Summary
Nous présentons une procédure pour la culture de plusieurs souches de Magnetospirillum dans deux différents types de milieux de culture. Magnetospirillum gryphiswaldense souche MSR-1 est cultivée en liquide et en gradient de concentration2 O milieu semi solide alors que M. magneticum souche AMB-1 et M. magnetotacticum souche MS-1 sont cultivés en milieu liquide.
Abstract
Magnétostatiques bactéries sont Gram négatifs, mobiles, principalement aquatiques procaryotes omniprésents dans les habitats d’eau douce et marins. Ils sont caractérisés par leur capacité de magnétosomes biomineralize, qui sont magnétiques taille nanométrique cristaux de magnétite (Fe3O4) ou greigite (Fe3S4) entouré d’une membrane lipidique bi-couche, dans leur cytoplasme. Pour la plupart des bactéries magnétotactiques connus, magnétosomes sont assemblés dans les chaînes dans le cytoplasme, ce qui confère un moment magnétique permanent aux cellules et obligeant à aligner passivement avec les champs magnétiques externes. En raison de ces caractéristiques, les bactéries magnétotactiques ont un grand potentiel pour des applications commerciales et médicales. Cependant, la plupart des espèces sont microaérophiles et ont des exigences spécifiques de O2 concentration, ce qui les rend plus difficiles à se développer régulièrement que beaucoup d’autres bactéries comme Escherichia coli. Nous présentons des protocoles détaillés pour la culture de trois des souches de bactéries magnétotactiques, tous appartenant au genre Magnetospirillumplus largement étudiés. Ces méthodes permettent un contrôle précis de la concentration de2 O mis à la disposition de la bactérie, afin de s’assurer qu’ils poussent normalement et synthétisent les magnétosomes. Croissance des bactéries magnétotactiques pour poursuivre ses études à l’aide de ces procédures ne nécessite pas l’expérimentateur d’être un expert en microbiologie. Les méthodes générales présentées dans cet article peuvent aussi servir à isoler et à la culture des autres bactéries magnétotactiques, bien qu’il soit probable que composition chimique de la croissance médias devront être modifiées.
Introduction
Bactéries magnétotactiques (MTB) représentent un large éventail d’omniprésents dans les habitats aquatiques d’eau douce et1gramnégatives procaryotes. Ces bactéries ont la capacité de produire les cristaux magnétiques en magnétite (Fe3O4) ou greigite Fe3S4, qui sont le plus souvent assemblés dans des chaînes à l’intérieur des cellules. Ce motif structural particulière est due à la présence de plusieurs protéines spécifiques agissant aussi bien dans le cytoplasme de la bactérie et sur la membrane lipidique qui entoure chaque cristal2. Chaque cristal individuel et ses vésicules de membrane environnante est appelé un magnétosomale et est variant entre 30 et 50 nm de Magnetospirillum espèces3. En raison de la configuration de la chaîne de magnétosomes, ces bactéries possèdent un moment magnétique permanent qui les rend aligner passivement des champs magnétiques appliqués extérieurement. Par conséquent, ces bactéries activement nagent le long des lignes de champ magnétique, en tant que micro-boussoles automoteurs vraisemblablement à plus localiser efficacement les conditions les plus favorables (e.g., concentration de O2 ) pour la croissance.
Une propriété intéressante de m. tuberculosis est leur capacité à réguler la chimie et la cristallographie de leurs cristaux magnétosomale. La plupart des souches produisent des cristaux relativement haute pureté de magnétite ou greigite, bien que certains biomineralize les deux minéraux4. Dans tous les cas, les bactéries sont capables de contrôler avec précision la taille et la forme de leurs cristaux domaine magnétique unique. C’est ce qui explique pourquoi un grand nombre de recherches est entrepris pour développer une meilleure compréhension de comment MTB effectuer ce processus de biominéralisation. Compréhension de ce processus pourrait permettre aux chercheurs de travailler-faire des nanocristaux magnétiques pour de nombreuses applications commerciales et médicales.
