Summary
在本议定书中, 介绍了进行近亲繁殖杂交的方法, 并对这些杂交的成功进行了描述, 为蚂蚁Vollenhovia emeryi。这些协议对于旨在了解膜翅目中性别决定系统的遗传基础的实验是很重要的。
Abstract
在 hymenopteran 模型生物蜜蜂中, 在蜜蜂中广泛研究了性别决定级联的遗传和分子成分。然而, 对于其他非模型 hymenopteran 类群中发现的性别决定机制, 如蚂蚁, 知之甚少。由于 hymenopteran 物种进化的生命周期的复杂性质, 在实验室中很难维持和进行实验性的交叉。在这里, 我们描述了进行近亲繁殖杂交的方法和评估这些杂交在蚂蚁Vollenhovia emeryi的成功。利用v. emeryi在实验室诱导近亲繁殖, 相对简单, 因为该物种具有独特的生物学特性。具体地说, 这个物种产生雄性雄性, 而雌性 reproductives 表现出翅膀多态性, 简化了遗传杂交中表型的识别。此外, 评估近亲繁殖的成功是直接的, 因为雄性可以连续生产的近亲繁殖十字架, 而正常的雄性只出现在一个明确定义的生殖季节在田间。我们的协议允许以v. emeryi为模型, 研究蚂蚁物种性别决定系统的遗传和分子基础。
Introduction
群居 Hymenopteran 类群, 如蚂蚁和蜜蜂, 进化出了一个 haplodiploid 的性别决定体系, 在这种系统中, 异型在一个或多个补充性决心 (CSD) 的个体成为女性, 而那些是同性恋者或 hemizygous成为男性 (图 1A)1。
基因和分子成分参与性别决定级联已被很好的研究在蜜蜂, api 蜜蜂, hymenopteran 模型生物2,3,4。最近的比较基因组调查显示, 蚂蚁和蜜蜂在性别决定途径中分享了许多假定的同系物, 如最初的性别决定基因, csd5。然而, 这些同系物的功能保护的证据仍然缺乏蚂蚁。
为了解决这一问题, 必须发展近亲繁殖线, 因为它们对遗传图谱和分子研究是必不可少的。然而 , 由于生命周期的复杂性质已经演变 , 很难在实验室中维持和进行实验叉。
在这里, 我们使用Vollenhovia emeryi作为一个模型, 以调查的遗传和分子基础的性别决定系统的蚂蚁6,7。本种的近亲繁殖系是在蚂蚁6中首次为与性别决定有关的性状的数量性状基因位点 (QTL) 的连锁映射而开发的。此外, 还研究了7的分子性别测定级联。这个物种进化出了一种不寻常的繁殖系统, 既使用了孤雌生殖和雄核发育 (图 1B)8,9。大多数新的皇后和男性是无性生产的母体和父系基因组, 分别。此外, 工人和一些皇后生产性8。这种生殖系统特别适合于遗传学研究, 因为近亲交配产生的杂交后代使用性生产的皇后和雄性的基因等同于传统的回交。由于性生产的皇后不同形态上的皇后从母体基因组10 (图 1B), 进行和评估近亲繁殖交叉是大大简化了使用这种方法。
本文建立了交叉试验实验菌落的确定方法, 利用全同胞对对近亲繁殖交叉口的应用, 并利用群体成员的基因分型和男性后代的解剖评价这些杂交的成功与否生殖器在 v. emeryi中被描述。
无论采用何种生殖系统, 近交交叉的应用往往是任何研究膜翅目性测定系统的必要的第一步。例如, 在Cardiocondyla obscurior, 在实验室里, 10 代全同胞交配后几乎完全没有双雄雄性, 这表明了惩教署所在地11的缺席。有可能预测惩教署基因座的数目, 从近亲交配产生的男性比例6,12,13。
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Protocol
1. 在实验室中Emeryi殖民地的实地收集和维持
注: 在日本各地, 腐烂的原木和腐烂的树木 branchesin 次生森林中发现了v emeryi的巢。这一物种显示了两种类型的殖民地,即(1) 只生产长翅皇后和 (2) 殖民地主要生产短翅皇后除了小数目长翅皇后8,14。在本议定书中, 我们收集了日本石川县的后一类殖民地。
- 在初夏收集五 emeryi殖民地。
注意: 为了在生殖季节获得足够数量的性个体, 有300多个个体的菌落是首选。 - 使用吸引器将蚂蚁标本从收集的树枝转移到人工石膏窝 (图 2, 左)。
- 在16:8 小时的光/暗循环下, 在人工巢中维持25摄氏度的菌落。提供自来水与洗涤瓶湿石膏。
- 添加约100毫克的干板球粉包裹在铝箔和一个红糖水填充提示 (20 µL 提示), 直到新的 reproductives (f1翅皇后和 F1男性) 出现。
2. 实验实验室交叉
注: 新的 reproductives 开始出现从夏末到秋季 (图 3)。长翅皇后产有性, 短翅皇后生产无性和有母体基因组 (图 1)。使用长翅皇后和男性的近亲繁殖十字架。
- 为了阻止个体移动, 在恒定的环境房间里安置殖民地在4°c 15 分钟。
- 用钳子在立体显微镜下取出30名工人的小腿, 并将其转移到新的小石膏窝 (图 2, 右), 用于近亲繁殖交叉。
