Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de glomerulaire filtratie snelheid (GFR) in bewuste, vrij bewegende muizen met behulp van een monitor transdermaal GFR.
Transdermaal analyse van glomerulaire filtratie snelheid (GFR) is een gevestigde techniek die wordt gebruikt ter beoordeling van de nierfunctie in muis en rat modellen van acute nier letsel en chronische nierziekte. Het meetsysteem bestaat uit een verkleinde fluorescentiedetector die direct is aangesloten op de huid op de rug van bewuste, vrij bewegende dieren, en meet de kinetiek van de uitscheiding van de exogene GFR tracer, fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd sinistrin (een inuline analoge). Dit systeem heeft zijn in detail beschreven in ratten. Meting van de transcutane GFR in muizen kampt echter wegens hun kleiner grootte, extra technische uitdagingen. In dit document bieden we daarom de eerste gedetailleerde praktische gids voor het gebruik van transdermale GFR monitoren in muizen op basis van de gecombineerde ervaring van drie verschillende onderzoekers die deze test in muizen hebben presteert gedurende een aantal jaren.
Het gebruik van transkutane GFR monitoren in muizen werd voor het eerst gemeld door Schreiber en collega’s in 2012 en werd gevalideerd door het vergelijken van de GFR metingen verkregen met behulp van deze techniek, met resultaten verkregen door rechtstreekse meting van de FITC-sinistrin bolus goedkeuring van seriële bloed monsters1. Tot op heden zijn er 35 collegiaal getoetste publicaties waarin transkutane GFR monitoren hebben gebruikt bij ratten en muizen (een regelmatig bijgewerkte lijst van artikelen en samenvattingen van de conferentie waarin de preklinische GFR-monitor werd gebruikt kan worden gevonden op de MediBeacon website2). Transdermaal GFR metingen bij ratten en muizen is beschreven in een aantal publicaties1,,3,,4,5is, en een video tutorial te tonen het gebruik ervan in ratten gepubliceerd6. Meting in muizen kampt echter met extra technische uitdagingen. Wij bieden hier, de eerste gedetailleerde praktische gids voor het gebruik van transdermale GFR monitoren in muizen.
Er zijn een aantal redenen waarom onderzoekers beginnen om de gunst van het gebruik van transdermale GFR monitoren te beoordelen van de nierfunctie in knaagdier modellen. Transdermaal meting van FITC-sinistrin klaring is aangetoond dat een meer gevoelige en nauwkeurige maat voor nierfunctie in vergelijking met de traditionele parameters van de nierfunctie zoals serum creatinine en bloed ureum stikstof (broodje)7, opleveren 8. Door de uitvoering van een betere evaluatie algoritme, Friedemann en collega’s aangetoond dat het systeem precisie vergelijkbaar met de gouden standaard, de constante infusie techniek voor GFR meting3bereikt. Recente studies hebben ook aangetoond dat sequentiële analyse transkutane GFR monitoren gebruikt kan worden gebruikt om te studeren vroeg wijzigingen in zowel de nierfunctie als de functionele herstel na inductie van acute nier schade (AKI) zonder zich te mengen met de dieren bloed volume of hemodynamica, bloed aangezien de bepaling vereist geen sequentiële bemonstering9,10. De mogelijkheid voor het meten van de GFR met hoge precisie en gevoeligheid herhaaldelijk in hetzelfde dier maakt deze techniek aantrekkelijk voor een verscheidenheid van verschillende onderzoeksdisciplines. Transdermaal GFR monitoren zijn door farmaceutische bedrijven gebruikt om te beoordelen van de toxiciteit van nieuwe verbindingen, evenals in de universiteiten voor fundamenteel en translationeel onderzoek.
Dit manuscript en de begeleidende trainingsvideo bieden praktische richtsnoeren voor het gebruik van transdermale GFR monitoren in muizen. De belangrijkste stappen in de procedure zijn de juiste bevestiging van het apparaat op het dier de rug, en veilig verpakken van de tape rond de buik. De beste positie is enigszins links of rechts op de middellijn, over de ribbenkast. De patch en apparaat moeten stevig worden bevestigd op de huid, maar ze moeten niet zo strak dat ze ademhaling beperken, beweging, of invloed op de doorbloeding van de huid onder het apparaat, omdat dit tot defect/onnauwkeurige metingen leiden zou. Bovendien, aangezien toezicht in bewuste muizen gebeurt nadat ze zijn hersteld van anesthesie, corrigeren plaatsing van het apparaat van de kant van het lichaam met laagste interferentie van verkeer resultaten in transdermaal metingen met weinig bewegingsartefacten. Om deze reden is het belangrijk dat het apparaat niet wordt gebracht te dicht bij de bovenste ledematen zodat de muizen hun schouders zich vrij kunnen bewegen.