Un obstacle de taille à des recherches approfondies sur les VTT a été la difficulté de leur culture en laboratoire. La plupart des espèces, y compris les souches utilisées dans ce travail, sont obligatoirement microaérophiles lorsqu’il est cultivé avec O2 comme accepteur terminal d’électron. C’est ce qui explique pourquoi ces bactéries se trouvent le plus souvent à la zone de transition entre les conditions oxiques et anoxiques (l’interface oxic-anoxiques, OAI). Cela montre clairement que les VTT ont O2 concentration aux exigences précises qui doit évidemment être pris en compte lorsqu’ils établissent des milieux de culture pour ces organismes. De plus, la grande diversité existante de VTT implique que différentes souches aura besoin de différents types de gradients chimiques et d’éléments nutritifs pour une croissance optimale.
Dans ce travail, nous décrivons les méthodes pour la culture de trois du plus largement étudié VTT : Magnetospirillum magneticum (souche AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) et M. gryphiswaldense (MSR-1). Ces espèces phylogénétiquement appartiennent à la classe Alphaproteobacteria du phylum des Proteobacteria , sont hélicoïdales en morphologie et possèdent un flagelle polaire à chaque extrémité de la cellule. Nous fournissons les protocoles pour la culture de la souche MSR-1 en liquide et en O2 gradient de concentration semi-solide médias, sur la base des recettes moyennes publiées antérieurement5,6. Nous présentons également un protocole détaillé pour la culture de souches AMB-1 et MS-1 mis à jour le magnétique Spirillum croissance moyenne (MGSM)7.
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Protocol
1. installation de la Station de2 N
Remarque : Choisissez le diamètre intérieur du tuyau pour qu’il peut être relié au réservoir de gaz avec fuite minimale et que le cylindre d’une seringue de 1 mL en plastique s’adapte étroitement dans ce tube. Une illustration de la complète N2 station de gazage est fournie à la Figure 1.
- En toute sécurité installer un réservoir de gaz N2 à proximité d’un banc sur lequel il y a suffisamment d’espace pour mettre en place la station2 N (une longueur d’environ 50 cm).
- Raccorder à la citerne un morceau de tuyau assez longtemps pour atteindre la zone où sera construite la station. Si nécessaire, appliquez du ruban téflon à la sortie du réservoir pour éviter toute fuite.
- Pour construire une station capable de propagation cinq bouteilles de milieu en même temps, coupez quatre morceaux de tuyau d’environ 5 cm de longueur.
- Assemblez les morceaux de tube en ligne avec trois raccords en plastique triangulaire en forme de T. Connectez une extrémité de cette ligne pour le morceau de tuyau à la sortie du réservoir N2 grâce à un raccord supplémentaire en forme de T. Ajouter un coude de 90° à l’autre extrémité.
- Utiliser du ruban pour fixer la structure d’une tige métallique horizontale placée à environ 30 cm au-dessus du banc.
- Connectez cinq morceaux de tuyau (environ 20 cm de longueur) sur les sorties libres du mobilier installé à l’étape 1.4.
- Retirer les pistons de seringues en plastique de cinq 1,0 mL et couper l’extrémité la plus grande de ces seringues (i.e., la face du côté de l’aiguille), gardant seulement la partie graduée. Remplissez ces seringues avec du coton, sans trop serrer.
- Insérer les seringues dans les pièces verticales de 20 cm de tube et utiliser de l’eau savonneuse pour s’assurer qu’il n’y a pas de fuite lorsque N2 circule.
- Enlever les bouchons des cinq aiguilles 25 G (0,5 mm x 25 mm) et insérer ces aiguilles dans les pièces de 10 cm de tube mince. Veiller à ce que les aiguilles s’adapter étroitement dans la tubulure.
ATTENTION : Il existe un risque de coups de couteau au cours de cette étape. Faites-le lentement et soigneusement. - Fixer les aiguilles élaborées en étape 1.9 pour les seringues de la N2 . Veiller à ce que N2 circule dans toutes les cinq lignes et maintenir la station en stand by.
2. croissance moyenne préparation
Remarque : Il est possible d’ajuster la quantité de milieu préparé, comme il est expliqué dans les étapes 2.1.2, 2.2.2 et 2.3.8. La quantité d’eau et de produits chimiques mises en oeuvre doit juste être ajustée proportionnellement. Le rôle de toutes les composantes moyennes est décrite dans supplémentaire tableau 1.
- Préparation du milieu de culture liquide MSR-1
- Préparer une solution de citrate ferrique 10 mM en ajoutant 100 mL d’eau distillée désionisée 0,245 g de citrate ferrique. Faire chauffer et remuer pour bien dissoudre, jusqu'à un jaune à l’orange clair solution est obtenue. Stériliser la solution en utilisant une norme cycle (au moins 15 min exposition à 121 ° C) et ensuite stocker cette solution-mère à température ambiante dans l’obscurité.
