Summary
Descrevemos os métodos para a rotulagem fluorescente de tangencialmente migração células por eletroporação e para a imagem latente de lapso de tempo do movimento de célula rotulada em uma cultura de montagem plana a fim de visualizar a migração celular comportamento no tectum óptica do pintinho em desenvolvimento .
Abstract
Imagem de lapso de tempo é um método poderoso para analisar o comportamento de migração celular. Após a célula fluorescente rotulagem, o movimento das células em cultura etiquetados pode ser gravado sob microscopia de vídeo. Para a análise de migração celular no cérebro em desenvolvimento, fatia cultura comumente é usada para observar a migração celular paralela à seção de fatia, tais como migração celular radial. No entanto, informação limitada pode ser obtida o método de cultura de fatia para analisar a migração celular perpendicular à seção de fatia, tais como migração celular tangencial. Aqui, apresentamos os protocolos para Time-Lapse de imagens para visualizar a migração celular tangencial no tectum óptica do pintinho em desenvolvimento. Uma combinação de célula rotulagem por eletroporação no ovo e uma cultura de montagem plana subsequente na inserção da cultura de célula permite a detecção de movimento de células migratórias no plano horizontal. Além disso, nosso método proporciona detecção de comportamento de célula individual e a ação coletiva de um grupo de células a longo prazo. Potencialmente, este método pode ser aplicado para detectar a alteração sequencial da fluorescente-etiquetadas microestrutura, incluindo o alongamento axonal no deslocamento de tecidos ou células neural nos tecidos não-neurais.
Introduction
O estudo da migração celular tem sido progredindo com a técnica de avançada de imagem ao vivo. Após a célula fluorescente rotulagem, o movimento temporal de pilhas etiquetadas em um prato de cultura ou na vivo pode ser gravado sob microscopia de vídeo. No estudo do desenvolvimento neural, foram analisadas as mudanças morfológicas da migração de células ou alongando axônios utilizando imagens de lapso de tempo. Para a imagem latente eficaz, é essencial para aplicar um método adequado para a preparação de rotulagem e tecido fluorescente célula, baseado sobre a finalidade do experimento e análise. Para analisar a migração celular no cérebro em desenvolvimento, fatia cultura tem sido comumente usada para observar a migração celular paralela à seção de fatia, como célula radial migração1,2,3. O sistema de cultura de fatia é também utilizado para detectar células tangencial migração4,5, mas não é adequado para análise direcional em casos onde as células se dispersar perpendicular à seção de fatia.
O tectum óptica é composta de uma estrutura de várias camada, formada pela migração radial e tangencial celular durante o desenvolvimento embrionário. Formação de camada tectal depende, principalmente, migração radial de células postmitotic neuronal precursor da zona ventricular, e seu destino final nas camadas correlaciona-se com sua data de nascimento na zona ventricular6. Quanto a migração tangencial, relatamos anteriormente dois fluxos de migrações nas camadas intermediária e superficiais em um desenvolvimento tectum óptica de garota. Nas camadas médios durante E6 E8, as células bipolares com um processo de tempo principal e um processo à direita fino migram dorsalmente ou ventralmente ao longo do fascículo axônio de axônios eferentes tectal executados dorso-ventralmente7. Após esta migração de axophilic, as células se diferenciar em neurônios multipolares localizados nas camadas profundas. Nas camadas superficiais durante E7-E14, as células migratórias dispersarem-se horizontalmente através da reforma de um processo principal ramificado e dispersão em múltiplas direções8. Após a migração de dispersão, as último células eventualmente se diferenciar em neurônios superficiais de várias morfologias. Em ambos os casos, uma cultura de plano de montagem é eficiente para observar o movimento da célula paralela à superfície pial.
Aqui, apresentamos um protocolo para Time-Lapse de imagens para visualizar a migração celular tangencial no desenvolvimento garota tectum óptica7,8. Combinação de célula rotulagem por eletroporação no ovoe uma cultura de montagem plana subsequente na inserção da cultura de célula permite a detecção de direção de movimento e migração de células migrando. O objetivo desse método é facilitar a detecção de comportamento ambos célula individual o longo prazo e a ação coletiva de um grupo de células no plano horizontal.
