Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) in dem Bewusstsein, frei beweglichen Mäuse mit einem transdermalen GFR Monitor.
Transdermale Analyse der glomerulären Filtrationsrate (GFR) ist eine etablierte Methode, die verwendet wird, um die Nierenfunktion bei Maus und Ratte Modelle des akuten Nierenversagens Verletzungen und chronischen Nierenerkrankung zu beurteilen. Das Messsystem besteht aus einem miniaturisierten Fluoreszenz-Detektor, der direkt auf der Haut auf der Rückseite des bewussten, frei beweglichen Tieren befestigt, und misst die Ausscheidung Kinetik der exogenen GFR Tracer, Fluorescein-Herstellung (FITC) Konjugierte Sinistrin (eine analoge Inulin). Dieses System wurde in Ratten ausführlich beschrieben. Messung der Transkutane GFR bei Mäusen stellt jedoch aufgrund ihrer geringeren Größe, weitere technische Herausforderungen. In diesem Papier stellen wir daher die erste detaillierte praktische Leitfaden für die Verwendung der transdermalen GFR Monitore bei Mäusen, die basierend auf der Erfahrung von drei verschiedenen Forschern, die dieser Assay über etliche Jahre bei Mäusen durchgeführt haben.
Die Verwendung von Transkutane Monitore bei Mäusen wurde erstmals im Jahr 2012 von Schreiber und Kollegen berichtet und wurde durch den Vergleich der GFR Messungen mit dieser Technik validiert GFR mit erhaltenen Ergebnisse durch direkte Messung der FITC-Sinistrin Bolus Abstand serielle Blutproben1. Bisher wurden 35 Peer-reviewed Publikationen in die Transkutane GFR Monitore bei Ratten und Mäusen benutzt worden (eine regelmäßig aktualisierte Liste der Zeitschriftenartikel und Conference Abstracts in der präklinische GFR-Monitor verwendet wurde finden Sie unter der MediBeacon Website (2). Transdermale GFR Messungen bei Ratten und Mäusen ist beschrieben worden, in einer Reihe von Publikationen1,3,4,5, und ein video-Tutorial zeigt seine Verwendung bei Ratten wurde veröffentlicht6. Messung bei Mäusen stellt jedoch zusätzliche technische Herausforderungen. Hier bieten wir die erste detaillierte praktische Anleitung zur Nutzung der transdermalen GFR Monitore bei Mäusen.
Es gibt eine Vielzahl von Gründen, warum Ermittler beginnen, die Verwendung von transdermalen GFR Monitore zur Bewertung der Nierenfunktion bei Nager-Modelle bevorzugen. Transdermale Messung der FITC-Sinistrin Abstand hat sich gezeigt, eine sensible und genaues Maß der Nierenfunktion im Vergleich zu den traditionellen Parameter der Nierenfunktion wie Serum Kreatinin und Blut Harnstoff Stickstoff (BUN)7zur Verfügung zu stellen, 8. Durch die Implementierung einer verbesserten Auswertealgorithmus, Friedemann und Kollegen gezeigt, dass das System vergleichbar mit dem Gold-Standard, die Konstante Infusion Technik für GFR Messung3Präzision erreicht. Neuere Studien haben auch gezeigt, dass sequenzielle Analyse mit Transkutane GFR-Monitore verwendet werden, um frühe Veränderungen in Nierenfunktion sowie Funktionelle Wiederherstellung nach Induktion des akuten Nierenversagens Verletzungen (AKI) zu studieren, ohne zu stören die Tiere Blut Volumen oder Hämodynamik, blood da der Test nicht sequenzielle erfordert Sampling9,10. Die Fähigkeit, GFR mit hoher Präzision und Sensibilität wiederholt im selben Tier Messen macht diese Technik für eine Vielzahl von verschiedenen Forschungsdisziplinen attraktiv. Transdermale GFR Monitore wurden von pharmazeutischen Unternehmen zur Bewertung der Toxizität der neuartige Substanzen sowie in Universitäten für Grundlagen- und Translationale Forschung.
Dieses Manuskript und das dazugehörige Trainingsvideo liefern praktische Leitlinien für den Einsatz von transdermalen GFR Monitore bei Mäusen. Die wichtigsten Schritte des Verfahrens sind die korrekte Befestigung des Gerätes am Rücken des Tieres, und sicher wickeln das Band um den Bauch. Die beste Position ist entweder leicht nach links oder rechts von der Mittellinie über den Brustkorb. Den Patch und das Gerät fest auf der Haut angebracht werden müssen, aber sie sollten nicht so eng, dass sie einschränken, Atmung, Bewegung, oder beeinträchtigen die Durchblutung der Haut unter dem Gerät sein, da dies zu fehlerhaften/ungenauen Messergebnissen führen würde. Darüber hinaus da Überwachung in bewusste Mäuse auftritt, nachdem sie aus der Narkose erholt haben, korrigieren Sie Platzierung des Geräts auf einem Körperteil mit geringsten Störungen durch Bewegung führt zu transdermalen Messungen mit wenig Bewegungsartefakte. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass das Gerät nicht ist zu nah an der oberen Gliedmaßen, so dass die Mäuse ihre Schultern frei bewegen können.