注: 腿被移除, 以区分目前的工人, 将产生的工人, 随后的近亲繁殖交叉。 - 在含有工人的石膏窝中加入3-4 幼虫或蛹。
注意: 工人们在0号皇后--较少的殖民地中展示探索活动。幼虫或蛹可以有效地吸引这些工人和新的 reproductives 在中心的殖民地在交叉试验。因此, 保持实验群体的条件接近正常群体。 - 将长翅皇后和男性转移到在步骤2.3 为近亲繁殖十字架准备的石膏巢。
- 在16:8 小时的光/暗循环下, 将菌落保持在25摄氏度以下, 如1.3 所述, 直到皇后失去翅膀产卵。
注意: 这需要一个星期到一个月。 - 每天在立体显微镜下检查实验菌落。在1个子代之间进行近亲繁殖后, 卵可以在立体显微镜下观察到。
- 在 f1皇后开始产卵, 去除 f1男性和幼虫或蛹增加在步骤2.3 从巢, 避免混合 f1代 (男性和女性用于近亲繁殖十字架) 和 f2代 (后代从近亲繁殖十字架生产)。
注意: 如果在这个群体中很少有雄性, 那么在同一实验群中, 就有可能诱导近亲交配, 使用一个雄性和1到3个皇后。 - 保持殖民地在1.3 所描述的相同的 conditionsas, 直到 F2的后代出现。
注: 将 f1皇后和 f2的后代转移到新的更大的石膏巢 (图 2, 左) 为长期殖民地保留。
3. 对近亲繁殖成功的评估
- 父母代的 DNA 提取与基因分型 (F0)
- 用镊子取出一条 F0皇后的腿, 将腿转移到1.5 毫升微细, 其中含有100µL 螯合剂。
- 在立体显微镜下, 用镊子将300µL 超纯水的玻璃盘子中的女性腹部解剖, 并分离出含有交配雄性精子的蝗受精囊。
- 剥去蝗受精囊的组织, 用昆虫引脚将精子从雌性组织中分离出来。
注: 为便于从蝗受精囊提取精子, 在解剖前一天内将女性标本存放在100% 乙醇。 - 使用微, 将精子转移到含有100µL 螯合剂的1.5 毫升微细中。
- 分别在步骤3.1.1 和3.1.3 中制备的 F0皇后和精子的孵化样品, 在95°c 为20分钟. 闪光离心机微细和贮存在4摄氏度。
- 基因型所有样品使用的方法描述在别处4。
- 用于近亲繁殖杂交的一对蚂蚁的 DNA 提取 (F1)
- 在确认1皇后交配后, 用她的棚子翅膀或一条中腿和基因型, 用上面3.1 节中描述的相同方法提取皇后的 DNA。
- 用一条腿提取 F1雄性的 DNA, 并使用上文3.1 节所述的相同方法对其进行基因型。
注: 样品在 dna 提取前可储存在100% 乙醇, 螯合剂中的 dna 可在4摄氏度内储存两个月。
- 近交杂交生产男性生育能力的评价
注意: 从近亲繁殖杂交产生的倍雄性通常是无菌的。- 用镊子解剖400µL 的 PBS 溶液, 在玻璃盘内进行内部生殖器官分析。
- 使用微移除 PBS 并添加4% 多聚甲醛 (粉煤灰)。
- 在室温下 (15-25 °c), 通过在粉煤灰中孵化30分钟来修复组织。
- 用微, 用400µL 的 PBS 冲洗组织5次。
- 稀释 4 ', 6-diamidino 2-苯基吲哚 (DAPI) 溶液到1µg/毫升在 PBS。
- 删除 PBS, 并添加大约300µL 这个稀释 DAPI 染色溶液的组织。
- 在室温下 (15-25 °c) 在暗条件下孵化15分钟。
- 用5倍于 PBS 的400µL 冲洗组织, 用镊子将组织转移到滑动玻璃中心。
- 在含有四甲基罗丹明 (TRITC) 共轭罗丹明的安装培养基上安装组织。
- 用20X 或63X 物镜观察共焦激光扫描显微镜样品。
- 使用 405 nm 励磁激光器和混合探测器在 410-530 nm DAPI 检测。
- 使用 561 nm 励磁激光器和混合探测器在 565-650 nm TRITC 检测。
- 使用400赫兹 (400 行/秒) 的扫描速度, 分辨率为 1024 x 1024 像素。
- 使用软件平台捕获图像。
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Representative Results
利用 f0和 f1代的微卫星分析结果表明, 近交杂交成功产生 (图 4)6。由于近亲繁殖十字架 , 交配皇后在建立实验叉殖民地的一个月之内获得。一个处所 (27.1 8.91% SD) 所有子代 (F2) 从近亲繁殖十字架是男性, 而剩下的人是女性 (工作者和女王)6。利用近亲繁殖杂交后代的 QTL 图谱表明, 近交杂交产生的雄性在两个惩教点 (CSD1 和 CSD2图 5) 中是双、纯合的, 而由近亲繁殖杂交产生的雌性 (工人) 是双倍的,异型至少在一个惩教署所在地6。
解剖的单倍体男性发现睾丸和精子, 如预期 (图 6A-6C)。然而, 在雄性动物中, 精子从未被观察到, 这表明在近亲繁殖的十字架上生产的雄性在v. emeryi6中是无菌的.此外, 双雄雄性的睾丸没有发育 (图 6D-6E)。