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Protocol
1. Electroporation no Ovo
- Prepare o plasmídeo de expressão para a rotulagem fluorescente em alta concentração. Isole o DNA de 200 mL de cultura bacteriana pelo método de Lise alcalina, utilizando colunas permutadora de acordo com o protocolo do fabricante (Tabela de materiais). Mix pCAGGS-EGFP e pCAGGS-mCherryNuc em uma concentração final de 4 µ g / µ l cada.
Nota: A purificação de DNA de plasmídeo livre de endotoxinas pode ser preferencial para eletroporação. - Incube ovos férteis de galinha horizontalmente a 38 ° C, em 70% de humidade relativa.
- Após 2,5 dias, eliminar 5 mL de albumina (clara de ovo) do lado pontiagudo do ovo com uma seringa de 20 mL com uma agulha de 18 calibre e selar o buraco da agulha com a fita.
- Corte a parte superior da casca do ovo com uma tesoura curva para abrir um buraco de 2 cm de diâmetro e verificar o estágio do desenvolvimento do embrião sob o microscópio estereoscópico (estágio 17 de Hamburger e Hamilton9). Feche o buraco novamente com fita.
Nota: Esta etapa pode ser executada a qualquer momento durante a E2.5-E3.0. Passos, 1.3 e 1.4 diminuir o nível do embrião no ovo para evitar uma ligação apertada do embrião crescente e os vasos sanguíneos com o revestimento superior. - Continue a incubação até 5.5.
- Antes electroporation, prepare-se 10 µ l do mencionado Plasmídeo colorido com 0,5 µ l de Fast Green (25) mg/mL, 10 mL de tampão de fosfato autoclavado salino (PBS) contendo penicilina (100 unidades/mL) e estreptomicina (100 μg/mL) e feitas a partir de micropipetas tubos capilares de vidro usando um processador de micropipeta. Corte a ponta distal a micropipeta para fazer um tamanho adequado de poros dependendo da quantidade de DNA para a injeção.
- Corte o revestimento superior selado com uma tesoura para reabrir um buraco de 2,5 cm de diâmetro e definido o ovo estàvel ao microscópio estéreo. Adicione algumas gotas de PBS no ovo. Retire a membrana alantoico cobrindo o embrião sem hemorragia usando duas pinças bem. Remova o âmnio da cabeça do embrião.
- Ao girar a cabeça com um microspatula, injetar 0,1-1 μL de DNA colorido na cavidade ventricular do tectum óptica esquerda utilizando uma micropipeta conectado a um tubo de sucção.
Nota: A quantidade de DNA injetado depende da finalidade do experimento. Solução concentrada de DNA deve afundar e anexar ao longo da parede ventricular. - Coloque um par de eletrodos tipo pinça (eletrodos quadrados 3 mm com distância de 7 mm) para que o alvo da óptica tectumis colocado entre (Figura 1etapa 1).
Nota: O DNA é electroporated para o lado do ânodo. - Cobra um pre-pulso de 30 V, 1 ms, com um intervalo de 5 ms e quatro pulsos subsequentes de 6 V, 5 ms, com um intervalo de 10 ms usando o gerador de pulso.
Nota: A condição eletrônica depende do tamanho e distância dos eléctrodos. Deve ser forte o suficiente para alcançar a transfeccao eficiente, mas deve ser bastante modesto para assegurar o desenvolvimento normal do tecido alvo. - Selar o furo com a fita e continuar a incubação. Mergulhe os eléctrodos em PBS para remover a albumina com um escovilhão em um prato de plástico. Repita 1.7-1.11 para cada ovo.
