Aqui descrevemos um protocolo para medir a taxa de filtração glomerular (TFG) em consciente, movimentando-se livremente ratos usando um monitor de TFG transdérmica.
Transdermal análise da taxa de filtração glomerular (TFG) é uma técnica estabelecida que é usada para avaliar a função renal em modelos do rato e do rato, de insuficiência renal aguda e doença renal crônica. O sistema de medição consiste de um detector de fluorescência miniaturizado que é diretamente ligado à pele na parte de trás dos animais conscientes, livremente movente e mede a cinética de excreção do traçador GFR exógeno, isotiocianato de fluoresceína (FITC) sinistrin conjugado (uma analógico de inulina). Este sistema tem sido descrito em detalhes em ratos. No entanto, devido a sua menor dimensão, medição de TFG transcutânea em camundongos apresenta desafios técnicos adicionais. Neste artigo, nós fornecemos, portanto, o primeiro guia prático detalhado para o uso de monitores de transdermal GFR em camundongos com base na experiência combinada de três investigadores diferentes que vêm realizando este ensaio em ratos ao longo de vários anos.
O uso de transcutânea GFR monitores em camundongos foi primeiramente relatada por Schreiber e colegas em 2012 e foi validado comparando as medições de TFG obtidas usando esta técnica, com resultados obtidos por medição directa do apuramento de bólus FITC-sinistrin de amostras de sangue serial1. Até à data, tem havido 35 publicações em que monitores de TFG transcutânea têm sido utilizados em ratos e camundongos (uma lista atualizada regularmente de artigos de periódicos e resumos de conferência, em que o monitor de TFG pré-clínicos foi usado pode ser encontrada na MediBeacon site2). Medições de TFG Transdermal em ratos e camundongos tem sido descrita em um número de publicações1,3,4,5, e um tutorial em vídeo demonstrando seu uso em ratos tem sido publicado6. No entanto, medição em camundongos apresenta desafios técnicos adicionais. Aqui, nós fornecemos o primeiro guia prático detalhado para o uso de monitores de TFG transdermal em camundongos.
Há uma variedade de razões por que os investigadores estão começando a favorecer o uso de monitores de TFG transdérmica para avaliar a função renal em modelos de roedores. Medição de Transdermal de apuramento FITC-sinistrin foi mostrada para fornecer uma medida mais sensível e exata da função renal, em comparação com os tradicionais parâmetros de função renal como soro creatinina e sangue ureia nitrogênio (BUN)7, 8. Com a implementação de um algoritmo de avaliação melhorada, Friedemann e colegas demonstraram que o sistema atinge precisão comparável ao padrão-ouro, a técnica de infusão constante para TFG medida3. Estudos recentes demonstraram também que a análise sequencial usando monitores de TFG transcutânea pode ser usado para estudar cedo alterações na função renal, bem como a recuperação funcional após a indução de insuficiência renal aguda (LRA) sem interferir com o sangue dos animais volume ou hemodinâmica, desde que o ensaio não exige sequencial sangue amostragem9,10. A capacidade de medir o TFG com alta precisão e sensibilidade repetidamente no mesmo animal torna esta técnica atraente para uma variedade de disciplinas de investigação diferentes. Transdermal GFR monitores utilizaram-se pelas empresas farmacêuticas para avaliar a toxicidade de novos compostos, bem como nas universidades de investigação básica e de translação.
Este manuscrito e o vídeo de treinamento que acompanha fornecem orientações práticas para o uso de transdermal monitores GFR em camundongos. As etapas mais críticas no procedimento são a fixação correta do dispositivo nas costas do animal e envolvendo firmemente a fita em torno do abdômen. A melhor posição é ligeiramente à esquerda ou direita da linha média, ao longo da caixa torácica. O patch e o dispositivo precisam ser firmemente ligados à pele, mas eles não devem ser tão apertados que restringir a respiração, movimento, ou afetar a circulação de sangue da pele sob o dispositivo, como isso levaria a medidas com defeito/imprecisas. Além disso, desde o monitoramento ocorre em camundongos conscientes depois que eles se recuperaram de anestesia, corrigi a colocação do dispositivo na parte do corpo com menor interferência de resultados de movimento nas medições transdérmica com pequenos artefatos de movimento. Por este motivo, é importante que o dispositivo não é colocado muito próximo a parte superior dos membros para que os ratos podem mover seus ombros livremente.
