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Suivi à long terme de vidéo d’animaux aquatiques Cohoused : une étude de cas de l’activité locomotrice quotidienne de la langoustine (Nephrops norvegicus)

Published: April 8, 2019 doi: 10.3791/58515
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1, 2
1Universitat Oberta de Catalunya, 2Institute of Marine Sciences, Spanish National Research Council (CSIC), 3Institute for Environmental Protection and Research (ISPRA), 4Department of Biology and Ecology of Fishes, Leibniz-Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici un protocole afin de suivre individuellement les animaux sur une longue période de temps. Il utilise la vision par ordinateur pour identifier un ensemble de balises construits manuellement en utilisant un groupe de homards comme étude de cas, en fournissant des informations sur la façon de la maison, manipuler et marque les homards.

Abstract

Nous présentons un protocole associé à une technique de repérage vidéo basée sur la soustraction de l’arrière-plan et le seuillage d’image qui permet de suivre individuellement les animaux cohoused. Nous avons testé la suivi de routine avec quatre cohoused aux langoustines (Nephrops norvegicus) dans des conditions de lumière-obscurité pendant 5 jours. Les homards ont été étiquetés individuellement. Le montage expérimental et les techniques de suivi utilisées sont entièrement basés sur le logiciel open source. La comparaison de la sortie de suivi à une détection manuelle indique que les homards ont été correctement détecté 69 % du temps. Parmi les homards correctement détectés, leurs balises individuelles ont été correctement identifiés 89,5 % du temps. Compte tenu de la fréquence d’images utilisées dans le protocole et le taux de mouvement de homards, la performance de la vidéo suivi a une bonne qualité et les résultats représentatifs confirment la validité du protocole en produisant des données précieuses pour les besoins de la recherche (individuel occupation de l’espace ou les patterns d’activité locomotrice). Le protocole présenté ici peut être facilement personnalisé et est, par conséquent, transférable à d’autres espèces où le suivi individuel des spécimens dans un groupe peut être utile pour répondre aux questions de recherche.

Introduction

Dans ces dernières années, suivi automatisé en fonction image a fourni des ensembles de données très précis qui peut être utilisé pour explorer les questions de base en écologie et comportement des disciplines1. Ces ensembles de données peuvent être utilisés pour l’analyse quantitative du comportement animal2,3. Cependant, chaque méthode d’image utilisé pour le suivi des animaux et l’évaluation du comportement a ses forces et ses limites. Dans les protocoles de suivi basé sur l’image qui utilisent l’information spatiale des images précédentes dans un film pour suivre les animaux4,5,6, les erreurs peuvent être introduits quand les chemins des deux animaux se croisent. Ces erreurs sont généralement irréversibles et se propagent à travers le temps. Malgré les progrès informatiques qui réduisent ou éliminent presque ce problème5,7, ces techniques encore besoin des environnements expérimentaux homogènes pour le repérage et l’identification précise des animaux.

L’emploi de marques qui peuvent être identifiés de façon unique chez les animaux permet d’éviter ces erreurs et permet le suivi à long terme des individus identifiés. Les marqueurs largement utilisés (par exemple, des codes à barres et codes QR) existent dans l’industrie et du commerce et peuvent être identifiés à l’aide de techniques de vision d’ordinateur bien connus, tels qu’augmentée réalité (p. ex., Artocès8) et la calibration de la caméra (par exemple, CALTag9 ). Tagged animaux avaient déjà été utilisés pour le haut débit des études comportementales chez différentes espèces animales, pour exemple, les fourmis3 ou abeilles10, mais certains de ces systèmes précédents ne sont pas optimisés pour reconnaître les balises isolé3.

Le protocole de suivi présenté dans cet article est particulièrement adapté pour le suivi des animaux dans l’imagerie d’un canal, tels que l’infrarouge (IR) lumière ou lumière monochromatique (en particulier, nous utilisons la lumière bleue). Par conséquent, la méthode mise au point n’utilise pas de repères de couleur, étant également applicable à d’autres environnements où il y a des contraintes à l’illumination. En outre, nous utilisons des balises personnalisées conçues pour ne pas à déranger les homards et, en même temps, permettent l’enregistrement avec les appareils de faible coût. En outre, la méthode utilisée ici est issue de détection étiquette indépendante du châssis (i.e., l’algorithme reconnaît la présence de chaque balise de l’image quel que soit les trajectoires précédentes). Cette fonctionnalité est pertinente dans les applications où animaux peut être temporairement bloqué, ou les trajectoires des animaux peuvent se croisent.

Dessin de l’étiquette permet son utilisation dans différents groupes d’animaux. Une fois définis les paramètres de la méthode, il pourrait être transféré pour s’attaquer aux autres problèmes de suivi des animaux sans la nécessité pour la formation d’un classifieur spécifique (autres crustacés et gastéropodes). Les principales limites de l’exportation du protocole sont de la taille de l’étiquette et le besoin d’attachement à l’animal (qui en fait ne convient pas aux petits insectes, mouches, abeilles, etc.) et l’hypothèse 2D pour le transport d’animaux. Cette contrainte est importante, étant donné que la méthode proposée suppose que la taille de l’étiquette reste constante. Un animal se déplaçant librement dans un environnement 3D (p. ex., poissons) montrerait tailles autre balise en fonction de sa distance à la caméra.

Le but du présent protocole est de fournir une méthodologie facile à utiliser pour le suivi de plusieurs animaux marqués sur une longue période de temps (jours ou semaines) dans un contexte 2D. L’approche méthodologique repose sur l’utilisation du matériel et des logiciels open source. Logiciel gratuit et open source permet des adaptations, modifications et libre redistribution ; par conséquent, le logiciel généré s’améliore à chaque étape11,12.