2. plano de montagem cultura na inserção da célula
- Um dia antes da cultura do plano de montagem, prepare a inserção de cultura celular revestido. Flutuam algumas inserções de cultura de células na água destilada esterilizada em um prato de cultura celular de 10 cm. Carrega uma solução de 8 µ g/mL laminina e 80 µ g/mL poli-L-lisina, para cobrir as inserções e deixar as inserções flutuadas na incubadora celular cultura CO2 a 37 ° C durante a noite.
Nota: No dia seguinte, as inserções revestidas podem ser armazenadas a 4 ° C. - No dia da cultura no E7.0, remover a solução de laminina-poli-L-lisina da inserção e coloque a inserção em um fundo prato de vidro (Figura 1passo 2) preenchido com 1,1 mL de meio de cultura (meio soro reduzida de 60%, 20% F12, 10% de soro fetal bovino, 10 % de soro de pintinho, 50 unidades/mL penicilina, estreptomicina 50 de μg/mL). Mantenha o prato na incubadora celular cultura CO2 a 37 ° C.
Nota: O meio pode ser usado durante todo o período de cultura há três dias sem alteração. - Prepare a instalação da cultura. Defina uma unidade de câmara húmida em um microscópio confocal invertido com um fluxo de gás de 40% O2 e 5% CO2 (controlador de gás) a 38 ° C (controlador de temperatura).
- Cortou a cabeça do embrião com tesoura. Aperte a cabeça para fora com a pinça em solução de sal balanceada de Hanks gelada (HBSS) em um prato de cultura celular de 6 cm.
- Isole o tectum óptica electroporated usando duas pinças bem. Transferi o tectum com um conta-gotas plástico para outro prato cheio de HBSS gelada. Use o prato de vidro concaved baseado com silício negro como um pires para o corte.
- Verifique a posição da rotulagem sob o microscópio estereoscópico de fluorescência. Corte o tecido tectal que cercam a área de rotulagem com uma faca microcirúrgica. Certifique-se a direção do tecido no tectum (ântero-posterior, dorso-ventral).
- Transferi o tecido rotulado com um conta-gotas de plástico para a inserção para que o lado da pia é anexado para a inserção. Colocar o tecido tectal na direção desejada e retire o excesso HBSS (Figura 1passo 2).
- Repita inserir 2.4-2.7 para preparar outros tecidos na mesma. Coloque o prato no hemiciclo escaldado em microscópio confocal invertido (Figura 1etapa 3).
3. Time-Lapse Imaging
- Verifique a rotulagem fluorescente e focar o campo microscópico no microscópio confocal invertido. Começar as unidades confocal laser e tente a varredura confocal para ajustar a direção e a posição do tecido ao longo do X e o eixo y no campo de amostragem. Use o X 10 ou 20 X objectiva sem óleo de imersão.
- Selecione o tamanho de digitalização (por exemplo, 512 x 512 dpi). Decida o intervalo e a gama completa da varredura confocal ao longo do eixo z. Tire um 5 ou 10 µm de intervalo para o intervalo de 100 µm. Decida o intervalo de tempo da imagem latente confocal e total da imagem latente de duração (por exemplo, 10 min intervalos de mais de 48 h).
Nota: Para evitar o laser fototoxicidade, proibir digitalização no tamanho digitalização alto com z-intervalos curtos para o z-longo alcance, ou com intervalos de tempo curto durante a duração do tempo de imagem. Por exemplo, ao aplicar um tamanho de digitalização alto (por exemplo, 1024 x 1024 dpi), diminua o número de exames ao longo do eixo z. - Definir os parâmetros do trabalho confocal program descrito em 3.2 e começam a imagem.
- Após a imagem, combine as imagens confocal no eixo z diferente para fornecer imagens de z-pilha com ajuste focal fino em cada ponto de tempo.
- Acrescentar as imagens de z-pilha em tempo-ponto diferente e construir um filme lapso de tempo no formato AVI.
