Summary
Vi beskriver metoderna för fluorescerande märkning av tangentiellt migrera cellerna av elektroporation och för time-lapse avbildning av märkt cell rörelse i en platt-mount kultur för att visualisera migrera cell beteende i den framkallande chick fiberoptiska tectum .
Abstract
Time-lapse bildbehandling är en kraftfull metod för att analysera migrera cell beteende. Efter fluorescerande cell märkning, kan förflyttning av de märkta cellerna i kultur registreras under video mikroskopi. För att analysera cellmigration i hjärnans utveckling, används slice kultur ofta att observera cellmigration parallell till avsnittet slice, som radiella cellmigration. Dock kan begränsad information erhållas från metoden slice kultur att analysera cellmigration vinkelrätt till avsnittet slice, som tangerar cellmigration. Här presenterar vi protokollen för time-lapse imaging att visualisera tangentiella cellmigration i den framkallande chick fiberoptiska tectum. En kombination av cell märkning av elektroporation i ovo och en efterföljande platt-mount kultur på cell kultur skäret ger detektering av migrerar cellers rörelser i horisontalplanet. Dessutom underlättar vår metod upptäckt av både enskild cell beteende och de fackliga stridsåtgärder av en grupp av celler på lång sikt. Denna metod kan potentiellt användas för att upptäcka den sekventiell förändringen av lysrör-märkt mikro-struktur, inklusive den axonal töjning i neurala vävnader eller celler förskjutningen i den icke-nervvävnad.
Introduction
Studien av cellmigration har framskridit med de framryckande tekniken för levande imaging. Efter fluorescerande cell märkning, kan den temporal rörligheten för märkta celler i en kultur maträtt eller i vivo registreras under video mikroskopi. I studien av neural utveckling, har de morfologiska förändringarna av migrera celler eller elongating axoner analyserats med hjälp av time-lapse imaging. För effektiv bildbehandling är det viktigt att tillämpa en lämplig metod för fluorescerande cell märkning och vävnad förberedelse, baserat på syftet med de experiment och analyser. För att analysera cellmigration i hjärnans utveckling, använts slice kultur ofta att observera cellmigration parallell till avsnittet segment, såsom radiella cell migration1,2,3. Systemets slice kultur används också för att upptäcka tangentiella cell migration4,5, men det passar inte för riktad analys i fall där cellerna skingra vinkelrätt till avsnittet slice.
Den fiberoptiska tectum består av ett mångbottnat struktur, bildas av radiell och tangentiell cellmigration under fosterutvecklingen. Tectal lager bildas beror främst på radiella migration av postmitotic neuronala föregångare celler från zonen ventrikulära och slutdestinationen i lager korrelerar med deras födelsedatum i ventrikulära zon6. När det gäller tangentiella migration rapporterat vi tidigare två strömmar av migreringar i mitten och ytliga lagren i en utvecklande chick fiberoptiska tectum. I de mellersta skikten under E6-E8 migrera de bipolära cellerna med en länge ledande och en tunn avslutande processen dorsalt eller ventralt längs de axon fasciculus av tectal efferent axoner som kör dorso-ventralt7. Efter denna axophilic migration differentieras cellerna till multipolär nervceller som ligger i de djupa skikten. I de ytliga lagrarna under E7-E14 skingra de migrera cellerna vågrätt genom att reformera en förgrenad ledande process och scatter i flera riktningar8. Efter dispergering migration, differentieras senare cellerna så småningom till ytliga nervceller av olika morfologier. I båda fallen är en platt-mount kultur effektiva att iaktta cell rörelse parallell till pial ytan.