Le protocole présenté ici se concentre sur un laboratoire mis en place pour suivre et évaluer l’activité locomotrice des quatre animaux aquatiques dans un réservoir pendant 5 jours. Les fichiers vidéo sont enregistrées à partir d’une image de time-lapse s 1 et compilés en une vidéo à 20 images par seconde (1 jour enregistré occupe environ 1 h de vidéo). Tous les enregistrements vidéo sont automatiquement retouche pour obtenir les positions animales, appliquant des algorithmes et des m├⌐thodes de vision informatique. Le protocole permet d’obtenir de grandes quantités de données, évitant leur annotation manuelle, qui s’est avérée être beaucoup de temps et laborieuse dans la précédente experimental papers13de suivi.

Nous utilisons la langoustine (Nephrops norvegicus) pour l’étude de cas ; ainsi, nous offrons des conditions de laboratoire spécifiques à leur maintien. Homards effectuent des rythmes d’émergence de terrier bien étudiés qui sont sous le contrôle de l’horloge circadienne14,15, et quand cohoused, ils forment la hiérarchie de dominance16,17. Par conséquent, le modèle présenté ici est un bon exemple pour les chercheurs intéressés par la modulation sociale du comportement avec un accent particulier sur les rythmes circadiens.

La méthodologie présentée ici est reproduite facilement et peut être appliquée à d’autres espèces, si il est possible de distinguer les animaux avec des balises individuelles. Les exigences minimales pour la reproduction d’une telle approche en laboratoire sont : (i) les chambres isothermes pour le montage expérimental ; (ii) un apport continu de l’eau ; (iii) mécanismes de contrôle de température de l’eau ; (iv) un système de contrôle de la lumière ; (v) une caméra USB et un ordinateur standard.

Dans ce protocole, nous utilisons Python18 et OpenCV19 (Open Source Computer Vision Library). Nous nous appuyons sur les opérations rapides et communément appliquées (à la fois en termes de mise en œuvre et exécution), tels que le fond soustraction20 et image seuillage21,22.

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Protocol

Les espèces utilisées dans cette étude ne sont pas une espèce en voie de disparition ou protégée. Les expériences de laboratoire et d’échantillonnage suivi de la législation espagnole et des règlements (ICM-CSIC) institutionnels internes concernant le bien-être des animaux. Animaux échantillonnage a été réalisé avec l’autorisation de l’autorité locale (gouvernement régional de Catalogne).

1. l’échantillonnage et l’entretien animaux

Remarque : Le protocole suivant est basé sur l’hypothèse que les chercheurs pourront savourer norvegicus N. dans le domaine pendant la nuit pour éviter d’endommager les photorécepteurs23. Exposition de N. norvegicus au soleil doit être évitée. Après le prélèvement, les homards sont censés être logé dans un centre d’acclimatation semblable à celui signalé auparavant17,24, avec un débit continu d’eau de mer réfrigérée (13 ° C). Les animaux utilisés dans la présente étude sont des hommes à l’état intermue avec une longueur céphalothorax (CL ; moyenne ± écart type) de 43,92 ± 2,08 mm (N = 4).

  1. Maintenir les individus dans des compartiments isolés pour éviter tout dommage dû à des combats individuels (voir Figure 1 a-d).
  2. Nourrissez-les environ 3 x par semaine à des moments aléatoires ne pas interférer avec les rythmes circadiens.
    Remarque : Dans cette expérience, les moules (environ 4 g par homard) ont été utilisés comme nourriture. Les moules ont été achetés auprès de fournisseurs d’aliments surgelés et sont prêtaient à la consommation humaine.
  3. Lumière bleue (425-515 nm) permet de simuler des heures de lumière selon la sensibilité spectrale de l' espèce25 et les conditions environnementales à 400 m de profondeur26 (voir Figure 1 c,d).
    Remarque : L’installation utilisée ici a un plafond vertical de deux bleues (478 nm) des lampes fluorescentes qui produit une intensité lumineuse de 12 Lux à 1 m de distance entre les lampes. Voir Figure 1 a pour position des plafonniers et la Table des matières pour les caractéristiques techniques des lampes et du fabricant.
  4. Ajustez la photopériode de fonds pour l’acclimatation à 12/12 heures de lumière/obscurité ou simuler la photopériode naturelle de la latitude locale.
  5. Réguler la température de l’installation à 13 ° C et surveiller 2 fois par jour pour vérifier la température de l’eau de mer affluant est d’environ 13 ° C (voir Figure 1e).
  6. Réguler l’afflux d’eau de mer à un rythme d’environ 4 L/min pour maintenir la bonne oxygénation.
    Remarque : L’eau de mer circule dans un circuit ouvert (aucun filtres et pompes supplémentaires ne sont utilisés). L’approvisionnement en eau dépend des services de plante aquarium principal.

Figure 1
Figure 1 : Vues d’acclimatation installation. (un) étagères de réservoir. (a1) Entrée eau de mer. (a2) Plafonniers fluorescents. illumination (b) détail de la lumière bleue. (c) détail de cellules animales. (d) détail d’un panneau de commande d’installation isolée. (e), à la température de réglage pour une des entrées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

2. Construction de la balise

Remarque : La balise utilisée ici peut être changée selon les caractéristiques de l’animal de destination ou d’autres considérations spécifiques.

