Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Выращивание магнетотактик бактерии рода Magnetospirillum: штаммов MSR-1, АМБ-1 и MS-1

Published: October 17, 2018 doi: 10.3791/58536
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Department of Physics & Astronomy, McMaster University, 2School of Life Sciences, University of Nevada Las Vegas

Summary

Мы представляем процедура для выращивания несколько штаммов Magnetospirillum в двух различных типов питательных сред. Magnetospirillum gryphiswaldense штамм MSR-1 выращивается в жидкости и градиент концентрации2 O полутвердых СМИ, а . м. magneticum штамм AMB-1 и м. magnetotacticum штамм MS-1 выращиваются в жидкой среде.

Abstract

Магнетотактик бактерии являются грамотрицательные, подвижные, главным образом водных прокариот повсеместно в пресноводных и морских местообитаний. Они характеризуются их способность biomineralize magnetosomes, которые являются магнитные нанометрового размера кристаллы магнетита (Fe3O4) или greigite (Fe3S4) окружен липидного бислоя мембраны, в пределах их цитоплазме. Для большинства известных магнетотактик бактерий magnetosomes собираются в цепях внутри цитоплазмы, тем самым наделения постоянного магнитный дипольный момент для клеток и вызывая их для выравнивания пассивно с внешними магнитными полями. Из-за этих особенностей магнетотактик бактерии имеют большой потенциал для коммерческих и медицинских приложений. Однако большинство видов являются микроаэрофильных и имеют особые O2 концентрация требования, что делает их труднее расти регулярно, чем многих других бактерий, таких как кишечная палочка. Здесь мы представляем подробные протоколы для выращивания три из наиболее широко изученных штаммов бактерий магнетотактик, все принадлежащие к роду Magnetospirillum. Эти методы позволяют для точного контроля концентрации2 O распоряжение бактерий, для того чтобы обеспечить что они нормально расти и синтезировать magnetosomes. Выращивание магнетотактик бактерий для дальнейших исследований с использованием этих процедур не требуется экспериментатор быть экспертом в микробиологии. Общие методы, представленные в этой статье может также использоваться для изоляции и культуры других магнетотактик бактерий, хотя вполне вероятно, что рост СМИ химический состав будет необходимо изменить.

Introduction

Магнетотактик бактерий (MTB) представляют широкий спектр грамотрицательные прокариот повсеместно в пресноводных и морских водной среды обитания1. Эти бактерии имеют возможность производить магнитные кристаллы магнетита (Fe3O4) или greigite (Fe3S4), которые в большинстве случаев, смонтирован в цепи внутри клетки. Этот особый структурный мотив это связано с наличием нескольких специфических белков, действуя как в цитоплазме бактерий и липидные мембраны, которая окружает каждый кристалл2. Каждый индивидуальный кристалл и его окружающие везикул мембранных называется Магнетосома и колебаясь в размере от 30 до 50 Нм в Magnetospirillum видов3. Из-за расположения цепь magnetosomes эти бактерии обладают постоянный магнитный дипольный момент, что делает их выровнять пассивно внешне прикладной магнитными полями. Таким образом, эти бактерии активно поплавать вдоль силовых линий магнитного поля, действуя как самоходные микро Компасы предположительно к более эффективно найти наиболее выгодные условия (например., концентрация2 O) для роста.

Интересное свойство MTB является их способность регулировать химии и кристаллография их Магнетосома кристаллов. Большинство штаммов производят относительно высокой чистоты кристаллы магнетита или greigite, хотя некоторые biomineralize обоих минералов4. Во всех случаях бактерии способны точно контролировать размер и форма их однодоменная магнитных кристаллов. Это объясняет, почему большое количество исследований проводится в целях лучшего понимания как MTB выполнить этот процесс biomineralization. Понимание этого процесса может позволить исследователям сделать портной-магнитные нанокристаллов для многих коммерческих и медицинских приложений.

Является существенным препятствием для обширные исследования по MTB была сложность выращивать их в лаборатории. Большинство видов, в том числе штаммов, используемых в этой работе, являются obligately микроаэрофильных когда выросла с2 O как терминал электрон акцептора. Это объясняет, почему эти бактерии наиболее часто встречаются в переходной зоне между аэробных и анаэробных условиях (аэробных и анаэробных интерфейс, OAI). Это ясно показывает, что MTB имеют точные требования концентрация O2 , в которых очевидно, что необходимо принимать во внимание при разработке питательных сред для этих организмов. Кроме того большое разнообразие существующих MTB подразумевает, что различные штаммы понадобятся различные химические градиенты и питательных веществ для достижения оптимального роста.

