Summary
Neste protocolo, métodos para a realização de cruzamentos de consanguinidade e para avaliar o sucesso dessas cruzes, são descritos para a formiga Vollenhovia emeryi. Estes protocolos são importantes para as experiências que visa compreender a base genética dos sistemas de determinação do sexo em Hymenoptera.
Abstract
Os componentes genéticos e moleculares da cascata determinação do sexo têm sido muito estudados na abelha, Apis mellifera, um organismo modelo himenóptera. No entanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos de determinação do sexo encontrados em outros táxons himenóptera não do modelo, tais como formigas. Devido à natureza complexa dos ciclos de vida que evoluíram em espécies himenóptera, é difícil manter e realizar cruzamentos experimentais entre estes organismos em laboratório. Aqui, descrevemos os métodos para a realização de cruzamentos de endogamia e para avaliar o sucesso dessas cruzes em formiga Vollenhovia emeryi. Induzindo a consanguinidade no laboratório usando V. emeryi, é relativamente simples devido a única biologia das espécies. Especificamente, esta espécie produz machos de alopecia, e femininos reproductives exibem polimorfismo de asa, que simplifica a identificação dos fenótipos em cruzamentos genéticos. Além disso, avaliar o sucesso da endogamia é simples, como os machos podem ser produzidos continuamente por consanguinidade cruzes, enquanto os machos normais aparecem apenas durante uma temporada reprodutiva bem definida no campo. Nosso protocolo permitem usando V. emeryi como um modelo para investigar a base genética e molecular do sistema de determinação de sexo em espécies de formigas.
Introduction
Eusocial himenóptera táxons, como formigas e abelhas, desenvolveram um sistema de determinação do sexo do haplodiploid em que os indivíduos que são heterozigotos na determinação do sexo complementar um ou mais loci (CSD) tornar-se fêmeas, enquanto aqueles que são homo - ou heterozigotos tornar-se machos (Figura 1A)1.
Componentes genéticos e moleculares envolvidos na cascata da determinação de sexo têm sido bem estudados na abelha, Apis mellifera, um modelo himenóptera organismo2,3,4. Investigações recentes de genómica comparativa sugerem que as formigas e as abelhas compartilham muitos homologs putativos na via da determinação de sexo, tais como o gene de determinação de sexo inicial, csd5. No entanto, evidências de conservação funcional destes homologs ainda carece de formigas.
Para resolver este problema, linhas de endogamia precisam ser desenvolvida à medida que eles são essenciais para mapeamento genético e estudos moleculares. No entanto, é difícil manter e realizar cruzamentos experimentais entre estes organismos em laboratório devido à natureza complexa dos ciclos de vida que evoluíram.
Aqui, usamos Vollenhovia emeryi como um modelo para investigar a base genética e molecular do sistema de determinação de sexo em formigas6,7. As linhas de consanguinidade desta espécie foram desenvolvidas anteriormente para mapeamento de enlace dos loci de traço quantitativos (QTL) para os traços relacionados à determinação do sexo pela primeira vez em formigas6. Além disso, a cascata da sexo-determinação molecular tem sido investigadas7. Esta espécie tem evoluído de um sistema de reprodução incomum que emprega tanto ginogênese e androgenesis (Figura 1B)8,9. A maioria das novas rainhas e machos são uma relação clonal produzidos a partir de genomas maternos e paternos, respectivamente. Além disso, os trabalhadores e algumas rainhas são produzidas sexualmente8. Este sistema de reprodução é particularmente adequado para estudos genéticos, pois as cruzes de endogamia produzidas usando sexualmente produziram rainhas e machos são geneticamente equivalentes a um cruzamento clássico. Desde rainhas sexualmente produzidas diferem morfologicamente rainhas produzidas a partir de genomas maternos10 (Figura 1B), realização e avaliação de endogamia cruzes é bastante simplificada usando esse método.
Neste artigo, os métodos para o estabelecimento de colônias de laboratório para teste de passagem, aplicação da consanguinidade cruzes usando pares de cheia-sib e avaliar o sucesso dessas cruzes usando genotipagem de membros da colônia e dissecção de prole masculina genitália é descrita no V. emeryi.
Independentemente do sistema de reprodução empregado, aplicação de consanguinidade cruzes é frequentemente o primeiro passo essencial em qualquer investigação de sistemas de determinação do sexo na Hymenoptera. Por exemplo em Cardiocondyla obscurior, a quase total ausência de machos diploides após 10 gerações de acasalamento no laboratório completo-sib demonstra ausência de CSD locus11. É possível prever o número de loci CSD da proporção de machos produzidos em consanguinidade cruzes6,12,13.