  1. Couper quatre cercles de 40 mm de diamètre d’une feuille de plastique noire.
  2. Coupez un blanc PVC plastifié deux triangles équilatéraux avec 26 mm de côté.
  3. Coupez un blanc PVC plastifié deux cercles de 26 mm de diamètre.
  4. Marquer le centre des cercles et triangles blancs et faire un trou de 10 mm.
  5. Coller les quatre formes blanches au centre des quatre cercles noirs.

Figure 2
Figure 2 : Les quatre balises utilisées pour l’étiquetage individuel des homards. Cercle, cercle-trou, triangle, triangle-trou. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

3. expérimental

Remarque : L’arène expérimentale est censé pour être indépendant chambre expérimentale de mais à proximité immédiate de la facilité de l’acclimatation.

  1. Mettre en place une chambre expérimentale où la température de l’air peut être contrôlée et maintenue à la même température que l’eau de mer dans le domaine expérimental.
  2. Modifier un réservoir en fibre de verre (1 500 x 700 x 300 mm) pour être utilisé comme une arène expérimentale. Ajouter quatre terriers à l’aide de tuyaux souples en PVC au fond du réservoir et bâton de sable sur la surface où les homards sont censés pour déplacer (Figure 3 b-e). Pour plus de détails, voir17,27.
    1. Fournir l’arène expérimentale par des submersibles LED bleues (472 nm, simulant les heures de lumière) et LED IR (850 nm, obscurité) (voir aussi Figure 3 a)17,24.
      Remarque : Lumière de LED est utilisée en raison de son impact à basse température et la disponibilité de commande électronique utilisable et matériel libre. Une installation isolée avec une température environnementale et de l’eau de mer de 13 ± 0,5 ° C a été utilisée.
    2. Gardez toujours les LEDs IR allumé.
      Remarque : L’IR est nécessaire pour enregistrer de la vidéo dans l’obscurité et dans des conditions de lumière. Il n’est pas nécessaire pour l’éteindre.
    3. Brancher les LEDs bleues avec un appareil pour gérer la photopériode. Voir les conseils dans la Table des matièreset pour plus de détails, consulter. Sbragaglia et al. 17 (également illustré à la Figure 3 a).
      Remarque : Illumination dans les analyses vidéo ou image-automatisé est un facteur critique. Régulière éclairage sans ombres partout dans l’arène en évitant les réflexions de surface de l’eau facilite la vidéo postérieure ou l’analyse d’images. Dans le cadre du présent protocole, les conditions de lumière/obscurité seulement 12/12 ont été utilisées. Lumière et les ténèbres ont été réalisés progressivement dans les 30 minutes, et un script de lumière-contrôleur est ajouté comme supplémentaire 1 fichier.
    4. Placer la prise d’eau de mer réfrigérée à un coin de la citerne et la prise correspondante à l’angle opposé.
    5. Réglementer l’entrée de l’eau de mer à un débit de 4 L/min.
    6. Entourent le réservoir avec un rideau noir afin de fournir une isolation complète des autre lumière (Figure 3 a).
  3. Placez le trépied à laquelle la caméra web est fixée sur le côté de l’arène expérimentale et la position de la caméra vidéo ci-dessus (130 cm) et au centre de la scène expérimentale (75 cm x 32,5 cm (voir Figure 3 a).
  4. Vérifier si la caméra est dans la position centrée (reportez-vous à l’étape 3.3) pour s’assurer qu’il n'a pas été déplacé involontairement.
  5. Connectez la caméra web sur un ordinateur qui est placé à l’extérieur du rideau (Figure 3 a).
    1. Installez le logiciel pour gérer l’enregistrement time-lapse avec la caméra vidéo.
      Remarque : Time-lapse enregistrements dépendant de la vitesse du mouvement de l’espèce. En outre, voir la Table des matières pour la caméra, objectif fisheye, PC et caractéristiques de logiciels et fabricants utilisés ici.
    2. Ajustez les paramètres de la vidéo d’enregistrement selon les caractéristiques de l’espèce.
      Remarque : Étant donné le taux de mobilité du N. norvegicus, un enregistrement time-lapse de 1 s a été utilisé ici, et toutes les 24 h, la vidéo a été enregistrée.
    3. Prenez soin de créer un timestamp (y compris la date) dans la vidéo time-lapse (car cela peut aider les futures cotation manuelle du comportement).

Figure 3
Figure 3 : Montage expérimental. (un) diagramme de l’Assemblée de l’expérimental acquisition de réservoir et de la vidéo. (b) vue d’ensemble de la cuve expérimentale. (c) bas vue du réservoir expérimental, indiquant les terriers artificiels. (d) dessus vue, montrant le fond de la cuve expérimentale. (e) détail de l’une des entrées du terrier. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

4. expérimental essai et préparation animaux

Remarque : Toutes les étapes avec des animaux doivent se faire dans la facilité d’acclimatation et dans des conditions de lumière rouge selon la sensibilité spectrale de l' homard de Norvège25. Lorsque vous déplacez les animaux entre l’acclimatation et l’installation expérimentale, éviter toute exposition des homards à la lumière, à l’aide d’un sac noir opaque pour couvrir la glacière.

