Summary
في هذا البروتوكول، ويرد وصف أساليب إجراء الاستيلاد الصلبان، وتقييم مدى نجاح تلك الصلبان، للنمل عمري فولينهوفيا. هذه البروتوكولات هامة لإجراء تجارب تهدف إلى فهم الأساس الجيني لنظم تحديد الجنس في غشائيات الأجنحة.
Abstract
وقد درست المكونات الوراثية والجزيئية لتتالي تحديد نوع الجنس على نطاق واسع في نحل العسل Apis mellifera، كائن نموذج هيمينوبتيران. ومع ذلك، يعرف الكثير عن آليات تحديد نوع الجنس الموجودة في الأصناف hymenopteran الأخرى غير نموذجية، مثل النمل. وبسبب الطبيعة المعقدة لدورات الحياة التي تطورت في الأنواع هيمينوبتيران، من الصعب الحفاظ على وإجراء الصلبان التجريبية بين هذه الكائنات الحية في المختبر. هنا، نحن تصف طرق إجراء الصلبان الاستيلاد وتقييم مدى نجاح تلك الصلبان في النمل اميريي فولينهوفيا. حمل الاستيلاد في المختبر باستخدام ف عمري، هو بسيط نسبيا بسبب بيولوجيا الأنواع الفريدة. على وجه التحديد، هذه الأنواع تنتج اندروجينيتيك الذكور، والإناث الخصب يحمل الجناح تعدد الأشكال، الذي يبسط تحديد تعمل في الصلبان الوراثية. وباﻹضافة إلى ذلك، تقييم مدى نجاح الاستيلاد مباشرة كما الذكور يمكن أن تنتج باستمرار بالتهجين الصلبان، بينما الذكور العادية تظهر فقط أثناء موسم الإنجابية محددة جيدا في الميدان. لدينا بروتوكول يسمح باستخدام ف عمري كنموذج للتحقيق في الأساس الوراثي والجزيئي لنظام تحديد الجنس في أنواع النمل.
Introduction
وقد تطورت الأصناف Eusocial Hymenopteran، مثل النمل والنحل، نظام تحديد جنس هابلوديبلويد فيه الأفراد متخالف في واحد أو أكثر من تحديد نوع الجنس مكملة المكاني (CSD) تصبح الإناث، بينما هم أولئك الذين هومو-أو هيميزيجوس تصبح الذكور (الشكل 1أ)1.
وقد درست المكونات الوراثية والجزيئية المشاركة في سلسلة تحديد الجنس جيدا في نحل العسل Apis mellifera، hymenopteran طراز الكائن حي2،3،4. علم الجينوم المقارن التحقيقات التي أجريت مؤخرا تشير إلى أن النمل ونحل العسل تشتركان في العديد من هومولوجس المفترضة في مسار تحديد الجنس، مثل الجنس الأولى تحديد الجينات، لجنة التنمية المستدامة5. ومع ذلك، تزال مفتقدة الأدلة لحفظ هذه هومولوجس الفنية في النمل.
ولمعالجة هذه المشكلة، يلزم خطوط الاستيلاد وضع كما أنها ضرورية لرسم الخرائط الوراثية والدراسات الجزيئية. ومع ذلك، من الصعب الحفاظ على وإجراء تجريبي الصلبان بين هذه الكائنات الحية في المختبر بسبب الطبيعة المعقدة لدورات الحياة التي تطورت.