Remarque : Jeter la solution de citrate ferrique lorsqu’un précipité devient évident. - Dans un bécher contenant 1 L d’eau déionisée distillée, ajoutez le code suivant dans l’ordre tout en remuant : 1,0 mL de l’oligo-élément complément solution, 0,1 g de KH2PO4, 0,15 g de MgSO4.7 H2O, 2,38 g de HEPES, 0,34 g NaNO3 , extrait de 0,1 g de levure, 3,0 g de peptone de soja de haricot, 4,35 mL de lactate de potassium (solution à 60 % w/w) et 5 mL de la solution mère de citrate de Fe (III) de 10 mM.
Remarque : Ajuster les quantités proportionnellement si une petite quantité de milieu de culture est nécessaire. Pour une station de2 N capable de propagation cinq bouteilles en même temps, tel que celui construit à l’étape 1 du présent protocole, préparer 300 mL de milieu.
ATTENTION : Trace minérale et stock de citrate de Fe (III) des solutions doivent rester stérile. Pour éviter toute contamination, utilisez technique stérile standard lorsque vous utilisez les (flamme ouverte dessus des bouteilles à l’aide d’un bec Bunsen) et pointes de pipette stérile pour la distribution. Conserver la solution minérale dans un réfrigérateur à 4 ° C. - Après l’addition de tous les produits chimiques, ajuster le pH à 7.0 avec la solution de NaOH 1 M. Diluer le milieu fraîchement préparé dans des flacons de sérum de 125 mL. Verser 60 mL de milieu dans chaque bouteille.
- N2 , dans le milieu pendant 30 min enlever le dissous O2, Bubble, utilisant le petit tuyau relié à la gare de2 N décrite à l’étape 1. Placer un bouchon en butyle-caoutchouc sur le dessus de chaque bouteille, laissant une petite ouverture pour permettre à l’excès de gaz à la sortie de la bouteille.
ATTENTION : La mousse peut-être former tout en bulles avec N2. Régler le débit de gaz en conséquence afin d’éviter la production de mousse. - Sertissage sceller chaque bouteille avec le bouchon préparé et un joint d’étanchéité en aluminium. Le joint d’étanchéité en aluminium assure que la bouteille reste scellée pendant le reste du protocole.
- Débranchez les aiguilles et le tube mince de la station de2 N et remplacez-les par des seringues propres (1po, ≤ 23 G). Régler les vannes du réservoir N2 pour qu’un léger courant continu de gaz sort de la cuve (environ 50 mL/min).
Remarque : Aiguilles supérieure à 23G peuvent laisser des trous unsealable permanentes du bouchon. - Insérez l’un des aiguilles connectés au réservoir N2 dans un flacon de milieu, à travers le bouchon en caoutchouc. Insérer immédiatement une autre aiguille propre dans le même flacon. Répétez cette étape pour les autres bouteilles et laisser couler2 N pendant environ 30 min remplacer l’air dans les bouteilles par N2.
- Débrancher une bouteille de la station de2 N en retirant l’aiguille correspondante. Attendez quelques secondes jusqu'à ce que la pression dans la bouteille de milieu diminue à la pression atmosphérique et retirer l’aiguille de seconde. Répétez cette étape pour toutes les bouteilles restantes.
ATTENTION : Pour éviter que O2 réintègrent les flacons de milieu de culture après étape 2.1.4, effectuez les étapes 2.1.4 - 2.1.8 en succession rapide. Si toutes les bouteilles ne peut pas être connectés à la station2 de N dans le même temps, procéder à des mesures 2.1.4-2.1.8 pour la première série de bouteilles et puis répétez ces étapes pour les bouteilles restantes. - Stériliser les biberons. Laissez-les refroidir à température ambiante pendant la nuit et les stocker à température ambiante par la suite.
- Préparer une solution de citrate ferrique 10 mM en ajoutant 100 mL d’eau distillée désionisée 0,245 g de citrate ferrique. Faire chauffer et remuer pour bien dissoudre, jusqu'à un jaune à l’orange clair solution est obtenue. Stériliser la solution en utilisant une norme cycle (au moins 15 min exposition à 121 ° C) et ensuite stocker cette solution-mère à température ambiante dans l’obscurité.