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Representative Results
A Figura 2 mostra a migração tangencial superficial visualizada em uma cultura de plano de montagem em um tempo decorrido (0, 9, 18, 27 h) após o início da gravação. Filme 1 é um filme lapso de tempo de 10 min-intervalos durante um período de 28 h e 50 min. O quadro está selecionado para enfocando as células migrando do canto inferior esquerdo etiquetado do quadro para o espaço sem rótulo (Figura 3A). O movimento em massa das células migratórias (GFP; painel esquerdo superior, filme 1) e seus núcleos (mCherry-Nuc; painel superior direito) podem ser observados com o filme mesclado (painel inferior, filme 1). Direcionalidade da migração celular pode ser examinada, centrando-se sobre as células de dispersão do centro etiquetado para todas as direções (Movie 2, Figura 3B).
As imagens claras do movimento nuclear (Movie 2; mCherry-Nuc, painel direito) nos permite traçar a migração de células nucleares por rastreamento automático usando um rastreador de partícula plugin10 de uma aplicação do ImageJ11 de processamento de imagem de Fiji (Filme 3, Figura 3B). Mudanças temporais das trajectórias da migração tangencial podem ser visualizadas para provar a migração dispersão em omni-direções.
Comportamento de células individuais com a alteração morfológica sequencial do processo principal, à direita de processo e núcleos pode manifestar-se com imagens de alta ampliação de 5 min-intervalos (Movie 4, Figura 3).
Um outro tipo de migração tangencial em camadas intermédias7 pode ser visualizado utilizando um protocolo semelhante (filme 5, Figura 3D). Bidirecional de migração linear ao longo do fascículo axônio executando dorsal para ventral (de cima para baixo) é evidente7.
Figura 1. Carta de fluxo do protocolo. Etapa 1: eletroporação no ovo. Passo 2: Colocar tectal tecido para que o lado da pia é anexado para a inserção. Etapa 3: Microscópio fluorescente invertido com unidade de laser confocal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Visualização de migração tangencial superficial na cultura do plano de montagem. As células migratórias tangencialmente (GFP; painel superior) e o núcleo (mCherry-Nuc; painel inferior) nas camadas superficiais do tectum óptica são mostrados em 0, 9, 18, 27 h após o início da cultura de E7.0. As células no canto inferior esquerdo do quadro são rotuladas em 0 h (ver Figura 3A). Barra de escala: 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A figura esquemática ilustra as condições de montagem para a imagem latente de lapso de tempo. A forma da rotulagem fluorescente (verde), direção inicial de migração celular (magenta) e o quadro de vídeo (quadrado preto) foram ilustrados com ampliação da lente objetiva (obj) e zoom digital (zoom) no campo superior, com dia de eletroporação (EP ) e início da cultura (cultura), no campo inferior. (A) filme 1, (B) filme 2 e 3, (C) filme 4, (D) filme 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme de 1. Visualização de migração tangencial superficial em uma cultura de montagem plana. Movimento de células tangencialmente migrando (GFP; painel esquerdo superior) e seus núcleos (mCherry-Nuc; painel superior direito) nas camadas superficiais do tectum óptica depois do aparecimento da cultura de E7.0. A imagem resultante é mostrada no painel inferior. As células no canto inferior esquerdo do quadro são rotuladas às 0h (ver Figura 3A), e as imagens de lapso de tempo foram capturadas mais 28 h e 50 min. barra de escala: 100 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. Botão direito do mouse para baixar.
Filme 2. Dispersar o movimento de células tangencialmente migrando (GFP; painel à esquerda) e seus núcleos (mCherry-Nuc; painel à direita) do centro de ambos os painéis são mostrados mais de 48 h (ver Figura 3B). Barra de escala: 100 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. Botão direito do mouse para baixar.
Filme de 3. Trajetórias de migração tangencial. Deslocamento do núcleo da célula (o painel direito do filme 2) foi rastreado para visualizar a trajetória da migração tangencial. Barra de escala; 100 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. Botão direito do mouse para baixar.
Filme 4. Comportamento de células individuais em maior ampliação. Movimento de células individuais (GFP; painel à esquerda) e seus núcleos (mCherry-Nuc; painel direito) são mostrados em maior ampliação superior a 24 h (ver Figura 3). Processo de ramificação do processo principal pode ser reconhecido. Barra de escala: 100 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. Botão direito do mouse para baixar.