هنا، نحن نستخدم اميريي فولينهوفيا كنموذج للتحقيق في الأساس الوراثي والجزيئي لنظام تحديد الجنس في النمل6،7. وقد وضعت خطوط الاستيلاد من هذه الأنواع سابقا لربط رسم خرائط لمواقع الصفات الكمية (QTL) للصفات المتعلقة بتحديد نوع الجنس للمرة الأولى في النمل6. وبالإضافة إلى ذلك، قد تتالي الجزيئية في تحديد جنس التحقيق7. وقد تطورت هذه الأنواع نظام استنساخ غير المألوفة التي توظف كل من جينوجينيسيس وأندروجينيسيس (الشكل 1ب)8،9. معظم الملكات الجديدة والذكور كلونالي تنتج من مورثات الأم والأب، على التوالي. وباﻹضافة إلى ذلك، العمال وبعض الملكات المنتجة جنسياً8. هذا النظام الاستنساخ مناسبة خاصة للدراسات الوراثية للصلبان الاستيلاد المنتجة باستخدام جنسياً إنتاج الملكات والذكور يعادل وراثيا باككروس كلاسيكي. منذ الملكات المنتجة جنسياً تختلف شكلياً عن الملكات المنتجة من مورثات الأم10 (الشكل 1ب)، إجراء وتقييم الصلبان الاستيلاد يتم تبسيطها إلى حد كبير باستخدام هذا الأسلوب.
في هذه المقالة، الأساليب لإنشاء مستعمرات مختبر لاختبار عبور، يعبر تطبيق الاستيلاد باستخدام أزواج كامل-نظارة المصارف، وتقييم مدى نجاح تلك الصلبان استخدام التنميط أعضاء مستعمرة وتشريح من ذرية من الذكور يتم وصف الأعضاء التناسلية في ف عمري.
بغض النظر عن استنساخ النظام يعمل، هو تطبيق التهجين الصلبان غالباً الخطوة الأساسية الأولى في أي تحقيق في نظم تحديد الجنس في غشائيات الأجنحة. على سبيل المثال يوضح الغياب الكامل تقريبا للذكور مثنوية بعد 10 أجيال كاملة-المصرف التزاوج في المختبر في أوبسكوريور كارديوكونديلا، نظراً لغياب لجنة التنمية المستدامة محور11. فمن الممكن التنبؤ بعدد من لجنة التنمية المستدامة المكاني من نسبة الذكور المنتجة في الاستيلاد الصلبان6،،من1213.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-جمع وصيانة المستعمرات ف عمري في المختبر الميدانية
ملاحظة: تم العثور على أوكار ف. اميريي في المتعفنة الساقطة المتحللة شجرة برانتشيسين الغابات الثانوية في جميع أنحاء اليابان وسجلات. وتبين هذه الأنواع نوعين من المستعمرات، أي مستعمرات (1) تنتج إلا الملكات مجنح طويلة و (2) المستعمرات أساسا إنتاج الملكات مجنح قصيرة بالإضافة إلى عدد صغير من الملكات مجنح طويلة8،14. في هذا البروتوكول، جمعنا هذا النوع الأخير من المستعمرات في محافظة إيشيكاوا، اليابان.
- جمع ف عمري المستعمرات خلال أوائل الصيف.
ملاحظة: للحصول على عدد كاف من الأفراد الجنسية خلال موسم الإنجاب، المستعمرات التي تحتوي على أكثر من 300 من الأفراد المفضلة. - نقل العينات النمل من الفروع التي تم جمعها إلى عش جص اصطناعية مع تغطية زجاج المضخة (الشكل 2، اليسار) باستخدام.
- الحفاظ على المستعمرات في العش اصطناعية عند 25 درجة مئوية تحت دائرة ضوء/الظلام ح 16:8. توفير ماء الصنبور مع زجاجة غسيل على الجص الرطب.
- إضافة حوالي 100 ملغ مسحوق جاف للكريكيت ملفوفة في رقائق الألومنيوم وتلميح مملوءة بالمياه سكر براون (20 ميليلتر نصيحة) كل يوم حتى ظهور الخصب الجديدة (و1 مجنح الملكات والذكور و1 ).
2-التجارب المختبرية الصلبان
ملاحظة: الخصب جديدة تبدأ في الظهور من أواخر الصيف إلى الخريف (الشكل 3). تنتج الملكات مجنح منذ فترة طويلة عن طريق الاتصال الجنسي، والملكات مجنح قصيرة تنتج كلونالي والجينوم الأمهات (الشكل 1). استخدام الملكات مجنح منذ فترة طويلة، والذكور التهجين الصلبان.