É importante depilar os ratos um ou dois dias antes da medição de TFG, como depilação afeta a medida de afastamento FITC-sinistrin, com dados preliminares indicando que depilação imediatamente antes da medição de transdermal TFG aumenta a meia-vida aparente de FITC-sinistrin. O mecanismo para isso é desconhecido. Portanto, a fim de obter medições correctas sobre vários pontos de tempo e entre as experiências, é aconselhável depilar os ratos com antecedência, para permitir que a pele se recuperar este processo antes de proceder às medições de TFG. Creme de depilação não deve ser aplicado para a mesma área da pele até 72 horas após uma aplicação prévia, para evitar dano químico para a pele. Em muitos casos, o re-crescimento de pelo leva vários dias ou até uma semana, e então re-aplicação de depilação creme dentro de 72 h pode ser facilmente evitado.
Porque acima de 50% de soro de creatinina é excretada pela seção tubular em ratos13, e porque há maior reabsorção de ureia dos túbulos renais, quando os ratos são desidratados14, creatinina sérica e BUN são pobres marcadores da função renal. No entanto, por causa de sua conveniência, estes ensaios continuam a ser usado como a principal medida da função renal em estudos pré-clínicos de AKI e CKD em camundongos. No entanto, consistente com a importante contribuição da secreção tubular de excreção de creatinina em camundongos com normal ou perto de uma função renal normal13, creatinina sérica mostrou pouca correlação com FITC-sinistrin acesso às taxas de liberação de alta (baixa Half-Life FITC-sinistrin), indicando que a creatinina é uma medida insensível da função renal em ratos com insuficiência renal ligeira. Em contraste, enquanto BUN correlaciona-se bem com FITC-sinistrin folga nos ratos com disfunção renal moderada, há correlação pobre entre afastamento BUN e FITC-sinistrin em ratos com lesão renal mais grave (alta FITC-sinistrin Half-Life). Isto é provavelmente causado por um efeito de reabsorção de ureia associado com desidratação em animais doentes com insuficiência renal grave.
Uma grande vantagem da medição GFR transdérmica, em comparação com todos os outros afastamento em bolus ou infusão constante as técnicas para medição de TFG, é que não exige cuidadosamente cronometradas coleções de sangue ou urina. Estes podem ser particularmente desafiadoras em camundongos, como eles têm sangue total baixos volumes e saída urinária em comparação com ratos. Além disso, os ratos precisam ser manipulado somente para a fixação do dispositivo e injeção, mas não para múltiplos venipunctures, conforme exigido por bólus clássica apuramento experimentos15. Além disso, a duração da anestesia é curta, e como tal, é possível realizar medições repetidas em camundongos individuais ao longo do tempo. A frequência na qual as medições podem ser realizadas principalmente depende o estado de saúde de ratos, aptidão do investigador para injeções intravenosas e regulamentos institucionais locais em sessões repetidas de anestesia. Em ratos saudáveis, ilesos, medições de TFG transdérmico podem ser executadas diariamente, com efeitos mínimos ou não adversos no mouse. No entanto, ratos feridos, sofrendo AKI ou DRC são improváveis tolerar a anestesia repetidas sessões, bem como os ratos saudáveis, e, portanto, a frequência das medições deve ser reduzida.