Het is belangrijk om het ontharen van de muizen één tot twee dagen vóór de meting van de GFR, zoals ontharing is van invloed op de meting van de FITC-sinistrin van mijnen, met voorlopige gegevens waaruit blijkt dat ontharing onmiddellijk vóór de meting van transdermale GFR verhoogt de schijnbare halfwaardetijd van FITC-sinistrin. Het mechanisme hiervoor is onbekend. Daarom, om betrouwbare metingen over meerdere tijdstippen en tussen experimenten, is het raadzaam om te ontharen van de muizen op voorhand, zodat de huid om te herstellen van dit proces voordat u verdergaat met metingen van de GFR. Ontharing crème moet niet worden toegepast op het zelfde gebied van huid binnen 72 uur van een voorafgaande aanvraag om chemische schade aan de huid te voorkomen. In veel gevallen, de uitgroei van bont duurt verschillende dagen of tot een week, en dus opnieuw toepassing van ontharing crème binnen 72 h gemakkelijk vermeden worden.
Omdat omhoog tot 50% van het serum creatinine wordt uitgescheiden door het buisvormige gedeelte in muizen13, en omdat er is toegenomen reabsorptie van ureum uit de renale tubuli wanneer muizen zijn uitgedroogd14, zijn serum creatinine en BUN slechte markeringen van de nierfunctie. Echter, vanwege hun gemak blijven deze testen worden gebruikt als de belangrijkste maatregel van de nierfunctie in preklinische studies van AKI en CKD in muizen. Echter in overeenstemming met de belangrijke bijdrage van tubulaire secretie aan uitscheiding van creatinine in muizen met normale of bijna normale nierfunctie13, serum creatinine toonde weinig correlatie met FITC-sinistrin goedkeuring op hoge klaring tarieven (lage Half-life FITC-sinistrin), die aangeeft dat creatinine is een ongevoelig maat voor nierfunctie in muizen met milde nier schade. In tegenstelling, terwijl BUN goed met FITC-sinistrin mijnen in muizen met milde nierfunctiestoornis correleert, is er slechte correlatie tussen BUN en FITC-sinistrin mijnen in muizen met meer ernstige nier schade (hoge FITC-sinistrin half-life). Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door de effecten van ureum reabsorptie uitdroging in zieke dieren met ernstige nier schade is gekoppeld.
Een groot voordeel van de transdermale GFR meting, in vergelijking met alle andere bolus goedkeuring of constante infusie technieken voor de meting van de GFR, is dat het niet nodig zorgvuldig getimede bloed- of urinetests collecties. Deze kunnen bijzonder uitdagende in muizen zijn zoals ze lage totale bloed volumes en urine uitvoer ten opzichte van de ratten hebben. Bovendien, muizen moeten worden behandeld, alleen voor de bevestiging van het apparaat en de injectie, maar niet voor meerdere venipunctures, zoals vereist voor klassieke bolus klaring experimenten15. Bovendien, de duur van de verdoving is kort, en als zodanig is het mogelijk metingen uit te voeren herhaaldelijk in individuele muizen na verloop van tijd. De frequentie waarmee voornamelijk metingenmogen hangt af van de gezondheidsstatus van de muizen, de onderzoeker van aptitude voor intraveneuze injecties en lokale institutionele regelingen op herhaalde verdoving sessies. In gezond, ongedeerd muizen, transdermaal GFR metingenmogen dagelijks, met minimale of geen nadelige effecten op de muis. Echter gewonde muizen die lijden aan AKI of Cementovenstof zijn onwaarschijnlijk te tolereren herhaalde verdoving sessies evenals de gezonde muizen, en dus de frequentie van de metingen moet worden verlaagd.