- لإيقاف الأفراد من التحرك، وضع المستعمرات في غرفة بيئة ثابتة عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- إزالة منتصف الساقين العمال 30 استخدام الملقط تحت مجهر مجسمة وتحويلها إلى عش الجص جديدة أصغر حجماً (الشكل 2، حق) التهجين الصلبان.
ملاحظة: يتم إزالة الساقين التمييز بين العمال الحالي من العمال التي سيتم إنتاجها من الصلبان الاستيلاد اللاحقة. - إضافة 3-4 اليرقات أو الخوادر في عش جص المحتوية على العمال.
ملاحظة: تظهر عمال النشاط الاستكشافي في مستعمرة أقل الملكات0 و. اليرقات أو الخوادر يمكن اجتذاب هذه العمال والخصب جديدة في وسط المستعمرة أثناء اختبار عبور. كنتيجة لذلك، تبقى ظروف مستعمرة التجريبية قريبة من مستعمرة طبيعية. - نقل ملكة مجنحة منذ فترة طويلة، والذكور في عش جص إعدادها في الخطوة 2، 3 التهجين الصلبان.
- إبقاء المستعمرات عند 25 درجة مئوية تحت دائرة ضوء/الظلام ح 16:8 مع الغذاء والمياه المقدمة كما هو موضح في 1.3 حتى الملكة تفقد جناحيها وتضع بيضها.
ملاحظة: هذا يستغرق أسبوعا واحداً لمدة شهر. - تحقق من مستعمرة التجريبية اليومية تحت مجهر مجسمة. بعد أداء الاستيلاد تقاطع بين ذرية1 و، يمكن ملاحظة البيض تحت مجهر مجسمة.
- بعد و يبدأ1 الملكة وضع البيض، وإزالة الذكور و1 واليرقات أو الخوادر بإضافتها في الخطوة 2، 3 من العش لتجنب الخلط بين الجيل1 و (الذكور والإناث تستخدم للاستيلاد الصلبان) والجيل2 و (ذرية تنتج من الصلبان الاستيلاد).
ملاحظة: إذا كان هناك عدد قليل من الذكور في المستعمرة، من الممكن لحمل الصلبان الاستيلاد باستخدام أحد الذكور والملكات 1 إلى 3 في نفس المستعمرة التجريبية. - الاحتفاظ بالمستعمرات تحت كونديتيونساس نفس الموصوفة في 1.3، حتى تظهر و2 ذرية.
ملاحظة: نقل و1 الملكة وذرية2 و إلى عش الجبس الجديدة أكبر (الشكل 2، يسار) لحفظ مستعمرة طويلة الأجل.
3-تقييم نجاح الاستيلاد
- استخراج الحمض النووي والوراثي من جيل الآباء (و0)
- إزالة ساق واحدة لملكة0 و استخدام الملقط ونقل فريق الخبراء 1.5 مل microtube التي تحتوي على 100 ميليلتر من عامل استخلاب.
- تحت مجهر مجسم، تشريح البطن الإناث في صحن زجاج مليئة 300 ميليلتر من الماء عالي النقاوة باستخدام الملقط وعزل سبيرماثيكا الذي يحتوي على الحيوانات المنوية من الذكور تفعيل.
- قشر خارج الأنسجة سبيرماثيكا وعزل الحيوانات المنوية من الأنسجة للإناث باستخدام دبابيس الحشرات.
ملاحظة: لتسهيل استخراج الحيوانات المنوية من سبيرماثيكا، تخزين عينات الإناث بنسبة 100% EtOH لأكثر من يوم واحد قبل التشريح. - استخدام ميكروبيبيتي، نقل الحيوانات المنوية إلى microtube 1.5 مل تحتوي على 100 ميليلتر من عامل الخلبية.