Här presenterar vi ett protokoll för time-lapse imaging att visualisera tangentiella cellmigration i utvecklingsländer chick fiberoptiska tectum7,8. Kombinationen av cell märkning av elektroporation i ovooch en efterföljande platt-mount kultur på cell kultur skäret ger detektering av migrera cell rörlighet och migration riktning. Målet med denna metod är att underlätta identifiering av både enskild cell beteende på lång sikt och de fackliga stridsåtgärder av en grupp av celler i horisontalplanet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Elektroporation i Ovo
- Förbereda den uttryck plasmiden DNA för fluorescerande märkning i hög koncentration. Isolera DNA från 200 mL bakterieodling av metoden alkaliska lysis hjälp anjon-exchange kolumner enligt tillverkarens protokollet (Tabell för material). Blanda pCAGGS-andra och pCAGGS-mCherryNuc med en slutlig koncentration på 4 µg/µL varje.
Obs: Endotoxinfria plasmid DNA rening kan vara att föredra för elektroporation. - Inkubera bördiga hönsägg horisontellt vid 38 ° C i 70% relativ luftfuktighet.
- Efter 2,5 dagar, eliminera 5 mL äggvita (äggvita) från den spetsiga sidan av ägget med 20 mL spruta med en 18 gauge kanyl och försegla nål hålet med tejp.
- Skär toppen av äggskal med böjd sax för att öppna ett hål 2 cm i diameter och kontrollera utvecklingsstadiet av embryot under stereomikroskopet (etapp 17 hamburgare och Hamilton9). Försegla hålet igen med tejp.
Obs: Detta steg kan utföras när som helst under E2.5-E3.0. Steg 1.3 och 1.4 sänker nivån av embryot i ägget till undvika en tät fastsättning av det växande embryot och blodkärlen till det övre skalet. - Fortsätt inkuberingen tills E5.5.
- Innan elektroporation, förbereda 10 µL av nämnda plasmid DNA färgad med 0,5 µL av snabbt grönt (25 mg/mL), 10 mL av Ånghärdad fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller penicillin (100 enheter/mL) och streptomycin (100 μg/mL) och Mikropipetter tillverkad Kapillär glasrör med en mikropipett processor. Skär den distala spetsen på den mikropipett att göra lämplig storlek av pore beroende på mängden DNA för injektion.
- Skär förseglade översta skalet med sax för att öppna ett hål 2,5 cm i diameter och Ställ in ägget stabilt under stereomikroskopet. Tillsätt några droppar av PBS in i ägget. Lossna det allantoiska membranet som täcker embryot utan blödning med två fina pincett. Ta bort amnionen från chefen för embryot.
- Medan du slår i huvudet med en microspatula, injicera 0,1-1 μL av färgade DNA i ventrikulära kaviteten av den vänstra fiberoptiska tectum med hjälp av en mikropipett ansluten till en insugningsröret.
Obs: Mängden DNA injiceras beror på syftet med experimentet. Koncentrerad DNA lösning bör sjunka och bifoga längs ventrikulära väggen. - Placera ett par av forcep-typ elektroder (3 mm fyrkantig elektroder med 7 mm avstånd) så att målområdet den fiberoptiska tectumis placeras mellan (figur 1steg 1).
Obs: DNA är electroporated till anod sidan. - Debitera en pre puls av 30 V, 1 ms med ett intervall på 5 ms och fyra efterföljande pulser med 6 V, 5 ms med 10 ms intervall med pulsgeneratorn.
Obs: Elektroniska tillståndet beror på storlek och avståndet mellan elektroderna. Det bör vara tillräckligt stark för att uppnå effektiv transfection, men det måste vara tillräckligt blygsamma för att försäkra den normala utvecklingen av målvävnaden. - Försegla hålet med tejp och fortsätta inkubation. Blötlägg elektroderna i PBS ta bort äggvita med en mellanrumsborste i en plast skål. Upprepa 1,7-1.11 för varje ägg.
2. platt-Mount kultur på Cell skäret
- En dag innan den plan-mount kulturen, förbereda belagda cell kultur skäret. Flyta några cell kultur skär på Ånghärdad destillerat vatten i en 10-cm cell kultur maträtt. Ladda en lösning av 8 µg/mL laminin och 80 µg/mL poly-L-lysin att täcka skären och lämna flöt skären i cell kultur CO2 inkubatorn vid 37 ° C över natten.