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Protocol
1. coleta e manutenção de V. Emeryi colônias em laboratório de campo
Nota: Ninhos de V. emeryi são encontrados em logs e caído em decomposição árvore branchesin florestas secundárias em todo o Japão a apodrecer. Esta espécie mostra dois tipos de colônias, ou seja, (1) colônias produzindo apenas longimanus rainhas e (2) colônias produzindo principalmente rainhas-de-asa-curta, além do pequeno número de rainhas longimanus8,14. Neste protocolo, recolhemos o último tipo de colônias na província de Ishikawa, Japão.
- Colete V. emeryi colônias durante o início do verão.
Nota: Para obter um número suficiente de indivíduos sexuais durante a temporada reprodutiva, colônias contendo mais de 300 indivíduos são preferidas. - Transferi os espécimes de formiga dos ramos coletados para um ninho de gesso artificial com uma tampa de vidro usando um aspirador (Figura 2, à esquerda).
- Manter colônias no ninho artificial a 25 ° C, sob um ciclo de luz/escuridão 16:8 h. Fornece água da torneira com um frasco de lavagem para molhar o gesso.
- Adicione cerca de 100 mg de pó de grilo seco envolvido em papel alumínio e açúcar mascavo cheio de água na ponta (ponta de 20 µ l) todos os dias até surgem reproductives novos (F1 alado-rainhas e machos de1 F).
2. cruzes de laboratório experimental
Nota: Reproductives novos começam a surgir do final do verão ao Outono (Figura 3). Longimanus rainhas são produzidas sexualmente, e damas-de-asa-curta são produzidas uma relação clonal e têm o genoma materno (Figura 1). Use longimanus rainhas e machos por consanguinidade cruzes.
- Para parar os indivíduos de se mover, coloque colônias em uma sala de ambiente constante a 4 ° C por 15 min.
- Retire as pernas meados dos 30 trabalhadores usando fórceps sob um microscópio estereoscópico e transferi-los para o ninho novo em gesso menor (Figura 2, direita) por consanguinidade cruzes.
Nota: As pernas são removidas para distinguir os trabalhadores presentes os trabalhadores que vão ser produzidos pelas cruzes de endogamia subsequentes. - Adicione 3-4 larvas ou pupas em um ninho de gesso contendo os trabalhadores.
Nota: Os trabalhadores mostram atividade exploratória na colônia de rainhas-menos F0 . Larvas ou pupas podem efetivamente atrair esses trabalhadores e reproductives novos no centro da colônia durante o teste de passagem. Como resultado, manter as condições da colônia experimental perto da colônia normal. - Transferi uma rainha longimanus e um macho em um ninho de gesso preparado na etapa 2.3 para procriação consanguínea cruzes.
- Manter colônias a 25 ° C, sob um ciclo de luz/escuridão 16:8 h com comida e água fornecida conforme descrito no ponto 1.3, até a rainha perde as asas e pôr ovos.
Nota: Isso leva uma semana para um mês. - Verifica o cotidiano da colônia experimental sob um microscópio estereoscópico. Depois de executar a endogamia atravessa entre a prole de1 F, ovos podem ser observados sob um microscópio estereoscópico.
- Após a F1 rainha começa a postura dos ovos, remover os machos de1 F e larvas ou pupas adicionadas na etapa 2.3 do ninho para evitar misturar F2 geração (descendência e a geração de1 F (machos e fêmeas usadas por endogamia Cruzes) produzidos a partir de cruzamentos de consanguinidade).
Nota: Se houver alguns machos na colônia, é possível induzir a endogamia cruzes usando um macho e 1 a 3 rainhas na mesma colônia experimental. - Manter colônias sob a mesma conditionsas descrito no ponto 1.3, até descendentes de2 F emergem.
Nota: Rainha de transferência F1 e F2 prole em ninho novo em gesso maior (Figura 2, à esquerda) para manutenção a longo prazo da colônia.
3. avaliação do sucesso de consanguinidade
- Extração de DNA e genotipagem da geração parental (F0)
- Remover uma perna de uma rainha de0 F usando fórceps e transferir a perna para um microtubo de 1,5 mL contendo 100 µ l de agente quelante.