- احتضان عينات و0 الملكة والحيوانات المنوية أعد الخطوة 3.1.1 و 3.1.3، على التوالي، في 95 درجة مئوية 20 دقيقة فلاش للطرد المركزي في microtube وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- النمط الوراثي جميع العينات باستخدام الأسلوب الموصوفة في أماكن أخرى4.
- استخراج الحمض النووي من زوج النمل تستخدم للاستيلاد الصلبان (و1)
- بعد تأكيد إنتاج البيض بنظارة المصارف تزاوج الملكة1 و، استخراج الحمض النووي للملكة باستخدام جناحيها تسلط أو واحد منتصف الساق والنمط الوراثي باستخدام نفس الأسلوب هو موضح في القسم 3.1 أعلاه.
- استخراج "الحمض النووي و"1 ذكر استخدام واحد من الساق والنمط الوراثي باستخدام نفس الأسلوب هو موضح في القسم 3.1 أعلاه.
ملاحظة: يمكن تخزين العينات في 100% EtOH قبل استخراج الحمض النووي، والحمض النووي في عامل استخلاب يمكن تخزينها لمدة شهرين في 4 درجات مئوية.
- تقييم خصوبة الذكور في الذكور المنتجة من التهجين الصلبان
ملاحظة: مثنوية الذكور المنتجة من الصلبان الاستيلاد غالباً ما تكون عقيمة.- تشريح الأعضاء التناسلية الداخلية في صحن زجاج مع 400 ميليلتر من برنامج تلفزيوني الحل باستخدام الملقط.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 4% بارافورمالدهيد (PFA) استخدام ميكروبيبيتي.
- إصلاح الأنسجة التي تفرخ في منهاج العمل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية).
- يغسل النسيج 5 مرات مع 400 ميليلتر من برنامج تلفزيوني استخدام ميكروبيبيتي.
- تمييع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) الحل إلى 1 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة حوالي 300 ميليلتر لهذا الحل المصبوغة DAPI مخفف للأنسجة.
- احتضان 15 دقيقة تحت ظروف مظلمة في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية).
- يغسل النسيج 5 مرات مع 400 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، ونقل الأنسجة في مركز الشريحة الزجاج باستخدام الملقط.
- جبل الأنسجة على تصاعد فالويدين مترافق تريتك تيتراميثيلرهوداميني تحتوي على المتوسط.
- مراقبة العينات بالليزر [كنفوكل] المسح مجهر استخدام 20 X أو X 63 الهدف العدسات.
- استخدام ليزر إثارة 405 نانومتر وكشف هجين في 410-530 نانومتر للكشف عن DAPI.
- استخدام ليزر إثارة نانومتر 561 وكشف هجين في 565-650 نانومتر للكشف عن تريتك.
- استخدام سرعة المسح الضوئي من 400 هرتز (400 خطوط/s) بدقة 1024 × 1024 بكسل.
- التقاط الصور باستخدام منصة برمجيات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وأظهرت نتائج التحليل الصغرية باستخدام و0 و1 و الأجيال أن الصلبان الاستيلاد أنتجت بنجاح (الشكل 4)6. وكنتيجة لذلك من التهجين الصلبان، تم الحصول على تفعيل الملكات في غضون شهر واحد من إقامة المستعمرات العبور التجريبية. كان ربع (27.1 ± SD 8.91%) من ذرية (و2) كل من الصلبان الاستيلاد الذكور، بينما تبقى الأنثى (العمال وملكة)6. تعيين QTL استخدام الذرية من التهجين الصلبان وتبين مثنوية الذكور التي تنتجها التهجين الصلبان ومتماثل في اثنين كانت لجنة التنمية المستدامة المكاني (CSD1 و CSD2 في الشكل 5)، بينما الإناث (العمال) تنتج من التهجين الصلبان مثنوية و متخالف على الأقل في موضع واحد في لجنة التنمية المستدامة6.