  1. Préparer une glacière précédemment séparé en quatre compartiments submergés avec de l’eau à environ 7 ° C.
  2. Préparer les quatre balises déjà construite et rapide de la colle, comme cyanoacrylate.
  3. Préparer un plateau de glace pilée.
  4. Sélectionnez les quatre homards d’être marqués dans la facilité d’acclimatation et de mettre chacun d'entre eux dans un compartiment de la glacière.
  5. Attendez 30 min et, ensuite, démarrez la procédure de marquage.
    1. Prenez un homard et mettre sur la glace pilée pendant 5 min immobiliser et faciliter l’opération de marquage.
    2. Sécher la partie supérieure du céphalothorax du homard avec papier adsorbant et mettre une goutte de colle rapide sur elle.
    3. Placez la balise horizontalement sur le dessus de céphalothorax de l’animal, en contact avec la colle, et attendez suffisamment de temps pour lui de durcir (pour environ 20 s).
    4. Retourner le homard dans son compartiment dans la glacière et aller de l’avant avec les trois autres animaux de la même manière.
    5. Remettre les homards dans la cellule où ils étaient auparavant et attendre 24h pour être sûr que la balise est correctement collée sur.
    6. Transférer les homards de la facilité de l’acclimatation à la chambre expérimentale à l’aide de la glacière même qui a été utilisée pour la procédure de marquage.
  6. Lancer l’enregistrement vidéo et attendre 5 min avant d’introduire les homards marqués. Obtenir une image de fond sans moyenne des 100 premiers cadres.
    Remarque : Attendre un minimum de 1 min est obligatoire pour l’obtention des trames de fond sans les homards marqués ; Ils sont nécessaires pour le traitement vidéo.
  7. Introduire les animaux un par un dans le réservoir de l’expérimentation à l’intérieur de leur logement respectif, maintenant l’eau dans celle-ci.
  8. Attendre qu’ils s’en sortir ; Si ils ne sortent pas, aidez-les doucement en inclinant le compartiment. Voir la Figure 4 exemple des animaux à l’intérieur de la citerne dans des conditions expérimentales.

Figure 4
Figure 4 : Image vidéo raw. Un exemple d’une image représentative de l’une des vidéos time-lapse recueillies au cours des expériences. Dans le coin supérieur droit, nous montrons l’horodateur avec la date, l’heure et châssis. Notez les différences dans l’illumination de réservoir dans le coin inférieur de l’image. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

5. video analyse Script

  1. Effectuer l’analyse après la fin de l’expérience.
    1. Lancer le script de vision d’ordinateur pour l’analyse vidéo.
    2. Lancer le programme Java pour calculer les positions et la distance parcourue par les homards et insérer les données dans la base de données.
      Remarque : Ce programme est un algorithme de basé sur la distance euclidienne28.
    3. Lancez le script SQL pour binning données comme intervalle de temps souhaité (ex. 10 min).

6. computer Vision Script d’analyse vidéo

Remarque : Le script évite de correction d’image fisheye parce qu’elle n’introduit pas une erreur pertinente dans le montage expérimental. Néanmoins, il est possible de corriger cela avec OpenCV caméra étalonnage fonctions29 issu des vecteurs ou matrices rotation méthodes30,31.