- Préparation du milieu de culture liquide pour AMB- 1et/MS-1
- Préparer une solution quinates ferrique de 10 mM. Tout d’abord dissoudre 0,19 g de l’acide quinique dans 100 mL d’eau distillée désionisée, puis ajouter 0,27 g de FeCl3.6H2O. remuer pour dissoudre, jusqu'à l’obtention d’une solution claire rouge foncée. Autoclave la solution en utilisant un cycle standard (exposition d’au moins 15 min à 121 ° C).
NOTE : Stocker la solution ferrique quinate à température ambiante dans l’obscurité comme une solution stérile. Jeter la solution quand un précipité devient évident. - Dans un bécher contenant 1 L d’eau déionisée distillée, ajoutez le code suivant dans l’ordre tout en remuant : 10,0 mL de la solution de supplément de vitamine, 5,0 mL de la solution de supplément minéral trace, 0,68 g de KH2PO4, 0,848 g du succinate de sodium dibasique hexahydraté, 0,575 g de di-Sodium tartrate dihydraté, 0,083 g d’acétate de Sodium trihydraté, 0,45 mL de 0,1 % solution aqueuse résazurine, 0,17 g NaNO3, 0,04 g d’acide ascorbique et 3,0 mL de la solution mère quinate Fe (III) de 10 mM.
Remarque : Ajuster les quantités proportionnellement si une petite quantité de milieu de culture est nécessaire. Pour une station de2 N capable de propagation cinq bouteilles en même temps, tel que celui construit à l’étape 1 du présent protocole, préparer 300 mL de milieu.
ATTENTION : Vitamine, oligo-élément et Fe (III) les solutions mères quinates doivent rester stérile. Pour éviter toute contamination, utiliser une technique stérile standard et pointes de pipette stérile lors de la distribution. Stocker les solutions de minéraux et de vitamines dans un réfrigérateur à 4 ° C. - Après l’addition de tous les produits chimiques, ajuster le pH à 6,75 à l’aide de la solution de NaOH 1 M.
- Reportez-vous aux étapes 2.1.3-2.1.9 pour le reste du protocole.
- Préparer une solution quinates ferrique de 10 mM. Tout d’abord dissoudre 0,19 g de l’acide quinique dans 100 mL d’eau distillée désionisée, puis ajouter 0,27 g de FeCl3.6H2O. remuer pour dissoudre, jusqu'à l’obtention d’une solution claire rouge foncée. Autoclave la solution en utilisant un cycle standard (exposition d’au moins 15 min à 121 ° C).
- Préparation du milieu semi-solide pour MSR-1
- Préparer un 0,5 M phosphate solution tampon pH 7.0 en dissolvant 3,362 K2HPO4 et 4,178 g de KH2PO4 dans 100 mL d’eau distillée désionisée. Vérifiez si le pH 7.0 et ajuster le pH légèrement avec KH2PO4 ou NaOH si nécessaire. Conserver la solution dans un flacon de verre scellé (préférable au plastique afin d’éviter l’échange de l’oxygène).
- Préparer 100 mL d’une solution chlorhydrique de 0,02 M. Ajouter 0,2 g de FeCl2.4H2O dans cette solution et remuez pour dissoudre en vue d’obtenir une solution de chlorure de fer de 10 mM. Conserver la solution dans l’obscurité dans une bouteille de verre scellé.
- Préparer une solution de bicarbonate de sodium 0,8 M en dissolvant 6,72 g de NaHCO3 dans 100 mL d’eau distillée désionisée. Conserver la solution dans un flacon de verre scellé.
- Autoclave les solutions préparées en étapes 2.2.1 - 2.2.3 en utilisant un cycle standard (exposition d’au moins 15 min à 121 ° C). Rangez-les dans l’obscurité des solutions mères aussi stériles.
- Dans un bécher contenant 1 L d’eau déionisée distillée, ajoutez le code suivant dans l’ordre tout en remuant : 5 mL de la solution de supplément minéral trace, 0,2 mL de solution aqueuse de résazurine 1 %, 0,4 g de NaCl, 0,3 g de NH4Cl, 0,1 g de MgSO4.7H2 O, 0,05 g de CaCl2.2H2O, 1 g de succinate sodique de 0,5 g d’acétate de sodium, 0,2 g de levure, extrait et 1,6 g d’agar.
- Couvrir le bécher avec le papier d’aluminium et de stériliser la solution préparée à l’étape 2.3.5.