وكشف تشريح للذكور فرداني الخصيتين والحيوانات المنوية، كالمتوقع (الشكل 6A-ج 6). ومع ذلك، عند الذكور مثنوية، الحيوانات المنوية ابدأ لوحظت، مما يوحي بأن الذكور المنتجة في التهجين الصلبان عقيمة في ف عمري6. وبالإضافة إلى ذلك، فشل الخصيتين للذكور مثنوية تطوير (الشكل 6-6E).
الشكل 1 . الجهاز التناسلي نموذجية في غشائيات الأجنحة (A) والجهاز التناسلي غير النمطية التي تنطوي على أندروجينيسيس وجينوجينيسيس في (ب) ضد عمري. نموذجياً، الإناث (العمال والملكات) وضع من البويضات المخصبة مثنوية، ووضع الذكور من البيض فرداني المخصبة تحتوي على نصف الجينوم الأمهات (A). في ف عمري، وضع العمال معقمة والملكات مجنح طويلة قليلة (لوك) من البويضات المخصبة مثنوية، بينما وضع الملكات مجنح قصيرة (سوق) مع مورثات الأم كاملة تقريبا من البيض المخصبة مثنوية (جينوجينيسيس). وراثة الذكور ابدأ مورثات الأم ولكن استنساخ لآبائهم (أندروجينيسيس) (ب). لقد تم تعديل هذا الرقم من [ميياكاوا et al. عام 2018]7. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . إعداد تجريبية من المستعمرات ف. اميريي - بعد جمع في الميدان، حولت إلى عش جص مصطنعة المستعمرات والاحتفاظ بها في المختبر. عش جص كبيرة (يسار) مستعدة للإبقاء على المستعمرات التي تم جمعها، بينما عش جص أصغر (يمين) مستعدة للصلبان الاستيلاد التجريبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . جديدة ضد عمري الخصب الظهور خلال موسم الإنجاب. والنضج جيدا-فيدكولونيس تميل إلى إنتاج الملكات مجنح طويلة (لوق) مع الجينوم الوالدين بالإضافة إلى الملكات مجنح قصيرة (سوق) التي تتحمل الجينوم الأمهات فقط (الشكل 1ب). صور من باب المجاملة السيد تاكو شيمادا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . تصميم الصلبان الاستيلاد والأنماط الجينية الصغرية و0 و1 و الأجيال. استخدام علامات الصغرى 11 وضعت في السابق دراسات6،،من89، الإناث والذكور من جيل الآباء (و0) وأظهرت مختلف الأنماط الوراثية. الوراثية للإناث والذكور المستخدمة للصلبان التجريبية (و1) ورثت الوراثية الأبوية والأبوية، على التوالي، مما يشير إلى أن الإناث قد عبروا بنجاح مع إخوانهم، التي تشاطرها الإناث نصف بهم الجينوم. وتشير الأرقام إلى أطوال من منتجات PCR في محور ساتل L-5، الذي واحد من العلامات المستخدمة للتنميط6،،من89،10. وقد تجلى هذا الرقم وفقا للبيانات من [ميياكاوا و 2015 ميخييف]6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . أنماط اليل المكاني لجنة التنمية المستدامة هما (CSD1 و CSD2) في ذرية تنتجها التهجين الصلبان. نسبة الذكور مثنوية (حوالي 25 في المائة) ورسم خرائط QTL استخدام ذرية تنتجها كوينز تزاوج المصرف توحي بوجود هذين المكاني لجنة التنمية المستدامة في ف عمري. الإناث متخالف في واحد على الأقل من المكاني لجنة التنمية المستدامة هما في حين أن الذكور هم متماثل في جميع مواضع. يتم تمثيل الأنماط الجينية حسب الحروف الأبجدية. لقد تم تعديل هذا الرقم من [ميياكاوا et al. عام 2018]7. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 . ذكر الأعضاء التناسلية الداخلية من الذكور فرداني وضعفاني اندروجينيتيك في ف عمري. تشريح مورفولوجيس من الخصيتين وغيرها من الأجهزة التناسلية الداخلية خارجاً من الذكور فرداني اندروجينيتيك (A). يمكن رؤية الحيوانات المنوية (النسيج الليفي) في الخصيتين للذكور فرداني (ب وج). اللون الأزرق يمثل نواة الملون ب DAPI، وعلامات اللون الأحمر واكتين الملون مترافق تريتك تيتراميثيلرهوداميني فالويدين في باء وجيم وهاء غدد الملحقة (أ)؛ (ر) الخصيتين؛ (ت) الاسهر؛ (ز) الأعضاء التناسلية الخارجية. مورفولوجيس للأعضاء التناسلية الداخلية تشريح خارجاً من الذكور مثنوية (د). ابدأ لوحظت الخصيتين والحيوانات المنوية من الذكور مثنوية (د وه، ن >> 30). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوضح هذا المقال البروتوكولات التي يمكن استخدامها لحمل الصلبان الاستيلاد وتقييم حدوث الاستيلاد في النمل ف عمري. في هذه التجارب، الوراثي للأفراد المستخدمة للصلبان اللازمة لضمان نجاح الصلبان الاستيلاد. إلا أن فعالية هذه الاختبارات عبور جليا كما يمكن أن تنتج الذكور مثنوية طوال السنة، بينما الذكور فرداني فقط يمكن أن تنتج في الخريف في الحقل و المختبر6. تبدأ الملكات تزاوج نظارة المصارف إنجاب الذكور مباشرة بعد عبور. ولوحظت لا الاختلافات المظهرية الشكلية بين الذكور فرداني ضعفاني، وفي ف عمري6،7. لكن مثنوية الذكور ف عمري دائماً تقريبا إلا أن وضع الخصيتين. نظراً لغياب البصمات الجينية لاختبار شمولية الوراثية لأزواج المستخدمة لاجتياز الاختبارات، يمكن استخدام القدرة الإنجابية لذرية من الذكور لاستنتاج ما إذا كان قد حدث الاستيلاد. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الذكور المنتجة في التهجين الصلبان ليست دائماً عقيمة في سائر الأنواع هيمينوبتيران15،16،17.
الخطوة الأولى الحاسمة في نجاح البروتوكول هو الحفاظ على المستعمرات جيدا تغذية، اطعامهم بعد الجمع الميداني سوف تزيد من احتمال الحصول على عدد كاف من الخصب للصلبان. في ف عمري، أبلغ عن وجود ارتباط إيجابي بين التغذية وإنتاج الملكات مجنح منذ فترة طويلة، وهي الملكات المستخدمة ل الصلبان الاستيلاد10. في الحشرات الاجتماعية، أو مستعمرات صغيرة، أو المستعمرات في حالة صحية سيئة، لا تميل إلى إنتاج جديد الخصب18. ولذلك من المهم جمع المستعمرات ناضجة من الميدان وتزويدهم بكميات كافية من الطعام المغذي لتجارب استخدام الخصب الجديدة.
والخطوة الحاسمة الثانية هو الاحتفاظ بالعمال، الإنجابية وبعض اليرقات أو الخوادر معا أثناء اختبارات عبور والحفاظ على مستعمرة العبور التجريبية في نفس الدولة كمستعمرة طبيعية حتى يتم إكمال العبور (لمدة أسبوع إلى شهر). من الصعب الحفاظ على المستعمرات التي ستستخدم لعبور التجارب دون العمال لأكثر من 3 أيام لأن الذكور غير قادر على إطعام أنفسهم ويجب أن تغذيها العمال. في ظل هذه الظروف غير طبيعية، كان معدل نجاح الصلبان الاستيلاد منخفضة للغاية6.