Filme de 5. Migração da camada média. Movimento de células tangencialmente migrando (GFP; painel à esquerda) e seu núcleo (mCherry-Nuc; painel direito) nas camadas médios tectal são mostrados mais de 24 h após o início da cultura de E6.0 (ver Figura 3D). Migração linear ao longo do eixo dorso-ventral (de cima para baixo) é notável. Barra de escala: 100 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. Botão direito do mouse para baixar.
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Discussion
O protocolo descrito acima é otimizado para a detecção de migração celular em camadas superficiais6,8. É aplicável para a detecção de camada média migração córregos (filme 5),6,7, só pelo momento da eletroporação (5.5 a e 4.5) e o início da cultura de movimento e imagem (E7.0 a E6.0).
O procedimento apresentado é composto de células rotulagem por eletroporação em ovo, cultura do plano de montagem e imagem latente confocal de lapso de tempo (Figura 1). Primeiro de tudo, é um pré-requisito para que as condições de cultura devem ser otimizadas para manter o tecido saudável e crescendo normalmente como in vivo. Também é fundamental garantir que a orientação do tecido é adequada para a detecção de migração celular. Para tais fins, aplicamos uma cultura de montagem fixa na inserção de célula, o que facilita a observação de dispersão horizontal de célula e fornece meio rico com oxigênio elevado. Depois de garantir a condição de cultura e orientação, é fundamental para a visualização ajustar as condições conflitantes de rotulagem melhor fluorescente com o menos eletrônicos e fotografia danos. Para a melhor rotulagem, podemos escolher um vetor de expressão com um promotor eficiente e electroporate concentrada de DNA. Para atingir o menor dano, é importante moderar a condição elétrica da eletroporação, reduzir a concentração de DNA e minimizar o tempo total de irradiação do laser.
Uma vantagem deste protocolo usando a cultura do plano de montagem na inserção da célula é que nós podemos observar a migração celular tangencial a longo prazo. Geralmente, é difícil determinar quanto tempo o tecido na cultura mantém as condições fisiológicas em comparação com o que no ovo. No mínimo, superficial migração tangencial continua mais 72 h após o início da cultura em E7.0, que mostra a dispersão normal de celular semelhante ao que no ovo8. Além disso, tecido fresco é preparado no início da cultura e da imagem latente para observar a migração em etapas posteriores. Também é vantajoso que o deslocamento da célula pode ser seguido durante um longo período porque as células continuam se movendo horizontalmente nas folhas planas superficiais do tectum, que fica perto da lente objetiva. Usar o sistema confocal também facilita o rastreamento pilha movimento ao longo do eixo z. Por outro lado, uma desvantagem deste método é que a cultura do plano de montagem não pode sempre ser relevante para recapitular a outros tipos de migração, como a migração radial. Quando o método é aplicado para observar a migração radial na tectal fatia na pastilha, a espessura do tecido tectal não aumenta mais rapidamente como que no ovo. O método de cultura de fatia no gel de colágeno pode ser melhor para recapitular tal desenvolvimento de camada.
Desde que o nosso método permite a observação do movimento horizontal paralela à inserção da cultura, potencialmente pode ser aplicada para a detecção de mudança sequencial da fluorescente-etiquetadas microestrutura, incluindo o alongamento axonal no tecido neural ou deslocamento da célula no tecido não-neurais. Por exemplo, após a rotulagem commissural axônios no tubo neural em desenvolvimento por eletroporação, movimentos de axônios pré e pós-travessia sobre a placa de piso podem ser visualizados na cultura de livro aberto incisão da placa do telhado. Desde que a condição de cultura apropriado na inserção da célula está disponível para a reprodução de condições na vivo , nosso método fornece uma técnica eficiente para visualizar movimentos horizontais de vários tipos de células e estruturas.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo número de concessão de KAKENHI JSPS 15K 06740 para Y.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