- Juste avant la fin du cycle de l’autoclave, préparer un frais 4 % L-cysteine· HCl· Solution2O H en dissolvant 0,8 g de L-cysteine· HCl· H2O dans 20 mL d’eau distillée désionisée. Neutraliser la solution à pH 7,0 avec une solution de NaOH 5 M.
ATTENTION : il est important que la solution de cystéine est préparée fraîche pour éviter l’oxydation de la cystéine. Conserver la solution minérale dans un réfrigérateur à 4 ° C. - Après la stérilisation, laisser refroidir les moyens jusqu'à 50 – 60 ° C et placer le bécher sous la flamme d’un bec Bunsen. Retirer le papier d’aluminium et rapidement ajouter ce qui suit dans l’ordre en agitant doucement : 0,5 mL de la solution de vitamine, 2,8 mL de la solution mère du tampon phosphate stérile, 3 mL de la solution mère de fer stérile chlorure, 1,8 mL de l’étalon de bicarbonate de sodium stérile solution et 10 mL de solution de cystéine stérilisée par filtration.
Remarque : Ajuster les quantités proportionnellement si une petite quantité de milieu de culture est nécessaire. Il convient généralement d’établir un lot de 120 mL de milieu.
ATTENTION : Toutes les solutions doivent rester stériles pour une utilisation future. Effectuez l’étape 2.3.8 en utilisant une technique stérile standard et pipette stérile conseils lors de la distribution. - Après l’addition de tous les produits chimiques, transvaser le milieu chaleureux dans Hungate tubes de 16 mL stérile un bouchon qui visse. Transfert de 12 mL de milieu dans chaque tube et sceller les tubes.
ATTENTION : Pour éviter toute contamination, pour effectuer l’étape 2.3.9 sous la flamme d’un bec Bunsen. Effectuez-la avant l’agar solidifie, tandis que le milieu est à 40 ° C ou plus. - Laisser les tubes pendant plusieurs heures jusqu'à ce que l’agar se solidifie et le OAI devient évident, qui interviendrait comme une rose à l’interface incolore, environ 1 à 3 cm sous la surface du milieu.
NOTE : Le support doit tourner lentement incolore dans le tube. La quantité de temps nécessaire à cette transition est variable et dépend de la quantité d’O2 initialement dissous dans le milieu.
3. inoculation de MTB
Nota : Les cultures de souches AMB-1 MS-1 et MSR-1 peuvent être obtenues sur le marché (Table des matières).
ATTENTION : Pour effectuer toutes les étapes suivantes dans des conditions stériles, la flamme d’un bec Bunsen.
- Inoculation des souches MSR-1, 1-AMB et MS-1 en milieu liquide
- Sceller une bouteille vide de 125 mL de sérum avec un bouchon de caoutchouc-butyle et d’un joint de sertissage en aluminium. Insérez deux aiguilles dans la bouteille à travers le bouchon et raccorder une seringue préparée comme étape 1.7 à l’un d'entre eux. Connecter la seringue à une bouteille d’O2 dans le même type de tube comme celle utilisée pour la station de2 N.
- Laisser couler2 O par le biais de la bouteille pendant environ 30 min, pour s’assurer que tout l’air dans la bouteille est remplacé par O2. Enlever les deux aiguilles, permettant une légère surpression dans la bouteille, puis l’autoclave. Laisser la bouteille se refroidir à température ambiante avant utilisation.
NOTE : Pour gagner du temps, effectuez les opérations 3.1.1 et 3.1.2 au cours de la préparation moyenne et stériliser la bouteille ainsi que le support ou les solutions mères. - Stériliser le dessus des bouchons de la bouteille de milieu frais et la bouteille de2 O en appliquant quelques gouttes de solution d’éthanol 70 % au-dessus d’eux et en leur passant par la flamme d’un bec Bunsen.
- À l’aide d’une seringue stérile et une aiguille, 1 mL d’O2 extrait de la bouteille de2 O et transférez-le dans le flacon de milieu frais. Assurez-vous que l’aiguille fermement sur la seringue au cours de cette étape pour éviter l’air dans la seringue.