  1. Sélectionnez le langage de programmation Python18 .
  2. Sélectionnez l’image19 OpenCV et bibliothèque de traitement vidéo.
  3. Charger une vidéo.
    Remarque : Formats vidéo .avi ou . MP4 ont été utilisés dans cette expérience, mais ce n’est pas obligatoire. Cela dépend les FourCC32 codecs installés dans le système d’exploitation.
  4. Effectuez les opérations suivantes pour chaque trame Fi dans la vidéo.
    1. Soustraire le fond20B (moyenne des 100 dernières frames, obtenu à l’étape 4,6) de l’actuel cadre Fiet mettre à jour l’image d’arrière-plan B comme Fi. Utilisez la fonction BackgroundSubtractorMOG2 de la librairie OpenCV19 (voir les scripts dans le dossier complémentaire 2).
    2. Déterminer l’ensemble des régions d’intérêt (ROIs) R de pixels avec motion pertinente indiquées par le subtractor fond. Utilisez la méthode appliquer de BackgroundSubtractorMOG2 dans la librairie OpenCV19 (voir les scripts dans le dossier complémentaire 2). Dans l’ensemble, comprennent les détections animales de l’image précédente, afin de tenir les animaux immobile compte.
    3. Effectuez les opérations suivantes pour chaque ROI Ri
      1. Appliquer la fonction de dilater et calculer le périmètre de rayonnement33 du ROI Ri. Utilisez les fonctions se dilatent et la findContours de la librairie OpenCV19 (voir les scripts dans le dossier complémentaire 2).
      2. Calculer la coque zone34Salut dans le nombre de pixels. Utilisez la fonction convexHull de la librairie OpenCV19 (voir les scripts dans le dossier complémentaire 2).
      3. Calculer le rayon35ri de la ROI Ri. Utilisez la fonction minEnclosingCircle de la librairie OpenCV19 (voir les scripts dans le dossier complémentaire 2).
      4. Calculer la solidité tr de la ROI Ri. Solidité est le rapport entre le contour (obtenu à l’étape 6.4.3.1) à son enveloppe convexe de la Ri(obtenu à l’étape 6.4.3.2).
      5. Calculer l' allongement Ia de la ROI Ri. Aspect ratio est le rapport entre la largeur et la hauteur de la Ri-rectangle englobant. Le rectangle englobant est calculé à l’aide de la fonction boundingRect de la librairie OpenCV19 .
    4. Sélectionnez un ensemble réduit de ROIs destinée à contenir les animaux, en ajustant les propriétés pour la région de hull, rayon, solidité et rapport l / h.
      1. Vérifiez si Salut est inférieure ou supérieure à 100000.0 500,0 . Si oui, jetez le ROI Ri. Sinon, conservez la Ri comme candidat ROI pour l’emplacement de l’animal.
      2. Vérifiez si le ri est inférieure à 40,0. Si oui, jetez le ROI Ri. Sinon, conservez la Ri comme candidat ROI pour l’emplacement de l’animal.
      3. Vérifiez si le tr est inférieure à -4,0 jeter le ROI Ri. Sinon, conservez la Ri comme candidat ROI pour l’emplacement de l’animal.
      4. Vérifier si l' Ia est inférieur à 0,15 ou supérieur à 4,0. Est donc, jetez le ROI Ri. Sinon, conservez la Ri comme candidat ROI pour l’emplacement de l’animal.
        Remarque : L’utilisation des ROIs réduit les coûts informatiques, mise au point de la recherche de la balise sur la région du corps de l’animal. Animale détections d’images précédentes sont incluses afin d’éviter les mauvaises détections lorsque les animaux ne se déplacent pas.
    5. Analyser l’animal ROIs pour déterminer l’identité de la balise. Exécuter de suite d’étapes pour chaque ROI Ri et pour chaque interne du ROI Piet extrayez la ROIs interne P.
      1. Binarize l’image en niveaux de gris Pi en utilisant l’algorithme de seuillage 36 Otsu.
      2. Calculer le périmètre de rayonnement33 de Pi, comme à l’étape 6.4.3.1.
      3. Calculer la coque zone34Salut et le rapport l / h ai, tout comme aux étapes 6.4.3.2 et 6.4.3.5.
      4. Calculer les momentsde forme37,38mi de Pi. Utilisez la fonction des moments de la librairie OpenCV19 (voir les scripts dans le dossier complémentaire 2).
      5. Sélectionnez un ensemble réduit de ROIs destinée à contenir les balises, à l’aide des critères suivants.
        1. Vérifiez si Salut est inférieure ou supérieure à 500,0 150,0 . Si oui, jetez le ROI Pi. Sinon, conservez la Pi comme candidat ROI pour l’emplacement de la balise.
        2. Vérifiez si l' Ia est inférieur ou supérieur à 1,5 0,5 . Si oui, jetez le ROI Pi. Sinon, conservez la Pi comme candidat ROI pour l’emplacement de l’animal.
        3. Vérifiez si le mi est supérieure à 0,3. Si oui, jetez le ROI Pi. Sinon, conservez la Pi comme candidat ROI pour l’emplacement de l’animal.
    6. Classer la balise ROIs. Approximativement un polygone de39 à l’aide de la OpenCV19 fonction38 pour chaque sélectionné ROI Pi19.
      1. Vérifier s’il y a exactement trois sommets dans le polygone par approximation ; Assignez la balise à la classe de triangle . Sinon, assigner la classe circle à la région de la balise.
        Remarque : Polygone approchée est stockée à l’aide d’une matrice avec les sommets.
      2. Vérifier le pixel central de la ROI Pi. Si c’est un pixel noir , assignez le Pi à la classe perforé . Sinon, assignez le Pi à la classe blanche .
        Remarque : Le centre de la forme se déduit les moments calculés à l’étape 6.4.5.4. Rechercher les pixels noirs dans une zone d’un rayon de 4 pixels autour du centre.
  5. Enregistrer les données de trame : cadre date, heure de l’armature, la forme classe, x centre forme coordonnées et y centre forme.
  6. Continuer avec l’image suivante ou terminer le processus. Voir la Figure 5 ci-dessous comme un exemple visuel de la procédure de script de travail et regarder la vidéo 1 à titre d’exemple du fonctionnement du script.

Figure 5
Figure 5 : Des mesures pertinentes du script de traitement vidéo (1) évaluer la requête de soustraction de fond au-dessus de la moyenne des 100 derniers cadres. (2) résultat de l’algorithme de soustraction du fond. (3) appliquer une opération morphologiques de dilater les zones détectées au blanc. (4) appliquer difficulté, ROI statique, principal ; le polygone jaune correspond à la zone du réservoir inférieur. (5) calculer le périmètre de rayonnement pour chaque région de blanc-détectées dans le retour sur investissement principal et effectuer une analyse structurale pour chaque contour détecté. (6) vérifier les valeurs des propriétés structurelles et, ensuite, sélectionnez les candidats de retour sur investissement de second niveau. (7), Binarize l’image en utilisant un algorithme de seuillage Otsu ; le script fonctionne uniquement avec les ROIs de second niveau. (8) pour chaque binarisées ROI de second niveau, calculer le périmètre de rayonnement des régions blanches et effectuent une analyse structurale pour chaque détectée contour. (9) vérifier la propriété structurelle des valeurs et, puis sélectionne les candidats internes de ROI. (10) pour chaque contour dans le candidat interne du ROI, calculer les descripteurs/moments. (11) vérifier si les matchs forme détecté avec le modèle de forme et environ un polygone pour les meilleurs candidats de match. (12) vérifie le nombre de sommets du polygone approximatif et déterminer la figure géométrique : cercle ou triangle. (13), calculer le chiffre centre et vérifier en cas de pixels noirs ; dans l’affirmative, c’est un chiffre troué. (14) résultat visuel après analyse de l’image. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Representative Results

Nous avons construit manuellement un sous-ensemble des données expérimentales pour valider l’analyse vidéo automatisée. Un échantillon de 1 308 images avec un niveau de confiance de 99 % (ce qui est une mesure de sécurité qui montre que l’échantillon reflète fidèlement la population, sa marge d’erreur) et une marge d’erreur de 4 % (qui correspond à un pourcentage qui décrit comment fermer la réponse de l’échantillon a donné est la valeur réelle de la population) a été choisi au hasard, et une annotation manuelle de l’identification correcte des ROIs et de l’identification correcte de la balise au sein de chaque ROI a été réalisée. Notez qu’une seule image peut contenir un nombre variable de ROIs au sein d’une gamme indéterminée car certains homards peuvent être dissimulées dans les terriers ou un ROI contient deux ou plusieurs animaux ou fausses détections.