هناك اثنين من قيود فيما يتعلق بتطبيق هذه البروتوكولات على الأنواع الأخرى من النمل. أولاً، هي العظة لحمل الصلبان الأنواع المحددة. فمن السهل نسبيا لحمل الصلبان المختبر في ف عمري منذ التزاوج داخل مستعمرة دون هروب تحدث في الطبيعة. ومع ذلك، تطورت العديد من أنواع النمل طقوس التزاوج التي تشمل رحلات الزواج خلال أي رفيقه الملكات والذكور الجديدة أثناء أو بعد الرحلة19. ولذلك من المهم توضيح المشغلات التي تحفز معبر في كل نوع من الأنواع في بيئة معمل. على سبيل المثال، في النمل الطفيلية أميلياي أكروميرميكس، الحافز الرئيسي لتحريك رحلات الزواج يبدو أن الضوء20. والقيد الثاني، في بعض الحالات، والذكور مثنوية تنتجها التهجين الصلبان لا يمكن جمعها كما لﻻستمرار أو قتلوا على يد العمال نظراً لأنها لا تعمل و/أو ليس لديهم أو منخفضة القدرة الإنجابية، بالتالي بتكلفة كبيرة للمستعمرة الأنواع موضوعية21،،من2223. لحسن الحظ، ضعفاني V. اميريي الذكور لا يقتلون بالعمال وهم يعيشون حتى أنهم يموتون بطبيعة الحال، مما يوحي بأن أنها لا تصادف كثيرا ما في الطبيعة ولم تتطور استراتيجية ترمي إلى استبعاد الذكور مثنوية من المستعمرات في هذه الأنواع.
مقارنة بغيرها من الأنواع النمل التي توظف التوالد العذري أررهينوتوكوس استنساخ (الشكل 1أ)، يمكننا أن نفترض أن هناك مزايا معينة لإنتاج الصلبان الاستيلاد التجريبية استخدام V. اميريي من أندروجينيسيس الصلبان الاستيلاد يعادل وراثيا باككروس كلاسيكي. والواقع أن النظام مكننا من تصميم التجارب التحقيق في تحديد نوع الجنس الجينات، الآليات الجزيئية، وإجراء الدراسات الفنية في هذه الأنواع6،7.
وباختصار، تقاطع طرق إجراء الاستيلاد وتقييم مدى نجاح الناجمة عن ذلك وقد وصف الصلبان في ف عمري. هذه البروتوكولات ضرورية لإجراء تجارب تهدف إلى فهم الأساس الجيني والجزيئي نظم تحديد الجنس في غشائيات الأجنحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر السيد تاكو شيمادا، مندوب أنتروم، طوكيو، اليابان، لتزويدنا بصورته من ف عمري الخصب. تمويل هذا المشروع من "جمعية اليابان" "الزمالات البحثية النهوض بالعلوم" (JSPS) للعلماء الشباب (16J00011)، ومنح مساعدات "العلماء الشباب" (B)(16K18626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plaster powder | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Charcoal, Activated, Powder | Wako | 033-02117,037-02115 | |
| Slide glass | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Dry Cricket diet | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Brown shuger | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Styrene Square-Shaped Case | AS ONE | Any size | Size varies by number of ants |
| Incbator | Any brand can be used | ||
| Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B | TAITEC | 0014035-000 | |
| 1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom | WATSON | 131-715CS | |
| Ethanol (99.5) | Wako | 054-07225 | |
| Stereoscopic microscope | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Forseps | DUMONT | 0108-5-PO | |
| Chelex 100 sodium form | SIGMA | 11139-85-8 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| -Cellstain- DAPI solution | Dojindo Molecular Technologies | D523 | |
| ABI 3100xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8 | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica HyDTM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Directly contact the constructor formore informations. |
References
- Mable, B. K., Otto, S. P. The evolution of life cycles with haploid and diploid phases. BioEssays. 20 (6), 453-462 (1998).
- Beye, M., Hasselmann, M., Fondrk, M. K., Page, R. E., Omholt, S. W. The gene csd is the primary signal for sexual development in the honeybee and encodes an SR-type protein. Cell. 114 (4), 419-429 (2003).
- Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454 (7203), 519-522 (2008).
- Nissen, I., Müller, M., Beye, M. The Am-tra2 gene is an essential regulator of female splice regulation at two levels of the sex determination hierarchy of the honeybee. Genetics. 192 (3), 1015-1026 (2012).
- Schmieder, S., Colinet, D., Poirié, M. Tracing back the nascence of a new sex-determination pathway to the ancestor of bees and ants. Nature Communications. 3, 895 (2012).
- Miyakawa, M. O., Mikheyev, A. S. QTL Mapping of Sex Determination Loci Supports an Ancient Pathway in Ants and Honey Bees. PLoS Genetics. 11 (11), (2015).
- Miyakawa, M. O., Tsuchida, K., Miyakawa, H. The doublesex gene integrates multi-locus complementary sex determination signals in the Japanese ant, Vollenhovia emeryi. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 94, 42-49 (2018).
- Ohkawara, K., Nakayama, M., Satoh, A., Trindl, A., Heinze, J. Clonal reproduction and genetic caste differences in a queen-polymorphic ant, Vollenhovia emeryi. Biology letters. 2 (3), 359-363 (2006).
- Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Clonal reproduction by males of the ant Vollenhovia emeryi (Wheeler). Entomological Science. 11 (2), 167-172 (2008).
- Okamoto, M., Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Sexual and asexual reproduction of queens in a myrmicine ant, Vollenhovia emeryi (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecological News. 21, 13-17 (2015).
- Schrempf, A., Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).
- De Boer, J. G., Ode, P. J., Rendahl, A. K., Vet, L. E. M., Whitfield, J. B., Heimpel, G. E. Experimental support for Multiple-locus complementary sex determination in the parasitoid Cotesia vestalis. Genetics. 180 (3), 1525-1535 (2008).
- Paladino, L. C., et al. Complementary sex determination in the parasitic wasp Diachasmimorpha longicaudata. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. No gene flow between wing forms and clonal reproduction by males in the long-winged form of the ant Vollenhovia emeryi. Insectes Sociaux. 58 (2), 163-168 (2011).
- Cowan, D. P., Stahlhut, J. K. Functionally reproductive diploid and haploid males in an inbreeding hymenopteran with complementary sex determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (28), 10374-10379 (2004).
- Armitage, S., Boomsma, J., Baer, B. Diploid male production in a leaf-cutting ant. Ecological Entomology. 35 (2), 175-182 (2010).
- Krieger, M. J. B., Ross, K. G., Chang, C. W. Y., Keller, L. Frequency and origin of triploidy in the fire ant Solenopsis invicta. Heredity. 82, February 1998 142-150 (1999).
- Seeley, T. D., Mikheyev, A. S. Reproductive decisions by honey bee colonies: Tuning investment in male production in relation to success in energy acquisition. Insectes Sociaux. 50 (2), 134-138 (2003).
- Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Harvard University Press. http://www.amazon.co.uk/Ants-Bert-H?lldobler/dp/3540520929 (1990).
- da Souza, D. J., Marques Ramos Ribeiro, M., Mello, A., Lino-Neto, J., Cotta Dângelo, R. A., Della Lucia, T. M. C. A laboratory observation of nuptial flight and mating behaviour of the parasite ant Acromyrmex ameliae (Hymenoptera: Formicidae). Italian Journal of Zoology. 78 (3), 405-408 (2011).
- Woyke, J. What happens to diploid drone larvae in a honeybee colony. Journal of Apicultural Research. 2 (2), 73-75 (1963).
- Schmidt, A. M., Linksvayer, T. A., Boomsma, J. J., Pedersen, J. S. No benefit in diversity? The effect of genetic variation on survival and disease resistance in a polygynous social insect. Ecological Entomology. 36 (6), 751-759 (2011).
- Schrempf, a, Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).