Obs: På följande dag, de belagda skär kan lagras vid 4 ° C. - Dagen av kulturen på E7.0, ta bort laminin-poly-L-lysin lösningen från skäret och placera insatsen i ett glas botten skålen (figur 1steg 2) fylld med 1,1 mL odlingsmedium (60% minskad serum medium, 20% F12, 10% fetalt bovint serum, 10 % chick serum, 50 enheter/mL penicillin, 50 μg/mL streptomycin). Hålla skålen i cell kultur CO2 inkubator vid 37 ° C.
Obs: Medium kan användas under hela kultur i tre dagar utan förändring. - Förbereda den kultur setup. Ställa in en fuktig kammare på en inverterad confocal Mikroskop med ett gasflöde 40% O2 och 5% CO2 (gas controller) vid 38 ° C (temperatur styrenhet).
- Skär huvudet av embryot med sax. Nyp ihop huvudet ut med tången i den iskalla Hanks balanserad saltlösning (HBSS) i en 6-cm cell kultur maträtt.
- Isolera den electroporated fiberoptiska tectum med två fina pincett. Överföra tectum med en plast dropper i en annan skål fylld med iskall HBSS. Använda Hull glas skålen baserade med svart kisel som ett tefat för kapning.
- Kontrollera positionen för märkning i fluorescens stereoskopisk Mikroskop. Klipp ut tectal vävnaden som omger området märkning med en mikrokirurgisk kniv. Kontrollera riktningen av vävnaden i tectum (anterior-posterior, dorsal-ventrala).
- Överföra märkt vävnaden med en plast dropper till skäret så att den pia-sidan är kopplad till skäret. Låg tectal vävnaden i önskad riktning och ta bort överflödig HBSS (figur 1steg 2).
- Upprepa 2,4-2,7 för att förbereda andra vävnader på samma sätt. Placera skålen i förvärmd kammaren i inverterad confocal mikroskopet (figur 1steg 3).
3. time-Lapse Imaging
- Kontrollera den fluorescerande märkning och fokusera fältet mikroskopiska i inverterad confocal mikroskopet. Starta laser confocal enheterna och försök provtagning confocal skanningen för att justera riktningen och vävnaden längs X- och y-position i fältet. Använda 10 X eller 20 X objektiv utan nedsänkning olja.
- Välj skanning storlek (t.ex. 512 x 512 dpi). Bestämma intervallet och totala utbud av confocal genomsökningen längs z-axeln. Ta en 5 eller 10 µm intervall för intervallet 100 µm. Besluta tidmellanrummet av de confocal imaging och total imaging varaktighet (t.ex. 10 min intervaller över 48 h).
Obs: För att undvika laser fototoxicitet, förbjuda skanning i hög skanning storlek med z-Kortintervaller för lång z-intervallet, eller med kort tidsintervall under långa imaging. Till exempel när du tillämpar en hög skanning storlek (t.ex. 1024 x 1024 dpi), minska antalet längs z-axeln. - Ställ in parametrarna för confocal kör programmet beskrivs i 3.2 och starta imaging.
- Efter bildtagning, kombinera de confocal bilderna på olika z-axis ger z-stack bilder med fokal finjustering vid varje tidpunkt.
- Lägg till z-stack bilder vid olika tidpunkt och konstruera en time-lapse film i formatet AVI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar visualiserade ytliga tangentiella migreringen i en platt-mount kultur på en förfluten tid (0, 9, 18, 27 h) efter uppkomsten av inspelning. Filmen 1 är en time-lapse film av 10 min-intervall under en period av 28 h och 50 min. Ramen är markerad för att fokusera på att migrera cellerna från märkt nedre vänstra hörnet av ramen omärkt utrymmet (figur 3A). Massrörelse migrerar celler (GFP; övre vänstra panelen film 1) och deras kärnor (mCherry-Nuc; övre högra panelen) kan observeras med den sammanslagna filmen (nedre panelen, film 1). Riktningen på cellmigration kan undersökas genom att fokusera på spridning celler från märkt center till alla riktningar (film 2, figur 3B).