图 1.典型的生殖系统 (A) 膜翅目和非典型生殖系统涉及雄核发育和孤雌生殖 (B) v. emeryi.通常情况下, 雌性 (工人和皇后) 是由受精的双倍卵发育而成的, 雄性发育于含有半数母体基因组的未受精单倍体卵 (A)。在v. emeryi, 无菌工人和一些长翅皇后 (LWQ) 发育从受精的双卵, 而短翅皇后 (SWQ) 发展与几乎完整的母体基因组从未受精的双卵 (孤雌生殖)。雄性从不继承母体基因组, 但却是父亲的克隆人 (雄核发育) (B)。这个数字已从 [宫川等2018]7修改。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.实验建立了五 emeryi殖民地.野外采集后, 菌落被转移到人工石膏窝中并保存在实验室中。一个大的石膏巢 (左) 为维护被收集的殖民地准备, 而一个更小的石膏巢 (右) 准备为实验性近亲繁殖十字架。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.新的五 emeryi reproductives 在繁殖季节出现.成熟和良好的 fedcolonies 倾向于生产长翅皇后 (LWQ) 与父母基因组除了短翅皇后 (SWQ) 只承担母体基因组 (图 1B)。Taku 岛先生的照片。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.0和 f1代的近交杂交和微卫星基因型设计.使用11个微卫星标记在以前的研究中开发了6,8,9, 女性和男性的父母世代 (F0) 显示了不同的基因型。用于实验交叉的雌性和雄性的基因型 (F1) 分别继承了父母和父亲的基因型, 表明女性与他们的兄弟成功地交叉, 其中女性分享一半他们的基因 组。数字表明微卫星轨迹L-5PCR 产品的长度, 这是用于基因分型6,8,9,10的标记之一。这一数字已根据 [宫川和 Mikheyev 2015]6的数据进行了说明。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5.近交杂交后代中两个惩教位点 (CSD1 和 CSD2) 基因型的研究.双雄动物的比例 (约 25%) 和 QTL 图谱使用由同胞交配皇后的后代, 表明存在两个惩教署的基因座在v. emeryi。雌性在异型的两个位点中至少有一个, 而雄性在所有的基因座上都是纯合的。基因型由字母表的字母表示。这个数字已从 [宫川等2018]7修改。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6.雄性单倍体的雄性内生殖器官和emeryi v的雄性.从雄性单倍体雄性 (A) 中解剖出睾丸和其他内部生殖器官的形态。在单倍体雄性 (B 和 C) 的睾丸中可以看到精子 (纤维组织)。蓝色标记细胞核染色的 DAPI, 红色的标记 F 肌动蛋白染色的四甲基罗丹明 (TRITC) 共轭罗丹明在 B、C 和 E. (a) 附属腺体;(t) 睾丸;(五) 输精管;(g) 外生殖器。从雄性 (D) 中解剖出的内部生殖器官的形态。男性的睾丸和精子从未被观察到 (D 和 E, N > > 30)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本文论证了可用于诱导近亲繁殖杂交的协议, 并对emeryi中近亲繁殖的发生进行了评价。在实验中, 用于交叉的个体的基因分型是确保近亲繁殖杂交成功的必要条件。然而, 这些交叉试验的有效性显然是显而易见的, 因为双雄动物全年都可以生产, 而单倍体雄性只能在秋季在田间和实验室6生产。同胞交配皇后开始在交叉后立即产生雄性后代。在v. emeryi6,7中, 两倍和单倍体雄性之间没有观察到形态学差异.然而, 倍emeryi几乎总是不能发展睾丸。在没有基因标记用于检测交叉试验对的遗传相关性的情况下, 雄性后代的生殖潜能可以用来推断是否发生近亲繁殖。然而, 应该指出的是, 在近亲繁殖杂交中生产的雄性在其他 hymenopteran 物种15、16、17中并不总是不育的。
该议定书取得成功的第一个关键步骤是维持养好的殖民地, 因为在野外采集后喂养它们将增加获得足够数量的 reproductives 的可能性。在v. emeryi, 在营养和长翅皇后的生产之间有一个正相关的报告, 是用于近亲繁殖十字架的皇后10。在社会昆虫, 小殖民地, 或健康较差的殖民地, 往往不会产生新的 reproductives18。因此, 重要的是从田间收集成熟的殖民地, 并为他们提供足够数量的营养食品的实验使用新的 reproductives。
第二个关键步骤是在交叉试验期间保持工人、生殖和少量幼虫或蛹在一起, 并维持与正常菌落相同的状态的实验性杂交蚁群, 直到交叉口完成 (一周到一个月)。在3天内, 由于雄性无法养活自己, 必须由工人喂养, 所以很难维持在没有工人的情况下进行交叉试验的殖民地。在这种不自然条件下, 近交杂交成功率极低6。