- Si vous utilisez l’inoculum à partir d’une autre culture cultivée dans une bouteille en verre, stériliser les bouchons de la nouvelle bouteille moyenne et le plus vieux flacon d’hémoculture en appliquant quelques gouttes de solution d’éthanol 70 % au-dessus d’eux et en leur passant par la flamme d’un bec Bunsen. Si vous utilisez l’inoculum à partir d’un tube de culture congelée, juste le laisser réchauffer à température ambiante avec le tube scellé sous la flamme d’un bec Bunsen.
- Si vous utilisez l’inoculum à partir d’une autre culture cultivée dans une bouteille en verre, ensemencer 1 mL de la culture plus ancienne dans le milieu frais. Si vous utilisez l’inoculer un stock congelé, inoculer seulement 0,1 mL pour diluer le glycérol ou diméthyl sulfoxyde (DMSO) utilisé dans le processus de congélation. Dans les deux cas, utilisez une aiguille stérile et une seringue stérile.
- Incuber la culture à 32 ° C et il ensemencer un milieu frais après 4 à 7 jours.
- Inoculation de MSR-1 en milieu semi-solide dégradé du O-2
- Vérifiez que le tube de milieu frais affiche un OAI bien défini, matérialisé par une rose à interface incolore.
- Si l’inoculum est venant d’une autre culture semi-solide O2 gradient de concentration, récolter les bactéries par pipetage 50µl de la culture avec un embout de la pipette stérile placé sur la bande formée par les bactéries. Lentement, inoculer ces bactéries à l’OAI dans le milieu frais (rose/incolore interface), en évitant de déranger l’interface. Si l’inoculum provient d’une culture congelée, procéder de la même façon avec 100 µL d’inoculum au lieu de cela.
- Fermer le tube et laisser que les bactéries se développent entre 25 ° et 30 ° C. Transvaser dans un milieu frais utilisant la même procédure, avant que la bande des bactéries n’atteigne la surface du milieu.
4. observation des bactéries
- Stériliser le bouchon de la bouteille de culture en appliquant la solution d’éthanol à 70 % dessus et passant par la flamme d’un bec Bunsen. Pour un milieu semi-solide, ouvrez le tube sous la flamme d’un bec Bunsen. Utiliser une aiguille stérile et une seringue stérile pour extraire les bactéries.
- Utilisation la pendaison drop méthode8 pour s’assurer que les bactéries sont magnétiques et mobiles.
NOTE : Microscopie à contraste de Phase donne d’excellents résultats mais n’est pas obligatoire. Conviennent de grossissements allant de 10 X à 60 X. - Microscopie électronique à transmission (TEM) permet d’observer la structure cellulaire et les magnétosomes en détail8.
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Representative Results
Succès de la préparation des milieux de croissance peut être évaluée comme suit. À la fin du processus, des solutions claires (i.e., libre de tout précipité) doit être obtenu (Ceci vaut pour les milieux liquides et le milieu semi-solide dégradé O2 ). Une photo montrant l’aspect attendu du milieu liquid MSR-1 avant l’inoculation peut être vu dans la Figure 2 a. Un milieu semi-solide succès O2 gradient de concentration est signalé par la formation de l’OAI après quelques heures, a indiqué par la présence de 1 à 3 cm du milieu rose à l’extrémité du tube (Figure 3, tube A). Le reste du milieu doit être incolore. Un support tout rose avant l’inoculation est un signe d’oxydation complète de la résazurine et donc une préparation infructueuses d’O2 gradient de concentration.
Succès de la croissance dans un milieu liquide peut être vérifiée environ 48 h après inoculation (ou quelques jours si l’inoculum provient d’une culture congelée) simplement en examinant les cultures pour la turbidité à l’aide d’une source lumineuse ou un spectrophotomètre. Une croissance réussie est confirmée par la turbidité prouvant que les bactéries ont en fait augmenté (Figure 2 b). Si le milieu reste clair après 48 h, les bactéries n’ont pas augmenté. Pour une culture en milieu liquide grandit normalement, la présence de bactéries synthétisant les magnétosomes peut être vérifiée après 48 h en plaçant le flacon de milieu sur une plaque d’agitation magnétique et en il éclairant avec une lampe de poche. À une faible vitesse d’agitation, le médium doit « flash », regardant alternativement sombre et lumineux selon l’orientation de l’aimant en remuant à l’égard de la position de l’expérimentateur. Pour une culture non magnétique, l’intensité de la lumière diffusée par des cellules vers l’expérimentateur restera constante.