De belangrijkste beperking van transdermale GFR meting, ten opzichte van de bolus klaring methoden voor het meten van de GFR in muizen is dat de uitscheiding kinetiek alleen als de verandering in intensiteit van de relatieve fluorescentie na verloop van tijd, en niet als absolute tracer concentraties worden gemeten. Vanwege dit is het alleen mogelijk om te meten de constante tarief van de enkele exponentiële afname van de uitscheiding kinetische, dat een zeer nauwe schatting van de GFR genormaliseerd op extracellulaire volume16 is. Als u GFR uitdrukken in mL/min., heeft het extracellulaire volume van het dier worden geraamd met behulp van een conversiefactor die werd opgericht in voorafgaande studies waarin gelijktijdige metingen van de plasmaconcentraties van FITC-sinistrin werden uitgevoerd1. Echter, deze conversiefactor kunnen niet correct inschatten extracellulaire vloeistof volumes even goed in alle muizen, omdat vloeibare volume kan worden beïnvloed door een aantal externe factoren, met inbegrip van leeftijd, geslacht, hydratatie status (die kan worden beïnvloed door de chirurgische interventies evenals nier schade), en het gewicht van17. Echter, in tegenstelling tot de bolus toediening methode voor de beoordeling van de GFR in muizen, transcutane GFR meting is onderworpen aan minder variabiliteit van de exploitant-afhankelijke als het niet wordt beïnvloed door de dosering fouten of fouten in timing van bloed collecties.
Een andere beperking van de transcutane meettechniek van GFR is dat basislijn signaal verschuivingen kunnen optreden in de loop van de meting te wijten aan het bleken van de huid fluorophores en de narcose voor apparaat gehechtheid en tracer injectie nodig. Deze beperking werd aangepakt door Friedemann en collega’s door de uitvoering van een correctie algoritme3. De implementatie van dit algoritme leidden tot een verbetering van de precisie van de transdermale techniek vergelijkbaar met de techniek van een constante infusie van GFR beoordeling.
Een vaak gestelde vraag is of huidpigmentatie in verschillende muis stammen de transdermale FITC-sinistrin klaring treft. Huidpigmentatie vermindert de FITC-sinistrin signaal intensiteit aangezien donkere pigmenten absorbeert de excitatie van de blauwe en de groene emissie signalen uit metingen van de FITC-sinistrin. Echter de uitscheiding van FITC-sinistrin is onafhankelijk van de totale signaal intensiteit. Bovendien, terwijl de gemeten signaal lager is, het signaal van de achtergrond is ook lager in gepigmenteerde muizen. Omdat het signaal van de achtergrond een mengsel van autofluorescence van huid fluorophores en reflectie van het licht excitatie is, hebben we ontdekt dat de achtergrond-aan-maximale signaalverhouding vergelijkbare of zelfs betere, in gepigmenteerde dieren. Bovendien bewegingsartefacten, die worden veroorzaakt door blootstelling van de omliggende huid te licht gereflecteerd, in gepigmenteerde muizen zijn verlaagd, aangezien het gereflecteerde licht wordt ook geabsorbeerd door gepigmenteerde huid.
Kortom, kan de techniek die wij hebben ingediend nauwkeurige meting van de GFR in bewuste, vrij bewegende muizen voor alle huidtypes. Als de techniek onafhankelijk van bloedmonsters is, kan het worden gebruikt herhaaldelijk op hetzelfde dier voor longitudinale waarnemingen in CKD modellen, evenals voor het meten van de snelle veranderingen van GFR die na de inductie van AKI optreden.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de Vanderbilt-Center voor de ziekte van de nieren (VCKD), en werd gedeeltelijk gefinancierd door de volgende subsidies: DOD PR161028 en R01DK112688 (Mark de Caestecker)
Wij erkennen steun aan LS, PM en BW door het MRC, EPSRC en BBSRC-gefinancierde UK regeneratieve geneeskunde Platform “Veiligheid en werkzaamheid, scherpstellen op Imaging technologieën Hub” (heer/K026739/1).
Transdermal GFR monitor (comes with 1 device, 2 batteries and 1 charger) | MediBeacon GmbH | TDM-MH001 | Reading software: MPD Lab; Analysis software: MPD Studio |
Additional Batteries | MediBeacon GmBH | PWR-BT0001 | |
Attachment patches | MediBeacon GmbH | small: PTC-SM001; large: PTC-LG001 | |
FITC-sinistrin | MediBeacon GmbH | FTC-FS001 | |
Hypoallergenic silk tape | e.g. Durapore (1538-2), or Kendall (7138C), or Leukosilk (01032-00) | ||
Anaesthesia chamber, isoflurane, oxygen | |||
Heat pad | |||
Electric shaver | |||
Depilatory (hair removal) cream | e.g. Veet or Nair | ||
Cotton buds | |||
Cotton swabs | |||
Timer | |||
Scales | |||
70% ethanol wipes |