- Sob um microscópio estereoscópico, dissecar um abdômen feminino em prato de vidro preenchido com 300 µ l de água ultrapura usando fórceps e isolar a espermateca contendo o esperma dos machos acasalados.
- Descascar o tecido da espermateca e isolar o esperma do tecido da fêmea utilizando pinos de insetos.
Nota: Para facilitar a extração de esperma da espermateca, armazenar espécimes femininos em 100% EtOH por mais de um dia antes de dissecação. - Utilizando uma micropipeta, transferi o esperma em um microtubo de 1,5 mL contendo 100 µ l de agente quelante.
- Incubar as amostras da rainha de F0 e espermatozoides preparados na etapa 3.1.1 e 3.1.3, respectivamente, a 95 ° C por 20 min. Flash microtubo de centrifugação e armazenam a 4 ° C.
- Genótipo todas amostras usando o método descrito em outra parte4.
- Extração de DNA do par de formigas usadas por cruzes de endogamia (F1)
- Depois de confirmar a produção de ovos pela sib acasalado rainha de F1 , extrair o DNA da rainha usando suas asas galpão ou uma perna mid e genótipo usando o mesmo método descrito na secção 3.1 acima.
- Extraia o macho de DNA de F1 usando uma perna e genótipo-los usando o mesmo método descrito na secção 3.1 acima.
Nota: As amostras podem ser armazenadas em 100% EtOH antes de extração de DNA e DNA em agente quelante podem ser armazenado durante dois meses a 4 ° C.
- Avaliação da fertilidade masculina em machos produzidos a partir de consanguinidade cruzes
Nota: Machos diploides, produzidos a partir de endogamia cruzes são muitas vezes estéril.- Disse órgãos reprodutivos internos em um prato de vidro com 400 µ l de solução de PBS usando fórceps.
- Remover o PBS e adicionar 4% paraformaldeído (PFA) utilizando uma micropipeta.
- Fixe o tecido incubando em PFA por 30 min à temperatura ambiente (15-25 ° C).
- Lave o tecido 5 vezes com 400 µ l de PBS utilizando uma micropipeta.
- Dilua a 4', a solução de (DAPI) 6-diamidino-2-phenylindole 1 µ g/ml em PBS.
- PBS de remover e adicionar aproximadamente 300 µ l desta solução diluída de coloração DAPI para tecido.
- Incube 15 min sob condição de escura, à temperatura ambiente (15-25 ° C).
- Lave o tecido 5 vezes com 400 µ l de PBS e transferir o tecido no centro do vidro de slide usando fórceps.
- Monte o tecido na montagem média faloidina contendo diversos TRITC-conjugados.
- Observe as amostras por laser confocal microscópio usando 20 X ou 63 X objectivas.
- Use um laser de excitação 405 nm e um detector de híbrido em 410-530 nm para a deteção de DAPI.
- Use um laser de excitação 561 nm e um detector de híbrido em 565-650 nm para a deteção de TRITC.
- Use uma velocidade de varredura de 400 Hz (400 linhas/s) com uma resolução de 1024 × 1024 pixels.
- Capture imagens usando uma plataforma de software.
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Representative Results
Resultados da análise de microssatélites usando F0 e F1 gerações mostraram que a consanguinidade cruzes foram produzidas com sucesso (Figura 4)6. Como resultado de cruzamentos de consanguinidade, rainhas acasaladas foram obtidas dentro de um mês de estabelecer colônias cruzamento experimental. Um quarto (27,1 ± 8,91% SD) de todos os descendentes (F2) de cruzamentos a endogamia era do sexo masculino, enquanto o restante era fêmea (trabalhadores e uma rainha)6. Mapeamento de QTL usando a prole de consanguinidade cruzes mostrou que os machos produzidos por consanguinidade cruzes foram diploides e homozigotos em dois CDs loci (CSD1 e CSD2 na Figura 5), enquanto as fêmeas (trabalhadores) produzidos a partir de consanguinidade cruzes foram diploide e heterozigotos pelo menos um locus CSD6.
Dissecação de machos haploides revelou testículos e esperma, como esperado (figura 6A-6C). No entanto, em machos diploides, espermatozoides nunca observaram-se, sugerindo que os machos produzidos em consanguinidade cruzes são estéreis em V. emeryi6. Além disso, os testículos dos machos diploides conseguiram desenvolver (Figura 6-6E).