De tydliga bilderna av kärntekniska rörelsen (Movie 2; mCherry-Nuc, högra panelen) gör det möjligt för oss att spåra cell nuclear migreringen av automatisk spårning med hjälp av en partikel Tracker plugin10 av en Fiji bildbehandling tillämpningen av ImageJ11 (Film 3, figur 3B). Tidsmässiga förändringar av trajectoriesen tangentiella migrationen kan visualiseras för att bevisa spridning migreringen i omni-riktningar.
Enskild cell beteende med sekventiell morfologisk förändring av ledande processen, avslutande processen och atomkärnor kan manifesteras med högre förstoring bilder av 5 min-intervall (film 4, figur 3 c).
En annan typ av tangentiella migration i mellersta lager7 kan visualiseras med ett liknande protokoll (film 5, figur 3D). Dubbelriktad linjär migration längs de axon fasciculus kör dorsala till ventrala (uppifrån och ner) är uppenbart7.
Figur 1. Protokoll flödesschema. Steg 1: elektroporation i ovo. Steg 2: Om tectal vävnad så att den pia-sidan är kopplad till skäret. Steg 3: Inverterad fluorescerande Mikroskop med confocal laserenhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Visualisering av ytliga tangentiella migration i platt-mount kultur. Tangentiellt migrerar cellerna (GFP; övre panelen) och kärnan (mCherry-Nuc; nedre panelen) i de ytliga lagrarna av den fiberoptiska tectum visas på 0, 9, 18, 27 h efter uppkomsten av kulturen från E7.0. Cellerna i det nedre vänstra hörnet av ramen är märkta vid 0 h (se figur 3A). Skalstapeln: 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3. Schematisk bild som illustrerar mount villkoren för time-lapse imaging. Form av fluorescerande märkning (grön), inledande riktning cellmigration (magenta), och videobildruta (svart ruta) illustrerades med förstoring av objektiv (obj) och digital zoom (zoom) i det övre fältet, med dag elektroporation (EP ) och uppkomsten av kulturen (kultur) i det nedre fältet. (A) film 1, film 2 och 3, (C) film 4, (D) Movie 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1. Visualisering av ytliga tangentiella migration i en platt-mount kultur. Rörlighet för tangentiellt migrerar cellerna (GFP; övre vänstra panelen) och deras kärnor (mCherry-Nuc; övre högra panelen) i de ytliga lagrarna av den fiberoptiska tectum efter uppkomsten av kulturen från E7.0. Den sammanslagna bilden visas i den nedre panelen. Cellerna i det nedre vänstra hörnet av ramen är märkta på 0 h (se figur 3A), och de time-lapse bilderna fångades över 28 h och 50 min. skalstapeln: 100 µm. vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ner.
Film 2. Spridning rörelsen av tangentiellt migrerar cellerna (GFP; vänstra panelen) och deras kärnor (mCherry-Nuc; högra panelen) från mitten av båda panel visas över 48 h (se figur 3B). Skalstapeln: 100 µm. vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ner.
Film 3. Bollbanor tangentiella migrationens. Förskjutning av cellkärnan (den högra panelen av Movie 2) spårades för att visualisera trajectoriesen tangentiella migrationen. Skalstapeln; 100 µm. vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ner.
Movie 4. Enskild cell beteende i högre förstoring. Rörlighet för de enskilda cellerna (GFP; vänstra panelen) och deras kärnor (mCherry-Nuc; högra panelen) visas i högre förstoring över 24 h (se figur 3 c). Förgrenade processen av ledande processen kan kännas igen. Skalstapeln: 100 µm. vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ner.