Es ist wichtig, die Mäuse ein bis zwei Tage vor der GFR Messung enthaaren wie Epilation wirkt sich auf die Messung der FITC-Sinistrin Abstand, mit vorläufigen Daten, die darauf hinweist, dass Enthaarung unmittelbar vor der Messung der transdermalen GFR erhöht die scheinbare Halbwertszeit von FITC-Sinistrin. Der Mechanismus hierfür ist nicht bekannt. Deshalb, um zuverlässige Messungen über mehrere Zeitpunkte und zwischen Experimente zu erhalten, empfiehlt es die Mäuse im Voraus zu enthaaren, um die Haut wieder aus dieser Prozess vor dem Fortfahren mit GFR Messungen zu ermöglichen. Enthaarung Creme sollte nicht auf den gleichen Bereich der Haut innerhalb von 72 Stunden eine vorherige Bewerbung chemische Schäden an der Haut zu vermeiden aufgetragen werden. In vielen Fällen das Fell nachwachsen dauert mehrere Tage oder bis zu einer Woche, und so Wiederbewerbung Enthaarung Creme innerhalb von 72 h leicht vermieden werden.
Da bis zu 50 % der Serum-Kreatinin durch Rohrprofil in Mäusen13ausgeschieden wird, und gibt es erhöhte Resorption von Harnstoff aus Nierentubuli, wenn Mäuse sind dehydriert14, sind Serum-Kreatinin und BUN schlechte Markierungen der Nierenfunktion. Wegen ihrer Bequemlichkeit weiterhin diese Tests jedoch als Hauptindikator für die Nierenfunktion in präklinischen Studien von AKI und CKD in Mäusen verwendet werden. Jedoch zeigte in Übereinstimmung mit den wesentlichen Beitrag der tubuläre Sekretion zu Kreatinin-Ausscheidung bei Mäusen mit normaler oder in der Nähe von normaler Nierenfunktion13, Serum-Kreatinin geringe Korrelation mit FITC-Sinistrin Clearance bei hohen Heilungsraten (niedrig FITC-sinistrin Half-Life), darauf hinweist, dass Kreatinin ist eine unempfindliche Maßnahme der Nierenfunktion bei Mäusen mit milden Niere Verletzungen. Im Gegensatz dazu während Brötchen gut mit FITC-Sinistrin Clearance bei Mäusen mit milde Niereninsuffizienz korreliert, gibt es schlechte Korrelation zwischen Brötchen und FITC-Sinistrin Clearance bei Mäusen mit schwerer Nieren-Verletzungen (hohe FITC-Sinistrin Halbwertszeit). Dies wird wahrscheinlich durch Effekte der Harnstoff Resorption verbunden mit Austrocknung bei kranken Tieren mit schweren Nieren-Verletzungen verursacht.
Ein großer Vorteil der transdermalen GFR Messung, im Vergleich zu anderen Bolus Clearance oder Konstante Infusion Techniken für GFR-Messung ist, dass sie nicht sorgfältig zeitgesteuerte Blut oder Urin Sammlungen erfordert. Diese können bei Mäusen besonders schwierig sein, da sie niedrige total Blut Volumen und Harn Ausgabe im Vergleich zu Ratten haben. Mäuse müssen darüber hinaus nur zur Befestigung des Gerätes sowie die Injektion, aber nicht für mehrere Venipunctures, je nach Bedarf für klassische Bolus Abstand Experimente15behandelt werden. Darüber hinaus die Dauer der Anästhesie ist kurz, und als solche, es ist möglich, wiederholte Messungen bei einzelnen Mäusen im Laufe der Zeit zu führen. Die Frequenz, bei der vor allem Messungen durchgeführt werden können, hängt von wiederholten Narkose Sitzungen über den Gesundheitszustand von den Mäusen, die Forscher Begabung für intravenöse Injektionen und lokalen institutionellen Regelungen. In gesunden, unverletzten Mäuse können transdermale GFR Messungen täglich mit minimal oder keine nachteiligen Auswirkungen auf die Maus durchgeführt werden. Jedoch verletzte Mäuse AKI oder CKD Leiden sind unwahrscheinlich, wiederholte Anästhesie-Sessions sowie die gesunde Mäuse zu tolerieren, und damit die Häufigkeit der Messungen sollte reduziert werden.