Le nombre total d’animaux dans les cadres 1 308 était 3 852 (ROIs annotés manuellement). La méthode a révélé 3 354 détections animales. Un total de 701 (21 %) ces détections étaient des faux positifs (c'est-à-dire, le nombre des ROIs où le homard a été confondu avec le fond). Le nombre total d’animaux comptés, 2 653 détections (79 %) ont été correctement correspondant (i.e., le nombre de fois le classifieur correctement reconnu la présence d’un homard dans les régions détectées ; voir aussi Figure 6 a, b). En ce qui concerne la totale 3 852 ROIs présente dans les cadres 1 308, le script détecte 69 % des individus.

Concernant la détection de la balise, le script a identifié 2 353 ROI candidats sous forme de balises (89 % des 2 653 régions détectées avec les animaux). Le classificateur identifié avec succès en tant que balise classe 1 808 de ces balises (dans laquelle le candidat est classé comme un cercle, triangle, cercle troué ou triangle troué) et raté 545 cas (23 % des 2 353 candidats ROI pour tag). Relatives à la classification de tag, 1 619 sont correctement identifiés (89,5 %, Figure 6f). Seulement 70 tags où mal classés (erreur de 3,8 %, Figure 6e) et le reste 119 (6,6 %) correspondait à des faux positifs (ROIs internes identifiées en tant que balise qui correspondent aux parties d’animaux, comme les griffes; D de la figure 6).

Figure 6
Figure 6 : Vues représentant des images montrant des situations expérimentales les plus courantes lors de l’analyse vidéo. (un) faux détection animale, une zone d’arrière-plan est détectée. (b), Animal mauvaise détection. Deux animaux est rapprochées et seul est détecté. (c), à la forme mauvaise détection. L’animal est détecté (rectangle bleu), mais la balise n’est pas détectée. détection de forme (d), à la faux. Deux formes sont détectés, et une est une griffe. (e) classification incorrecte d’une forme. Un triangle est classé comme triangle-trou. (f), Ideal situation. Tous les animaux sont détectés et les balises sont correctement identifiés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Après l’analyse de la vidéo, les données obtenues des positions (X, Y) peuvent servir à évaluer différents schémas comportementaux des homards. Par exemple, nous avons tracé une occupation de l’espace carte avec estimation de la densité du noyau bidimensionnelle un aligné sur l’axe bivarié normale du noyau, évalué sur une grille carrée41,42 avec les meilleures performances est automatisée estimée par le algorithme statistique. Un supérieur couleur intensité représente les domaines était que les homards a passé un pourcentage plus élevé de leur temps (Figure 7). Vidéo 2 donne un exemple visuel de l’animal suivi.

Un autre exemple est représenté par les rythmes de l’activité quotidienne des homards, tracé comme millimètres et couvert à intervalles de temps de 10 min mis en cellule (Figure 8). Nous avons supprimé les données correspondant à la première 24 h de l’expérience, ce qui correspond au processus d’adaptation environnementale des animaux.

Figure 7
Figure 7 : Carte d’occupation spatiale. Le graphique ne montre que la zone de réservoir bas qui est la zone de déplacement animal (voir le polygone jaune sur la Figure 6). Les zones étaient les homards tags différents passées plus de temps apparaissent colorées ; intensité de couleur plus élevée signifie plus de temps occupation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Les rythmes d’activité quotidienne des homards tracées comme millimètres et couverts à intervalles de temps de 10 min binned. Bandes grises indiquent les heures d’obsécuritéé au 12/12 lumière/obscurité, avec le temps du coucher du soleil à partir de 07:00 et la durée de l’aube à partir de 19:00 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Movie 1
Vidéo 1 : dossier bureau d’un exemple d’une analyse de la vidéo en cours d’exécution script La vidéo montre en 2 min et 27 s 1 h d’images en temps réel (3 625 images). Notez qu’il n’y a aucune accumulation d’erreur pour l’animal et la balise misdetections et des événements non identifiés, alors que l’enregistrement est effectué. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Movie 2
Vidéo 2 : vidéo de l’animal suivi après l’analyse locomotrice. Nous avons utilisé X, Y coordonnées en pixels image tirés de l’analyse vidéo et eux stockés dans la base de données, pour dessiner la piste animale dans les vidéos enregistrées à titre d’exemple du script analyse vidéo. Plus la piste, plus vite l’animal se déplace, et plus de la distance parcourue. Dans ce cas, 30 s de vidéo correspond à 12 min en temps réel. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Fichier supplémentaire 1 : S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. 

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Discussion

Les résultats de performance et représentant obtenus avec le protocole de suivi vidéo a confirmé sa validité pour la recherche appliquée dans le domaine du comportement animal, avec un accent particulier sur la modulation sociale et rythmes circadiens des animaux cohoused. L’efficacité du dépistage des animaux (69 %) et l’exactitude de la discrimination (89,5 %) de la balise couplé avec les caractéristiques comportementales (c'est-à-dire, les taux de mouvement) des espèces cibles utilisées ici suggèrent que ce protocole est une solution parfaite pour les essais expérimentaux à long terme (p. ex., des jours et des semaines). En outre, le protocole offre l’avantage de base d’être facile à utiliser et plus rapide dans son développement et personnalisation en ce qui concerne les autres techniques, telles que des algorithmes d’apprentissage automatique et neural networks43. Les techniques de suivi utilisées ici représentent le raffinement final d’une activité expérimentale a commencé avec une approche légèrement différente44.