A principal limitação da medição de TFG transdérmica, em comparação com métodos de apuramento em bolus para medir o TFG em ratos é que a cinética de excreção são apenas medidos como alteração na intensidade da fluorescência relativo ao longo do tempo e não como as concentrações do marcador absoluto. Devido a isso, só é possível medir a constante de velocidade do único decaimento exponencial de excreção cinética, que é uma estimativa muito perto de TFG normalizado no volume extracelular16. Para expressar a TFG em mL/min, o volume extracelular do animal tem que ser estimado usar um fator de conversão que foi estabelecido em estudos prévios, em que as medições simultâneas de concentrações plasmáticas de FITC-sinistrin foram realizadas1. No entanto, este factor de conversão pode não corretamente estimar volumes de fluido extracelulares ingualmente bem em todos os ratos, desde que o volume de fluido pode ser afectado por uma variedade de fatores externos, incluindo idade, sexo, estado de hidratação (que pode ser afetado por cirúrgica as intervenções, bem como lesão renal) e peso17. No entanto, ao contrário o bólus de dosagem método para avaliar a TFG em camundongos, medida transcutânea de TFG está sujeito menor variabilidade de dependente do operador, como não é afetado por erros de dosagens ou por erros no sincronismo das coleções de sangue.
Outra limitação da técnica de medição da GFR transcutânea é que mudanças de sinal de linha de base podem ocorrer durante o curso da medição devido ao clareamento da pele fluorophores e a anestesia necessária para injeção de dispositivo acessório e marcador. Esta limitação foi dirigida por Friedemann e colegas através da implementação de um algoritmo de correção3. A implementação desse algoritmo levou a uma melhoria na precisão da técnica transdermal comparável a uma técnica de infusão constante de avaliação do TFG.
Uma pergunta frequente é se a pigmentação da pele em cepas de mouse diferente afeta o transdermal FITC-sinistrin autorização. Pigmentação da pele reduz a intensidade de sinal FITC-sinistrin desde pigmentos escuros absorve a excitação azul e a verde emissão sinais de medições FITC-sinistrin. No entanto, a taxa de excreção de FITC-sinistrin é independente da global intensidade de sinal. Além disso, enquanto o sinal medido é baixo, o sinal de fundo também é menor em camundongos pigmentados. Porque o sinal de fundo é uma mistura de autofluorescência de pele fluorophores e reflexão da luz da excitação, encontramos que a relação de fundo-de-máximo sinal é comparável, ou até mesmo melhorado, em animais pigmentados. Além disso, os artefatos de movimento, que são causados pela exposição da pele ao redor para luz refletida, são reduzidos em camundongos pigmentados, uma vez que a luz refletida é também absorvida pela pele pigmentada.
Em conclusão, a técnica que apresentamos permite uma medição precisa da TFG no consciente, movimentando-se livremente os ratos de todos os tipos de pele. Como a técnica é independente da amostragem do sangue, pode ser usada repetidamente no mesmo animal para observações longitudinais em modelos CKD, bem como para a medição de mudanças rápidas de TFG que ocorrem após a indução de AKI.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo centro de Vanderbilt para doença renal (VCKD) e foi financiado em parte pelas seguintes subvenções: DOD PR161028 e R01DK112688 (Mark de Caestecker)
Reconhecemos o apoio em LS, PM e BW pelo MRC, EPSRC e financiado pela BBSRC UK regenerativa medicina plataforma “Segurança e eficácia, centrando-se no centro de tecnologias de imagem” (senhor/K026739/1).
Transdermal GFR monitor (comes with 1 device, 2 batteries and 1 charger) | MediBeacon GmbH | TDM-MH001 | Reading software: MPD Lab; Analysis software: MPD Studio |
Additional Batteries | MediBeacon GmBH | PWR-BT0001 | |
Attachment patches | MediBeacon GmbH | small: PTC-SM001; large: PTC-LG001 | |
FITC-sinistrin | MediBeacon GmbH | FTC-FS001 | |
Hypoallergenic silk tape | e.g. Durapore (1538-2), or Kendall (7138C), or Leukosilk (01032-00) | ||
Anaesthesia chamber, isoflurane, oxygen | |||
Heat pad | |||
Electric shaver | |||
Depilatory (hair removal) cream | e.g. Veet or Nair | ||
Cotton buds | |||
Cotton swabs | |||
Timer | |||
Scales | |||
70% ethanol wipes |