Film 5. Mellersta lagret migration. Förflyttning av tangentiellt migrerar cellerna (GFP; vänstra panelen) och deras nucleus (mCherry-Nuc; högra panelen) i tectal mellersta lager visas över 24 h efter uppkomsten av kulturen från E6.0 (se figur 3D). Linjär migration längs dorso-ventrala axeln (uppifrån och ner) är anmärkningsvärda. Skalstapeln: 100 µm. vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som beskrivs ovan är optimerad för att upptäcka cellmigration i ytliga lager6,8. Det gäller att upptäcka mellanlager migration strömmar (film 5)6,7, bara genom skiftande tidpunkten för elektroporation (E5.5 till E4.5) och uppkomsten av kultur och imaging (E7.0 till E6.0).
Presenterade förfarandet består av cell märkning av elektroporation i ovoplatt-mount och kultur time-lapse confocal imaging (figur 1). Först av allt, är det en förutsättning att villkor som kultur bör optimeras för att hålla vävnaden friska och växande normalt som in vivo. Det är också viktigt att se till att orienteringen av vävnad är lämplig för att upptäcka cellmigration. För sådana ändamål tillämpar vi en platt-mount kultur på cell Infoga, vilket underlättar observation av horisontella cell spridning och levererar rik medium med hög syre. Efter att säkerställa kultur skick och läggning, det är kritiska för visualisering att justera de motstridiga villkor bättre fluorescerande märkning med de minst elektroniska och foto skador. För bättre märkning, kan vi välja en uttryck-vektor med en effektiv främjare och electroporate koncentrerat DNA. För att nå minst skada, är det viktigt att moderera elektroporation elektrisk skick, lägre DNA koncentrationen och minimera den totala tiden för laser irradiation.
En fördel med detta protokoll med hjälp av platt-mount kultur på cell Skäret är som vi kan observera tangentiella cellmigration på lång sikt. Generellt, är det svårt att avgöra hur länge vävnaden i kultur upprätthåller de fysiologiska förhållandena i jämförelse med det i ovo. Åtminstone, ytliga tangentiella migrationen fortsätter över 72 tim efter debut av kultur på E7.0, som visar normala cellulära dispersion liknar att i ovo8. Dessutom förbereds färsk vävnad i början av kulturen och imaging att iaktta migration i senare skeden. Det är också fördelaktigt att cellen förskjutning kan följas under en lång period eftersom cellerna fortfarande rör sig horisontellt i de ytliga platt ark av den tectum, som ligger nära objektivet. Med hjälp av confocal systemet underlättar också spårning cell rörelse längs z-axeln. Däremot, är en nackdel med denna metod att platt-mount kultur inte alltid relevant att sammanfatta andra typer av migration som radiella migration. När metoden används för att iaktta radiella migration i tectal segmentet på skäret, ökar tjockleken på tectal vävnaden inte så snabbt som det i ovo. Metoden slice kultur i kollagen gel kan vara bättre att recapitulate sådan lager utveckling.
Eftersom vår metod gör det möjligt för observationen av horisontell rörelse parallell till kultur Infoga, det potentiellt kan tillämpas för att upptäcka Sekventiell förändring av lysrör-märkt mikro-struktur, inklusive den axonal töjning i nervvävnad eller cell förskjutning i den icke-nervvävnad. Exempelvis efter märkning commissural axoner i utvecklingsländer neuralrörsdefekter av elektroporation, kan förflyttningar av före och efter korsning axoner över bottenplattan visualiseras i öppna boken kultur öppning tak plattan. Under förutsättning att villkoret lämpliga kultur på cell Skäret är tillgänglig för återgivning i vivo villkor, ger vår metod en effektiv teknik för att visualisera horisontella rörelser av olika celltyper och strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av JSPS KAKENHI licensnummer 15K 06740 till Y.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R.
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