Une étape cruciale dans le protocole est le dessin de l’étiquette ; On devrait considérer que la mise en œuvre d’autres conceptions de balise peut améliorer les performances de la binarisation d’Otsu. Par exemple, une des sources d’erreur signalé ici était la mauvaise détection entre le noir à l’extérieur du cercle dans la balise et la forme géométrique interne blanche (voir Figure 9 , avec un cadre binarisée avec un détail de cette erreur). Il est possible d’améliorer le processus de binarisation, augmentant le diamètre (2-3 mm) du cercle noir à l’extérieur de la forme géométrique interne blanche, ou en échangeant les couleurs d’étiquette (blanc/noir). Nous ne considérons pas l’utilisation de l’image des fonctions morphologiques comme éroder ou se dilater en essayant de corriger cette erreur, étant donné que ces opérations de modifier les propriétés structurales de la balise imagée, étant, par conséquent, pas possible de maintenir les valeurs de seuil de la script. En conclusion, il convient d’adapter le dessin de l’étiquette à l’anatomie des espèces animales de cible. Cela impliquerait l’ajustement des propriétés structurelles selon la nouvelle conception et les valeurs de seuil de script.

Figure 9
Figure 9 : Détail des erreurs de trame binarisation. Un cercle rouge montre comment les balises et les homards sont détectés comme un objet unique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La source la plus pertinente des erreurs a été manquée détecter la ROIs (externe et interne). Le script d’analyse vidéo présenté ici n’est pas en mesure d’assurer le suivi des personnes qui sont encore ou cachés pour une période de plus de 100 images (le nombre d’images que le script conserver comme contexte historique). Pour éviter des problèmes avec cela, nous avons stocké la dernière position d’un individu jusqu'à ce qu’il est détecté à nouveau. Ce paramètre peut influencer les résultats des disparues animaux immobiles ou cachés. Ce fait doit être pris en compte lors de l’utilisation de ce protocole avec espèces montrant des taux de mobilité différentes que celles présentées ici pour les homards. Le script de taux et d’analyse d’image vidéo devrait être modifié et adapté à l’espèce utilisée selon son comportement spécifique.

Un des principaux défis a été d’obtenir un monochrome bleu (472 nm) et infrarouge (850 nm) illumination, pour éviter les risques de dommages rétiniens et ajuster les lumière des conditions environnementales pour l’animal habitat23,45. Par conséquent, le composant de couleur dans l’enregistrement vidéo n’est pas pertinent et enregistrements vidéo ont été réalisées en niveaux de gris. Le système propose permet au programme différentes périodes de temps clair et modifie le système d’éclairage selon les caractéristiques de l’espèce cible changeant le spectre de la lumière de la LED. Une autre personnalisation à envisager dans le protocole présenté ici est le taux de mouvement de l’animal de destination. Pour ce cas précis, la fréquence d’images utilisée était de 1 image par seconde, produisant des fichiers vidéo d’environ 1 h d’enregistrement longueur correspondant à 24 h d’expérimental. Ces deux personnalisations (niveaux de gris et de la cadence) nous a permis d’obtenir des fichiers vidéo avec une taille réduite qui étaient faciles à travailler avec et réduit la capacité de stockage et de temps machine pour le suivi.

Une limitation de la méthode décrite est qu’il n’a été testé avec les espèces présentées ici ; Cependant, il ne sont a pas de raisons spécifiques concernant l’application du présent protocole à d’autres espèces qui permettent la réalisation d’étiquettes d’identification. Un autre inconvénient est que le protocole n’est pas adapté pour suivre les déplacements des animaux annexes (par exemple, des pinces). Par exemple, les crustacés décapodes utilisent mouvements de pinces pour afficher la position dominante parmi leurs congénères. Les implémentations futures visent à améliorer cet aspect.

Le protocole proposé ressemble à la précédente de logiciels commerciaux existants46 et méthodes publiées SwisTrack et idTracker7,47. Le logiciel commercial46 utilise soustraction du fond pour détecter les animaux, similaires aux scripts présentés ici. Bien qu’il couvre un plus large éventail d’applications, il est programmé à l’aide d’un programme interprété commercialement langue48, qui n’est pas une solution open source et est économiquement coûteux. La méthode de47 SwisTrack utilise la librairie OpenCV19 , similaire à l’approche présentée ici. Néanmoins, il est codé en C++. Nous avons utilisé le code Python, qui est généralement plus facile de s’adapter aux besoins particuliers de chaque environnement. IdTracker7 est une approche fortement codée dans un programme interprété commercialement langue48 mais cibles zone animaux applications. Les résultats corrects de suivi peuvent être compromises lorsque les animaux est obstrués pendant une longue période de temps qui se produit dans les conditions expérimentales présentées ici. La méthode présentée ici processus chaque trame indépendamment et n’est pas influencée par la trajectoire antérieure de l’animal. Par conséquent, une erreur dans une donnée ne se propage pas aux futurs cadres. Ce fait est pertinent dans la présente demande, mais aussi des contraintes la méthode présentée ici à un ensemble spécifique d’animaux (ceux qui permettent le marquage manuel).

Un autre aspect à considérer est que nous avons utilisé des logiciels libres lors de l’élaboration du protocole, y compris le post-traitement et le stockage des données générées par le script d’analyse vidéo, ainsi que le code utilisé pour contrôler le système d’éclairage. Les données traitées sont stockées dans un système libre de base de données relationnelle (MySQL). Ces données traitées peuvent être obtenues par le biais de requêtes en Standard Query Language (SQL) selon le format désiré. Le lecteur peut modifier et adapter le projet de code ouvert et adapter librement aux besoins particuliers.