Die wichtigste Einschränkung der transdermalen GFR Messung gegenüber Bolus Abstand Methoden, GFR bei Mäusen zu messen ist, dass die Ausscheidung Kinetik werden nur als Änderung der relativen Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit und nicht als absolute Tracer Konzentrationen gemessen. Aus diesem Grund ist es nur möglich ist, die Rate konstant von der einzigen exponentiellen Zerfall der kinetischen, Ausscheidung zu messen, die eine sehr enge Schätzung der GFR auf extrazelluläre Volumen16normalisiert ist. GFR in mL/min zum Ausdruck bringen, muss das extrazelluläre Volumen des Tieres geschätzt werden, dass mit einem Umrechnungsfaktor, der in früheren Studien gegründet wurde die gleichzeitige Messung der Plasmakonzentrationen von FITC-Sinistrin wurden1durchgeführt. Aber dieser Umrechnungsfaktor kann nicht richtig einschätzen extrazelluläre fluidvolumina gleichermaßen gut in alle Mäuse, da Flüssigkeitsvolumen durch eine Vielzahl von äußeren Faktoren wie Alter betroffen sein könnten, sex, Flüssigkeitszufuhr Status (die durch chirurgische betroffen sein kann Interventionen sowie Verletzungen der Niere), und das Gewicht17. Im Gegensatz zu den Bolus Dosierung Methode zur Bestimmung der GFR bei Mäusen, unterliegt Transkutane GFR Messung weniger Betreiber-abhängige Variabilität, da es nicht durch Dosierung Fehler oder Fehler im Timing von Blut Sammlungen betroffen ist.
Eine weitere Einschränkung der Transkutane GFR-Messtechnik ist, dass die Grundlinie Signal Verschiebungen im Laufe der Messung durch Bleichen der Haut Fluorophore und Anhaftung und Tracer Injektionslösung Gerät notwendige narkoseform auftreten können. Diese Einschränkung wurde von Friedemann und Kollegen durch Umsetzung einer Korrektur Algorithmus3behoben. Die Implementierung dieses Algorithmus führte zu einer Verbesserung der Genauigkeit der transdermalen Technik eine Konstante Infusion Technik der GFR Bewertung vergleichbar.
Eine häufig gestellte Frage ist, ob die Pigmentierung der Haut in verschiedenen Mausstämme transdermale FITC-Sinistrin Abstand beeinflusst. Pigmentierung der Haut reduziert die FITC-Sinistrin Signalintensität, da dunkle Pigmente absorbiert die blauen Erregung und die grüne Emission Signale von FITC-Sinistrin Messungen. Aber die Ausscheidung FITC-Sinistrin beträgt unabhängig von der gesamten Intensität zu signalisieren. Darüber hinaus, während das gemessene Signal niedriger ist, ist das Hintergrundsignal auch niedriger bei pigmentierten Mäusen. Weil das Hintergrundsignal eine Mischung der Autofluoreszenz der Haut Fluorophore und Reflexion des Lichtes Erregung ist, haben wir festgestellt, dass der Hintergrund-maximale Signalverhältnis vergleichbar oder sogar verbessert, bei pigmentierten Tieren. Darüber hinaus Bewegungsartefakte, verursacht durch die Einwirkung der umgebenden Haut zu reflektiertem Licht, werden bei pigmentierten Mäusen reduziert, da das reflektierte Licht auch durch pigmentierte Haut absorbiert wird.
Zusammenfassend kann die Technik, die wir vorgestellt haben genaue Messung der GFR im Bewusstsein, frei beweglichen Mäuse aller Hauttypen. Wie die Technik unabhängig von der Blutabnahme ist, kann es immer wieder verwendet werden auf dem gleichen Tier für längs-Beobachtungen in CKD-Modellen sowie für die Messung von schnellen Änderungen der GFR nach Induktion von AKI.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Vanderbilt-Center für Kidney Disease (VCKD) und wurde zum Teil durch die folgenden Zuschüsse finanziert: DOD PR161028 und R01DK112688 (Mark de Caestecker)
Wir anerkennen Unterstützung für LS, PM und BW der MRC, EPSRC BBSRC finanziert UK Regenerative Medizin Plattform und “Sicherheit und Wirksamkeit, mit Schwerpunkt auf Imaging-Technologien-Hub” (Herr/K026739/1).
Transdermal GFR monitor (comes with 1 device, 2 batteries and 1 charger) | MediBeacon GmbH | TDM-MH001 | Reading software: MPD Lab; Analysis software: MPD Studio |
Additional Batteries | MediBeacon GmBH | PWR-BT0001 | |
Attachment patches | MediBeacon GmbH | small: PTC-SM001; large: PTC-LG001 | |
FITC-sinistrin | MediBeacon GmbH | FTC-FS001 | |
Hypoallergenic silk tape | e.g. Durapore (1538-2), or Kendall (7138C), or Leukosilk (01032-00) | ||
Anaesthesia chamber, isoflurane, oxygen | |||
Heat pad | |||
Electric shaver | |||
Depilatory (hair removal) cream | e.g. Veet or Nair | ||
Cotton buds | |||
Cotton swabs | |||
Timer | |||
Scales | |||
70% ethanol wipes |