Här beskriver vi ett protokoll för att mäta glomerulär filtrationshastighet (GFR) i medveten, fritt rörliga möss använder en transdermal GFR bildskärm.
Transdermal analys av glomerulär filtrationshastighet (GFR) är en etablerad teknik som används för att bedöma njurfunktion hos mus och råtta modeller för akut njurskada och kronisk njursjukdom. Mätsystemet består av en miniatyriserade fluorescensdetektor som är direkt ansluten till huden på baksidan av medveten, fritt rörliga djur, och mäter utsöndring kineticsen av den exogena GFR tracer, fluorescein-fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugerade sinistrin (en inulin analog). Detta system har beskrivits i detalj i råttor. Dock på grund av sin mindre storlek presenterar mätning av transkutan GFR hos möss ytterligare tekniska utmaningar. I detta dokument ger vi därför den första detaljerade praktiska guiden till användning av transdermalt GFR monitorer i möss baserat på den kombinera erfarenheten av tre olika utredare som har utfört denna analys på möss under ett antal år.
Användning av transkutan GFR monitorer i möss rapporterades först av Schreiber och kollegor i 2012 och validerades genom att jämföra GFR-mätningar som erhålls med hjälp av denna teknik, med resultat erhållna genom direkt mätning av FITC-sinistrin bolus clearance från seriell blodprov1. Hittills har 35 fackgranskade publikationer där transkutan GFR bildskärmar har använts i råttor och möss (en regelbundet uppdaterad lista över tidskriftsartiklar och conference abstracts som prekliniska GFR bildskärmen användes kan hittas på den MediBeacon webbplats (2). Transdermal GFR mätningar hos råttor och möss har beskrivits i ett antal publikationer1,3,4,5, och en video tutorial som visar dess användning i råttor har varit publicerade6. Mätning i möss presenterar emellertid ytterligare tekniska utmaningar. Här, ger vi den första detaljerade praktiska guiden till användning av transdermalt GFR monitorer i möss.
Det finns en mängd skäl varför utredare börjar att gynna användning av transdermalt GFR monitorer för att bedöma njurfunktion hos gnagare modeller. Transdermal mätning av FITC-sinistrin clearance har visat sig ge ett mer känslig och korrekt mått på njurfunktion jämfört med de traditionella parametrarna av njurfunktionen såsom serum kreatinin och blod urea kväve (BUN)7, 8. Genom att implementera en algoritm som utvärderingen förbättras, visade Friedemann och kollegor att systemet når precision jämförbara till guldmyntfoten, den konstanta infusion tekniken för GFR mätning3. Nyligen genomförda studier har också visat att sekventiell analys med transkutan GFR bildskärmar kan användas för att studera tidiga förändringar i njurfunktionen samt funktionell återhämtning efter induktion av akut njurskada (AKI) utan att störa djurens blod volym eller hemodynamik, blod eftersom analysen inte kräver sekventiella provtagning9,10. Förmågan att mäta GFR med hög precision och känslighet upprepade gånger på samma djur gör denna teknik attraktiv för en mängd olika forskningsdiscipliner. Transdermal GFR bildskärmar har använts av läkemedelsföretag för att bedöma toxiciteten av nya föreningar samt universitet för grundläggande och translationell forskning.
Detta manuskript och den medföljande träningsvideo ge praktiska riktlinjer för användning av transdermalt GFR monitorer i möss. De mest kritiska steg i förfarandet är rätt fastsättning av enheten på djurets rygg och säkert inslagning tejp runt buken. Den bästa positionen är antingen något åt vänster eller höger om mittlinjen, över bröstkorgen. Lappen och enheten måste sättas fast på huden, men de bör inte vara så snäva att de begränsar andning, rörelse, eller påverka huden blodcirkulationen under enheten, eftersom detta skulle leda till felaktig/felaktiga mätningar. Dessutom, eftersom övervakning sker i medvetna möss när de har återhämtat sig från anestesi, korrekt placering av enheten från sida kroppen med lägsta störningar från rörelse resulterar i transdermal mätningar med lite rörelse artefakter. Därför är det viktigt att enheten inte är placerad för nära övre extremiteterna så att mössen kan flytta sina axlar fritt.