这些协议在其他蚂蚁物种中的应用有两个方面的限制。首先, 诱导十字架的线索是特定物种。由于在自然界中不发生飞行的群体内交配, 在v. emeryi诱导实验室交叉相对容易。然而 , 许多蚂蚁物种进化了交配仪式 , 其中包括在19航班期间或之后新的皇后和雄配的婚礼飞行。因此, 重要的是要阐明诱导跨越在每个物种在实验室设置的诱因。例如, 在寄生蚂蚁Acromyrmex ameliae, 触发婚礼飞行的主要刺激措施似乎是轻20。第二个限制是, 在某些情况下, 由于他们不工作和/或没有或没有或低的生殖潜力, 在某些情况下, 由于他们是 inviable 或杀害的交配十字架生产的双倍的雄性, 因而是一个主要费用对殖民地目标物种21,22,23。幸运的是, emeryi的雄性不会被工人杀死, 他们活到死的自然, 这表明他们不是经常遇到的性质和一项战略, 排除从殖民地的雄性动物没有进化在这个物种。
与使用 arrhenotokous 孤雌生殖繁殖的其他蚂蚁物种相比 (图 1A), 我们可以假设, 通过雄核发育来生产实验性近亲繁殖杂交十字架具有一定的优势emeryi近亲繁殖十字架的基因等同于经典的回交。事实上, 该系统使我们能够设计实验来调查性别决定基因, 分子机制, 并进行功能研究在这个物种6,7。
总之, 在v. emeryi中描述了进行近亲繁殖杂交的方法, 并对由此产生的十字架的成功进行评价。这些协议对于旨在了解膜翅目中性别决定系统的遗传和分子基础的实验是必不可少的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢日本东京 AntRoom 的代表 Taku 岛先生向我们提供了他的五 emeryi reproductives 的照片。该项目由日本促进科学学会 (16J00011) 为青年科学家研究金和资助青年科学家 (B) (16K18626) 提供资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plaster powder | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Charcoal, Activated, Powder | Wako | 033-02117,037-02115 | |
| Slide glass | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Dry Cricket diet | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Brown shuger | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Styrene Square-Shaped Case | AS ONE | Any size | Size varies by number of ants |
| Incbator | Any brand can be used | ||
| Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B | TAITEC | 0014035-000 | |
| 1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom | WATSON | 131-715CS | |
| Ethanol (99.5) | Wako | 054-07225 | |
| Stereoscopic microscope | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Forseps | DUMONT | 0108-5-PO | |
| Chelex 100 sodium form | SIGMA | 11139-85-8 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| -Cellstain- DAPI solution | Dojindo Molecular Technologies | D523 | |
| ABI 3100xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8 | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica HyDTM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Directly contact the constructor formore informations. |
References
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