Figura 1 . Típico sistema reprodutivo em Hymenoptera (A) e o sistema reprodutivo atípico envolvendo androgenesis e ginogênese em (B) V. emeryi. Normalmente, as fêmeas (trabalhadores e rainhas) desenvolvem a partir de ovos fertilizados diploides, e os machos desenvolvem de ovos não fertilizados haploides, contendo metade do genoma materno (A). Em V. emeryi, trabalhadores estéril e algumas rainhas longimanus (LWQ) desenvolvem a partir de ovos fertilizados diploides, enquanto rainhas-de-asa-curta (SWQ) desenvolvem com genomas maternas quase completas de ovos não fertilizados diploides (ginogênese). Os machos nunca herdam genomas maternas, mas são clones de seus pais (androgenesis) (B). Esta figura foi modificada [Miyakawa et al 2018]7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Montagem experimental de colônias V. emeryi . Após a coleta de campo, colônias são transferidas para um ninho de gesso artificial e mantidas em laboratório. Um ninho de gesso grande (à esquerda) está preparado para manter colônias coletadas, Considerando que um ninho de gesso menor (à direita) está preparado para cruzamentos experimentais de consanguinidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Nova V. emeryi reproductives emergem durante a estação reprodutiva. Maduro e bem-fedcolonies tendem a produzir rainhas longimanus (LWQ) com o genoma dos pais além de rainhas-de-asa-curta (SWQ) que suportam apenas o genoma materno (Figura 1B). Foto cortesia do Sr. Taku Shimada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Projeto de cruzes de endogamia e de genótipos de microssatélites de F0 e F1 gerações. Usar 11 marcadores microssatélites desenvolvida em anteriores estudos6,8,9, fêmeas e machos da geração parental (F0) mostraram diferentes genótipos. Os genótipos de fêmeas e machos, usados para cruzamentos experimentais (F1) herdou os genótipos parentais e paternos, respectivamente, indicando que as fêmeas foram cruzadas com sucesso com seus irmãos, com o qual as fêmeas compartilhado metade deles genomas. Os números indicam os comprimentos dos produtos PCR em microssatélites locus L-5, que é um dos marcadores utilizados para genotipagem6,8,9,10. Esta figura tem sido ilustrada de acordo com os dados de [Miyakawa e Mikheyev 2015]6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Padrões de alelo dos dois loci CSD (CSD1 e CSD2) na prole produziram por consanguinidade cruzes. Proporção de machos diploides (cerca de 25%) e mapeamento de QTL usando descendentes produzidos por rainhas sib-acoplado sugerem a existência de dois loci CSD em V. emeryi. As fêmeas são heterozigotas em pelo menos um dos dois loci CSD, Considerando que os machos são homozigotos em todos os loci. Genótipos são representados por letras do alfabeto. Esta figura foi modificada [Miyakawa et al 2018]7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Órgãos reprodutores masculinos internos de alopecia machos haploides e diploides em V. emeryi. Morfologias dos testículos e outros órgãos reprodutivos internos dissecados fora dos machos haploides androgenética (A). Esperma (tecido fibroso) pode ser vista nos testículos dos machos haploides (B e C). Cor azul marca núcleos corados por DAPI, e marcas de cor vermelha F-Actina manchado por diversos TRITC conjugados faloidina em B, C e E. (a) glândulas acessórias; (t) testículos; (v) canal deferente; (g) genitália externa. Morfologias dos órgãos reprodutivos internos dissecados fora dos machos diploides (D). Testículos e esperma de machos diploides nunca foram observadas (D e E, N >> 30). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo demonstra os protocolos que podem ser usados para induzir a endogamia cruzes e avaliar a ocorrência de endogamia na formiga V. emeryi. Nos experimentos, genotipagem dos indivíduos utilizados para cruzes é necessária para garantir que a endogamia cruzes foram bem sucedidos. No entanto, a eficácia destes testes de cruzamento é evidente como os machos diploides podem ser produzidos durante todo o ano, enquanto os machos haploides só podem ser produzidos no outono em campo e o laboratório6. Sib-acoplado rainhas começam a produzir descendentes machos imediatamente após a passagem. Não morfológicas fenotípicas foram observadas diferenças entre os machos haploides e diploides em V. emeryi6,7. No entanto, diploide masculina V. emeryi quase invariavelmente não conseguem desenvolver os testículos. Na ausência de marcadores genéticos para testar o parentesco genético de pares usados para testes de cruzamento, o potencial reprodutivo da prole masculina pode ser usado para inferir se a consanguinidade ocorreu. No entanto, deve notar-se que os machos produzidos em consanguinidade cruzes não são sempre estéril em outras espécies de himenóptera15,16,17.