Det är viktigt att depilate möss en till två dagar före GFR mätning som hårborttagning påverkar beräkningen av FITC-sinistrin clearance, med preliminära data som visar att hårborttagning omedelbart före mätning av transdermalt GFR ökar den skenbara halveringstiden av FITC-sinistrin. Mekanismen för detta är okänd. Därför, för att erhålla pålitliga mätningar över flera tidpunkter och mellan experiment, är det lämpligt att depilate möss i förväg, för att låta huden att återhämta sig från denna process innan du fortsätter med GFR-mätningar. Cellulite grädde bör inte tillämpas på samma område av huden inom 72 timmar efter en tidigare ansökan, att undvika kemiska skador på huden. I många fall päls re-tillväxt tar flera dagar eller upp till en vecka, och så re-ansökan för cellulite grädde inom 72 h lätt kan undvikas.
Eftersom upp till 50% av serum kreatinin utsöndras av tubulär avsnitt i möss13, och eftersom det finns ökad reabsorption av karbamid från njurtubuli när möss är uttorkad14, är serumkreatinin och bulle dålig markörer av njurfunktionen. Dock på grund av sin bekvämlighet fortsättningsvis dessa analyser användas som det viktigaste måttet på njurfunktion i prekliniska studier med AKI och CKD i möss. Överensstämmer med stort bidrag av tubulär sekretion till kreatinin utsöndring hos möss med normal eller nära normal njurfunktion13, serumkreatinin visade dock liten korrelation med FITC-sinistrin clearance på hög clearance priser (låg FITC-sinistrin halveringstid), vilket indikerar att kreatinin är en okänslig mått på njurfunktion hos möss med mild njurskada. Även BUN korrelerar väl med FITC-sinistrin clearance hos möss med lätt nedsatt njurfunktion, finns det däremot dålig korrelation mellan BUN och FITC-sinistrin clearance hos möss med mer allvarlig njurskada (hög FITC-sinistrin halveringstid). Detta orsakas sannolikt av effekterna av urea reabsorption förknippas med uttorkning hos sjuka djur med allvarlig njurskada.
En stor fördel med transdermal GFR mätning, jämfört med alla andra bolus clearance eller konstant infusion tekniker för mätning av GFR, är att det inte kräver noggrant tidsinställda blod- eller urinprov samlingar. Dessa kan vara särskilt utmanande i möss eftersom de har låg total blod volymer och urinproduktion jämfört med råttor. Dessutom behöver möss hanteras endast för fastsättning av enhet och injektion, men inte för flera venpunktioner, som krävs för klassiska bolus clearance experiment15. Dessutom anestesi varar kort, och som sådan är det möjligt att utföra upprepade mätningar i enskilda möss över tid. Den frekvens där mätningarna kan utföras primärt beror på hälsotillståndet hos möss, forskarens fallenhet för intravenösa injektioner och lokala institutionella bestämmelser på upprepade anestesi sessioner. På frisk, oskadad möss, kan transdermal GFR mätningar utföras dagligen, med minimala eller inga effekter på musen. Dock skadade möss lider av AKI eller CKD är osannolikt att tolerera upprepade anestesi sessioner samt friska möss, och thus frekvensen av mätningar bör minskas.