Succès de la croissance en milieu semi-solide est indiqué par la formation d’une bande de microaérophiles des bactéries à l’interface rose/incolore. En raison de la consommation d’O2 par les bactéries et les changements dans le dégradé de2 O, la bande migrera lentement pour suivre l’OAI (Figure 3, tube B).
La pendaison drop méthode permet à l’observateur pour vérifier que les bactéries sont magnétiques et mobiles. Après quelques minutes, MTB devrait se concentrer sur le bord de la goutte suspendue, prouvant qu’ils nagent activement le long des lignes de champ magnétique (Figure 4 a). Pour s’assurer que les cellules sont magnétiques, inverser l’orientation de l’aimant, assis à côté de la goutte. Les bactéries devraient commencer à nager vers le bord opposé (Figure 4 b). Enfin, la forme de la magnétosomes peut être vérifiée avec TEM. Cuboctahedral cristaux d’environ 30 à 45 nm de diamètre doit être observé à9. Ces cristaux est normalement disposées en une longue chaîne ou plusieurs chaînes plus courtes chez les espèces étudiées ici (Figure 5).
Figure 1 : Illustration de la N2 station de gazage. (a) Représentation schématique. (b) photo de l’installation. Une station réussie aura la longueur appropriée de tubes de grand et mince pour que l’extrémité du tube mince voir section 1.9 étape du protocole reste immergée dans le milieu pendant l’étape de bulles de gaz. Le débit de gaz devrait également être réglable à tout moment, pour s’assurer que tous les O2 est supprimé et que le milieu ne pas renverse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Bouteilles de milieu de culture liquide avant et après l’inoculation. (un) claire MSR-1 support avant l’inoculation. (b) trouble MSR-1 moyenne après 3 jours de croissance réussie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Tubes d’O2 milieu semi-solide dégradé avant (tube A) et 10 jours après l’inoculation (tube B). Le groupe de bactéries dans le tube B est indiqué par une flèche rouge.
Figure 4 : Résultats typiques d’une goutte de suspension experiment à 20 X grossissement microscope à contraste de phase. (un) MTB nager vers le pôle sud d’un aimant et s’accumuler à l’interface air/liquide. (b) 1 min après avoir inversé l’aimant, la plupart des cellules ont quitté le champ de vision.
Figure 5 : Observation de TEM d’une cellule d’AMB-1. Les chaînes magnétosomale sont indiqués par les flèches rouges. Les deux flagelles sont indiquées par des flèches noires.
Supplémentaire Table 1. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Les exigences de concentration de2 O spécifiques de m. tuberculosis rendent non négligeable à cultiver en laboratoire. Une étape clé du protocole pour le milieu liquide est la suppression initiale de tous les O2 du milieu afin de contrôler la concentration finale en ajoutant un volume précis d’O2, juste avant l’inoculation. Il a été démontré que MSR-1 pousse dans des conditions aérobies presque complètement, cependant, le magnétisme des cellules est considérablement réduit. Les résultats de la même étude a montré que les souches AMB-1 et MS-1 ne se développent pas sous conditions aérobies entièrement6. Pour la culture semi-solide de MSR-1, tous O2 est d’abord réduite par la solution de la cystéine et le gradient de concentration de2 O apparaît alors, conduisant à la formation de l’OAI. Si une culture ne pousse pas bien ou n’est pas magnétique, la concentration d’O2 devrait être la première chose à vérifier.
Milieu semi-solide est un choix intéressant pour isoler VTT inconnu ou les espèces qui sont très sensibles à ces deux gradients de O2 et oxydo-réduction, car il garantit l’existence de gradients stables et permet à la bactérie se positionner à de plus en plus l’emplacement offre les meilleures conditions de croissance. Milieu liquide est plus commode de travailler avec quand des volumes plus importants sont nécessaires (p. ex.., pour l’extraction de l’ADN), ou quand une analyse plus approfondie doit être menée sur les cellules (par exemple., magnétosomale études) car il permet une séparation plus facile des cellules de le milieu de croissance. L’agar dans un milieu semi-solide risquent en effet d’interférer avec la cellule technique de récolte.