O primeiro passo crítico para o sucesso do protocolo é a manutenção das colônias bem alimentadas, como alimentá-los após a coleta de campo irá aumentar a probabilidade de se obter um número suficiente de reproductives por cruzes. No V. emeryi, relatou-se uma correlação positiva entre a nutrição e a produção de rainhas longimanus, que são as rainhas, usadas para a endogamia cruzes10. Em insetos sociais, pequenas colônias ou colônias na saúde pobre, tendem a não produzir novos reproductives18. Portanto, é importante coletar colônias maduras do campo e proporcionar-lhes quantidades adequadas de alimentos nutritivos para experimentos usando reproductives novos.
O segundo passo fundamental é manter os trabalhadores, reprodutivos e poucas larvas ou pupas juntos durante os testes de cruzamento e para manter a colônia experimental travessia no mesmo estado que o de uma colônia normal até cruzamento é concluído (por uma semana a um mês). É difícil manter colônias que devem ser utilizados para cruzar testes sem trabalhadores por mais de 3 dias porque os machos são incapazes de se alimentar e devem ser alimentados pelos trabalhadores. Sob tais condições não naturais, a taxa de sucesso de endogamia cruzes era extremamente baixa6.
Há duas limitações relativas à aplicação desses protocolos para outras espécies de formigas. Em primeiro lugar, as pistas para induzir cruzes são espécies específicas. É relativamente fácil induzir o laboratório cruzes na V. emeryi desde intracolônia acasalamento sem voo ocorre na natureza. No entanto, muitas espécies de formigas têm evoluído rituais de acasalamento que envolvem voos nupciais durante qual novo companheiro de rainhas e machos durante ou após o voo19. Portanto, é importante elucidar os gatilhos que induzem a travessia em cada espécie em um ambiente de laboratório. Por exemplo, na parasita formiga Acromyrmex ameliae, o principal estímulo para desencadear voos nupciais parece ser luz20. A segunda limitação é que, em alguns casos, os machos diploides produzidos por consanguinidade cruzes não podem ser coletados, como eles são inviáveis ou mortos pelos trabalhadores, porque eles não trabalham e/ou não têm ou baixo potencial reprodutivo, e são, portanto, um grande custo para a colônia do objetiva espécie21,22,23. Felizmente, diploide V. emeryi machos não são mortos pelos trabalhadores e vivem até que morrem naturalmente, o que sugere que eles não são frequentemente encontrados na natureza e uma estratégia para excluir os machos diploides colônias não evoluiu nesta espécie.
Em comparação com outras espécies de formigas que empregam arrhenotokous partenogênese para reproduzir (Figura 1A), podemos assumir que há certas vantagens para produção experimental de endogamia cruzes usando V. emeryi por androgenesis como o endogamia cruzes são geneticamente equivalentes a um cruzamento clássico. Com efeito, o sistema permitiu-nos projetar experimentos para investigar os genes da sexo-determinação, mecanismos moleculares e realizar estudos funcionais nesta espécie6,7.
Em resumo, métodos para conduzir a endogamia atravessa e para avaliar o sucesso da resultante cruzes têm sido descritos no V. emeryi. Estes protocolos são essenciais para experiências dirigidas a compreender a base genética e molecular de sistemas de determinação do sexo na Hymenoptera.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos Sr. Taku Shimada, o delegado de AntRoom, Tóquio, Japão, fornecendo-nos com a sua fotografia de V. emeryi reproductives. Este projeto foi financiado pela sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS) bolsa de pesquisa para jovens cientistas (16J00011) e concessão de auxílio para jovens cientistas (B)(16K18626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plaster powder | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Charcoal, Activated, Powder | Wako | 033-02117,037-02115 | |
| Slide glass | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Dry Cricket diet | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Brown shuger | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Styrene Square-Shaped Case | AS ONE | Any size | Size varies by number of ants |
| Incbator | Any brand can be used | ||
| Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B | TAITEC | 0014035-000 | |
| 1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom | WATSON | 131-715CS | |
| Ethanol (99.5) | Wako | 054-07225 | |
| Stereoscopic microscope | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Forseps | DUMONT | 0108-5-PO | |
| Chelex 100 sodium form | SIGMA | 11139-85-8 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| -Cellstain- DAPI solution | Dojindo Molecular Technologies | D523 | |
| ABI 3100xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8 | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica HyDTM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Directly contact the constructor formore informations. |
References
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