En ce qui concerne la toxicité de la méthode, l’étape délicate seulement est le collage de l’étiquette à l’animal. Nous avons utilisé la colle cyanoacrylate en raison de sa faible toxicité et son usage médical large49sa large utilisation dans des aquariums fragging les coraux et les fragments de fixation avec colle50. La principale préoccupation quant à son utilisation est la toxicité de la vapeur pour les humains. Nous avons réduit l’exposition au minimum. La santé et Safety Executive et le National Toxicology Program des États-Unis ont conclu que l’utilisation du cyanoacrylate d’éthyle est sûr51.

Les applications futures du présent protocole sont l’automatisation de la détection d’autres comportements de terriers de crustacés (par exemple, combats, dominance de terrier). Nous prévoyons également d’améliorer l’algorithme pour obtenir une analyse vidéo en temps réel et d’utiliser Convolutional Neural Networks52 pour améliorer la détection animale.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs sont reconnaissants envers le Dr Joan B. Company qui a financé la publication de cet ouvrage. En outre, les auteurs sont reconnaissants aux techniciens de la zone d’aquarium expérimentale à l’Institut des Sciences marines à Barcelone (ICM-CSIC) pour leur aide pendant les travaux expérimentaux.

Ce travail a été soutenu par le projet RITFIM (CTM2010-16274, chercheur principal : J. Aguzzi) fondé par le ministère espagnol de la Science et l’Innovation (MICINN) et la subvention de TIN2015-66951-C2-2-R du ministère espagnol de l’économie et la compétitivité.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tripod 475 Manfrotto A0673528 Discontinued
Articulated Arm 143 Manfrotto D0057824 Discontinued
Camera USB 2.0 uEye LE iDS UI-1545LE-M https://en.ids-imaging.com/store/products/cameras/usb-2-0-cameras/ueye-le.html
Fish Eye Len C-mount f = 6 mm/F1.4 Infaimon Standard Optical  https://www.infaimon.com/es/estandar-6mm
Glass Fiber Tank 1500 x 700 x 300 mm3
Black Felt Fabric
Wood Structure Tank 5 Wood Strips 50x50x250 mm
Wood Structure Felt Fabric 10 Wood Strips 25x25x250 mm
Stainless Steel Screws As many as necessary for fix wood strips structures
PC 2-cores CPU, 4GB RAM, 1 GB Graphics, 500 GB HD
External Storage HDD 2 TB capacity desirable
iSPY Sotfware for Windows PC iSPY https://www.ispyconnect.com/download.aspx
Zoneminder Software Linux PC Zoneminder https://zoneminder.com/
OpenCV 2.4.13.6 Library OpenCV https://opencv.org/
Python 2.4 Python https://www.python.org/
Camping Icebox
Plastic Tray
Cyanocrylate Gel To glue tag’s 
1 black PVC plastic sheet (1 mm thickness) Tag's construction
1 white PVC plastic sheet (1 mm thickness) Tag's construction
4 Tag’s Ø 40 mm Maked with black & white PVC plastic sheet
3 m Blue Strid Led Ligts (480 nm) Waterproof as desirable
3 m IR Strid Led Ligts (850 nm) Waterproof as desirable
6 m  Methacrylate Pipes Ø 15 mm Enclosed Strid Led
4 PVC Elbow  45o Ø 63 mm Burrow construction
3 m Flexible PVC Pipe Ø 63 mm Burrow construction
4 PVC Screwcap Ø 63 mm Burrow construction
4 O-ring Ø 63 mm Burrow construction
4 Female PVC socket glue / thread Ø 63 mm Burrow construction
10 m DC 12V Electric Cable Light Control Mechanism
Ligt Power Supply DC 12 V 300 W Light Control Mechanism
MOSFET, RFD14N05L, N-Canal, 14 A, 50 V, 3-Pin, IPAK (TO-251) RS Components 325-7580 Light Control Mechanism
Diode, 1N4004-E3/54, 1A, 400V, DO-204AL, 2-Pines RS Components 628-9029 Light Control Mechanism
Fuse Holder RS Components 336-7851 Light Control Mechanism
2 Way Power Terminal 3.81 mm RS Components 220-4658 Light Control Mechanism
Capacitor 220 µF 200 V RS Components 440-6761 Light Control Mechanism
Resistance 2K2 7 W RS Components 485-3038 Light Control Mechanism
Fuse 6.3 x 32 mm2 3A RS Components 413-210 Light Control Mechanism
Arduino Uno Atmel Atmega 328 MCU board RS Components 715-4081 Light Control Mechanism
Prototipe Board CEM3,3 orific.,RE310S2 RS Components 728-8737 Light Control Mechanism
DC/DC converter,12 Vin,+/-5 Vout 100 mA 1 W RS Components 689-5179 Light Control Mechanism
2 SERA T8 blue moonlight fluorescent bulb 36 watts SERA Discontinued/Light isolated facility

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Environnement/développement durable numéro 146 OpenCV Python analyse vidéo occupation de l’espace tous les jours des rythmes d’activité suivi
Suivi à long terme de vidéo d’animaux aquatiques Cohoused : une étude de cas de l’activité locomotrice quotidienne de la langoustine (<em>Nephrops norvegicus</em>)
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Garcia, J. A., Sbragaglia, V.,… More

Garcia, J. A., Sbragaglia, V., Masip, D., Aguzzi, J. Long-term Video Tracking of Cohoused Aquatic Animals: A Case Study of the Daily Locomotor Activity of the Norway Lobster (Nephrops norvegicus). J. Vis. Exp. (146), e58515, doi:10.3791/58515 (2019).

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