migración tangencial superficial en una plano de montaje cultura. Movimiento de las células migrantes tangencialmente (GFP, panel superior izquierdo) y sus núcleos (mCherry Nuc; panel derecho superior) en las capas superficiales de la tectum óptico después de la aparición de la cultura de E7.0. La imagen combinada se muestra en la parte inferior. Las células en la esquina inferior izquierda del marco están etiquetadas a 0 h (ver Figura 3A), y las imágenes de lapso de tiempo fueron capturadas más 28 h y 50 min barra de escala: 100 μm. haga clic aquí para ver este video. Clic para descargar.
Película de 2. Dispersar el movimiento de las células migrantes tangencialmente (GFP; panel de la izquierda) y sus núcleos (mCherry Nuc; panel de la derecha) desde el centro de ambos paneles se muestran más de 48 h (ver figura 3B). Barra de escala: 100 μm. haga clic aquí para ver este video. Clic para descargar.
Pelicula de 3. Trayectorias de la migración tangencial. Desplazamiento del núcleo de la célula (el panel derecho de la película 2) se realiza un seguimiento para visualizar las trayectorias de la migración tangencial. Barra de escala; 100 μm. por favor haga clic aquí para ver este video. Clic para descargar.
Película de 4. Comportamiento de la célula individual en mayor aumento. Movimiento de las células individuales (GFP; panel de la izquierda) y sus núcleos (mCherry Nuc; panel de la derecha) se muestran en la mayor ampliación sobre 24 h (ver figura 3). Proceso de ramificación del proceso principal puede ser reconocido. Barra de escala: 100 μm. haga clic aquí para ver este video. Clic para descargar.
Película de 5. Migración de la capa media. Movimiento de las células migrantes tangencialmente (GFP; panel de la izquierda) y su núcleo (Nuc mCherry; panel de la derecha) en las capas medias tectal aparecen más de 24 h después del inicio de la cultura de E6.0 (véase la figura 3D). Migración lineal eje dorso-ventral (más abajo) es notable. Barra de escala: 100 μm. haga clic aquí para ver este video. Clic para descargar.
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Discussion
El protocolo descrito anteriormente está optimizado para detectar la migración celular en capas superficiales6,8. Es aplicable para la detección de capa media migración arroyos (película 5)6,7, cambiando el momento de la electroporación (E5.5 a E4.5) y el inicio de la cultura y la proyección de imagen (E7.0 a E6.0).
El procedimiento presentado se compone de células etiquetado por electroporación en ovo, cultura de plano-montaje y proyección de imagen confocal de Time-lapse (figura 1). En primer lugar, es un requisito que se deben optimizar las condiciones de cultivo para mantener el tejido saludable y creciente normalmente como en vivo. También es crucial asegurar que la orientación del tejido es adecuada para detectar la migración celular. Para tales fines, aplicamos una cultura de plano-montaje en la parte movible de la célula, que facilita la observación de la dispersión de células horizontales y suministros medio rico con altas concentraciones de oxígeno. Después de asegurarse de la condición de la cultura y la orientación, es fundamental para la visualización ajustar las condiciones contradictorias de etiquetado mejor fluorescente con menos electrónica y foto daño. Para el mejor etiquetado, podemos elegir un vector de expresión con un promotor eficiente y electroporate concentran ADN. Para lograr el menor daño, es importante moderar la condición eléctrica de la electroporación, reducir la concentración de ADN y minimizar el tiempo total de la irradiación del laser.
Una ventaja de este protocolo con la cultura de plano-montaje de la cubierta de la célula es que podemos observar la migración tangencial celular a largo plazo. Generalmente, es difícil determinar cuánto del tejido en cultura mantiene las condiciones fisiológicas en comparación con la en ovo. Por lo menos, migración tangencial superficial continúa durante 72 h después del inicio de la cultura en E7.0, que demuestra el dispersión celular normal similar a ése en ovo8. Además, tejido fresco se prepara en el inicio de la cultura y la proyección de imagen para observar la migración en etapas posteriores. También es ventajoso que desplazamiento celular puede seguirse durante un largo período porque las células siguen moviendo horizontalmente en las hojas planas superficiales del tectum, que está cerca de la lente del objetivo. Usando el sistema confocal también facilita el seguimiento de movimiento a lo largo del eje z de la célula. Por otro lado, una desventaja de este método es que la cultura de plano-montaje no siempre es pertinente recapitular otros tipos de migración como la migración radial. Cuando el método se aplica para observar la migración radial en la rebanada tectal de aumento de la cubierta, el espesor del tejido tectal no aumenta tan rápidamente como en ovo. El método de cultivo de slice en el gel de colágeno puede ser mejor recapitular tal desarrollo de la capa.
Ya que nuestro método permite la observación de movimiento horizontal paralelo a la inserción de la cultura, potencialmente puede aplicarse para la detección del cambio secuencial de la etiqueta fluorescente micro-estructura, incluyendo la elongación axonal en el tejido neural o desplazamiento de la célula en el tejido no neural. Por ejemplo, después de etiquetar axons commissural del tubo neural en desarrollo por la electroporación, se pueden visualizar movimientos de axones previos y post travesía sobre la placa de piso en la cultura libro abierto incisión de la placa del techo. Siempre que la condición de la cultura apropiada de la cubierta de la célula está disponible para reproducir en vivo las condiciones, nuestro método ofrece una técnica eficaz para visualizar los movimientos horizontales de diferentes tipos de células y estructuras.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por JSP KAKENHI número 15K 06740 a Y.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
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