Dans certaines cultures, les cellules deviennent parfois non motiles, probablement en raison de mutations spontanées. Les cellules non-motile survivent et se développer dans le milieu car ils n’ont pas besoin de nager pour trouver les éléments nutritifs nécessaires à leur survie. La méthode de circuit standard10 peut alors servir pour récupérer une culture motile, puisque les cellules mobiles seulement peuvent nager vers le bas de la piste de courses. La perte du phénotype magnétique peut également se produire dans la culture même si la concentration de2 O est optimale, encore une fois en raison de mutations spontanées,11. Dans ce cas, la meilleure solution est de commencer une nouvelle culture en inoculant gelé les stocks de la bactérie de type sauvage dans un milieu frais. Par ailleurs, la technique de la piste de course peut aussi permettre la récupération d’une culture magnétique.
Il est essentiel pour éviter la contamination de la culture par d’autres organismes et donc la plupart du protocole doit être effectuée à l’aide de techniques stériles. Manipuler sous la flamme d’un brûleur Bunsen habituellement donne des résultats satisfaisants dans le respect des conditions d’asepsie. Toutefois, si la culture est cultivée dans un environnement sujettes à contamination, supplémentaires faut-il tenir, comme lors de la préparation du milieu de travail dans une hotte à flux laminaire et inoculer la bactérie. Il est à noter que le risque de contamination est plus élevé dans un milieu semi-solide comme les tubes doivent être ouvert chaque fois que les cellules sont éliminées.
Ces protocoles permettent la croissance d’assez de bactéries pour effectuer différents types d’expériences, telles que les études physiques basées sur la microscopie optique12,13, microscopie imagerie14,15, X-ray spectromicroscopie analyses16, génomiques et protéiques études17,18. Si nécessaire, des concentrations plus élevées de bactéries en suspension est possible par centrifugation. En outre, les magnétosomes peut être extrait et purifié pour les nouvelles demandes de granules des cellules ou des suspensions de cellules denses obtenues par centrifugation,19.
Formulations de médias de croissance reposent généralement sur les mêmes principes directeurs (voir le tableau1 supplémentaire pour un résumé de la liste du rôle de chaque composante dans les milieux de culture décrites ici). Une source de carbone doit être disponible pour les bactéries, par l’intermédiaire des acides organiques (p. ex.., succinate, tartrate, acétate, lactate) ou de composés inorganiques comme le bicarbonate. Le choix d’une source de carbone approprié dépend du métabolisme de la bactérie. Azote présent dans l’ADN et de protéines et de phosphore (ADN, membranes) sont également requis et fournis par NaNO3, NH4Cl et KH2PO4 dans les recettes décrites ici. Un tampon (HEPES, tampon phosphate) est nécessaire pour résister aux variations de pH. La solution de supplément minéral trace contient des cofacteurs d’enzymes et les vitamines peuvent être utilisés par les bactéries comme coenzymes ou groupes fonctionnels pour certaines enzymes. Peptone de levure extrait et soy bean constituent une source d’acides aminés et sels utilisés pour la production de protéines. VTT étant sensible redox, un ou plusieurs agents réducteurs s’ajoutent souvent au milieu (e.g., cystéine, acide ascorbique, lactate). Une source importante de fer (p. ex.., citrate ferrique, le chlorure ferrique quinate, fer) est nécessaire dans le support de la biominéralisation. Enfin, une petite quantité d’O2 est nécessaire pour que les bactéries microaérophiles comme accepteur terminal d’électron. Obliger anaérobie utilisation VTT autres composés tels que le nitrate ou le protoxyde d’azote au lieu de cela.
La principale limitation de ces protocoles est qu’il n’y a aucune garantie qu’ils vont travailler pour d’autres espèces de MTB. AMB-1, les souches MS-1 et MSR-1 sont des VTT tout d’eau douce et donc les recettes décrites dans cet article ne permet pas de grandir magnetospirilla marine comme souche Magnetospira thiophila MMS-1, Magnetospira de souche QH-2 ou autre VTT marin, qui nécessitent des concentrations plus élevées de sels. Toutefois, pour cultiver les autres souches de m. tuberculosis et d’isolement de nouvelles souches, les méthodes générales présentées dans cet article aux fluides liquides et semi-solides peuvent servir à préparer les milieux avec des recettes différentes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Richard B. Frankel pour son aide avec cultures MTB, Adam P. Hitchcock et Xiaohui Zhu pour leur soutien pendant la mise en place des cultures de VTT à l’Université McMaster et Marcia Reid pour la formation et l’accès à la facilité de la microscopie électronique (McMaster University, Faculté des Sciences de la santé). Ce travail a été soutenu par les Sciences naturelles et génie conseil recherche du Canada (CRSNG) et le US National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 - 12 N |
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