Den största begränsningen av transdermalt GFR mätning, jämfört med bolus clearance metoder att mäta GFR hos möss är att utsöndring kinetik endast mäts som förändring i relativ fluorescensintensiteten över tid, och inte som absoluta tracer koncentrationer. På grund av detta är det endast möjligt att mäta konstanten av utsöndring kinetic, som är en mycket nära uppskattning av GFR normaliserade på extracellulär volym16enda exponentiell förfall. För att uttrycka GFR i mL/min, har extracellulära volymen av djuret uppskattas med hjälp av en konverteringsfaktor som etablerades i tidigare studier där samtidiga mätningar av plasmakoncentrationerna av FITC-sinistrin utförs1. Men denna faktor kan inte korrekt uppskattning extracellulär vätska volymer lika bra i alla möss, eftersom flytande volym kan påverkas av en mängd yttre faktorer såsom ålder, kön, vätskestatus (som kan påverkas av kirurgiska interventioner samt njurskada), och vikt17. Men till skillnad från bolus dosering metod för att bedöma GFR hos möss, är transkutan GFR-mätning föremål för mindre operatörsberoende variabilitet eftersom den inte påverkas av dosering fel eller fel i timing av blod samlingar.
En annan begränsning av transkutan GFR mätning tekniken är att baslinjen signal förskjutningar kan uppstå under mätningen på grund av blekning av hud fluorophores och den anestesi krävs för enheten fastsättning och tracer injektion. Denna begränsning togs upp av Friedemann och kollegor genom att implementera en korrigering algoritm3. Genomförandet av denna algoritm som ledde till en förbättring av precisionen av transdermalt tekniken jämförbar med en konstant infusion teknik av GFR bedömning.
En vanliga fråga är huruvida hudpigmentering i olika mus stammar påverkar transdermalt FITC-sinistrin clearance. Hudens pigmentering minskar FITC-sinistrin signal intensiteten eftersom mörka pigment absorberar blå magnetiseringen och gröna utsläpp signaler från FITC-sinistrin mätningar. Men andelen utsöndring av FITC-sinistrin är oberoende av totalt signal intensiteten. Dessutom medan den uppmätta signalen är lägre, är bakgrunden signalen också lägre i pigmenterad möss. Eftersom bakgrunden signalen är en blandning av autofluorescens av hud fluorophores och reflektion av magnetiseringen ljuset, har vi funnit att bakgrunden till-högsta-signal förhållandet är jämförbara, eller ännu bättre, i pigmenterad djur. Dessutom rörelse artefakter, som orsakas av den omgivande huden exponeras för reflekterat ljus, reduceras i pigmenterad möss eftersom det reflekterade ljuset absorberas också av pigmenterad hud.
Sammanfattningsvis kan den teknik som vi har lagt fram exakt mätning av GFR i medveten, fritt rörliga möss för alla hudtyper. Eftersom tekniken är oberoende av blodprovstagning, kan det användas flera gånger på samma djur för longitudinella observationer i CKD modeller samt för mätning av snabba förändringar av GFR som inträffar efter induktion av AKI.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av Vanderbilt Center för njur sjukdom (VCKD) och finansierades delvis av de följande bidrag: DOD PR161028 och R01DK112688 (Mark de Caestecker)
Vi erkänner stöd till LS, PM och BW av MRC, EPSRC och BBSRC-finansierade UK regenerativ medicin plattform ”säkerhet och effekt, fokusering på Imaging teknik Hub” (herr/K026739/1).
Transdermal GFR monitor (comes with 1 device, 2 batteries and 1 charger) | MediBeacon GmbH | TDM-MH001 | Reading software: MPD Lab; Analysis software: MPD Studio |
Additional Batteries | MediBeacon GmBH | PWR-BT0001 | |
Attachment patches | MediBeacon GmbH | small: PTC-SM001; large: PTC-LG001 | |
FITC-sinistrin | MediBeacon GmbH | FTC-FS001 | |
Hypoallergenic silk tape | e.g. Durapore (1538-2), or Kendall (7138C), or Leukosilk (01032-00) | ||
Anaesthesia chamber, isoflurane, oxygen | |||
Heat pad | |||
Electric shaver | |||
Depilatory (hair removal) cream | e.g. Veet or Nair | ||
Cotton buds | |||
Cotton swabs | |||
Timer | |||
Scales | |||
70% ethanol wipes |