В этой работе, мы описываем методы для выращивания три из наиболее широко изучены MTB: Magnetospirillum magneticum (штамм AMB-1), м. magnetotacticum (МС-1) и м. gryphiswaldense (МСР-1). Эти виды филогенетически принадлежат к классу Alphaproteobacteria в тип бактерии по алфавиту , винтовой в морфологии и обладают полярных жгутика на каждом конце ячейки. Мы предоставляем протоколы для выращивания штамма MSR-1 в жидкости и O2 градиент концентрации полутвердых средства массовой информации, основанные на ранее опубликованные средний рецепты5,6. Мы также представляем подробный протокол для выращивания штаммов AMB-1 и MS-1 в изменение магнитного Spirillum роста среднего (MGSM)7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Установка станции N2

Примечание: Выберите внутренний диаметр трубы, так что он может быть подключен к топливный бак с минимальным утечки и так, что цилиндр Пластиковый шприц 1 мл плотно вписывается в этот трубопровод. Иллюстрация полный N2 газом станции приводится на рисунке 1.

  1. Безопасно установите N2 бензобака близко к скамейке, на которой имеется достаточно места для установки станции N2 (длина около 50 см).
  2. Подключиться к бак кусок трубки достаточно долго, чтобы достичь области, где будет построен станции. При необходимости, Применить тефлоновую ленту на выходе бака во избежание любой утечки.
  3. Построить станцию, способных восходящей пять бутылок среды в то же время, сократить четыре части труб приблизительно 5 см в длину.
  4. Соберите куски труб в соответствии с тремя трехходовой T-образный пластиковых фитингов. Подключите один конец этой линии к кусок трубы на выходе N2 бака через дополнительный Т-образный фитинг. Добавление угольник 90°, на другом конце.
  5. Использование ленты для присоединения структуры к горизонтальной металлический стержень размещены около 30 см выше скамейке.
  6. Подключите пять кусков трубы (примерно 20 см в длину) для свободного выхода арматуры, установленной в шаге 1.4.
  7. Удаление поршни из пяти 1,0 мл пластиковых шприцы и вырезать большие конце этих шприцы (т.е., противоположной стороне иглы), сохраняя только закончил часть. Заполнить эти шприцы с хлопком, не слишком плотно.
  8. Вставьте шприцы в 20 см длиной вертикальной части трубы и использовать мыльной водой, чтобы обеспечить, что есть нет утечки, когда течет N2 .
  9. Снимите крышки пяти 25 G иглы (0,5 мм x 25 мм) и вставить эти иглы в 10 см кусочки тонкой трубки. Убедитесь, что иглы плотно вписывается в трубке.
    Предупреждение: Существует опасность ножом во время этого шага. Делаете это медленно и осторожно.
  10. Прикрепите иглы, подготовленный в шаге 1.9 шприцы станции N2 . Убедитесь, что N2 течет через все пять строк и держать станции на стэнд бай.

2. рост средних подготовка

Примечание: Это можно регулировать количество среды подготовлен, как описано в шагах 2.1.2, 2.2.2 и 2.3.8. Количество воды и химических веществ используется только потребности быть пропорционально скорректирована. Роли всех компонентов среды описан в дополнительной таблице 1.

  1. Подготовка жидких роста среднего для MSR-1
    1. Приготовляют раствор железа цитрат 10 мм, добавив 0,245 g железа цитрат 100 мл дистиллированной деионизированной воды. Тепло и движение, чтобы растворить до желтого до оранжевого, ясно, что получено решение. Автоклав решения с помощью стандартного цикла (по крайней мере 15 минут воздействия при температуре 121 ° C) и затем сохранить этот раствор при комнатной температуре в темноте.
      Примечание: Отменить решение железа цитрат когда преципитат становится очевидным.
    2. В стакан содержащие 1 Л дистиллированной деионизированной воды, добавьте следующее по порядку помешивая: 1,0 мл микроэлемент дополнить решение, 0,1 г х2PO4, 0,15 г MgSO4.7 H2O, 2,38 г HEPES, 0,34 г NaNO3 , 0,1 г дрожжей экстракт, 3,0 г Соевый пептон бин, 4.35 мл Лактат калия (60% w/w раствор) и 5 мл 10 мм Fe(III) цитрата раствор.
      Примечание: Отрегулируйте количествах пропорционально, если требуется меньшее количество среднего роста. Для N2 станции способны восходящей пять бутылок в то же время, как один построен в шаге 1 настоящего Протокола Подготовьте 300 мл среды.
      Предупреждение: Трассировки минеральных и Fe(III) цитрат фондовой решения должны храниться стерильные. Чтобы избежать загрязнения, использование стандартных стерилизации при использовании их (открытые топы пламени бутылок, с помощью горелки Бунзена) и использовать стерильные наконечники для дозирования. Хранить минеральные раствор в холодильнике при температуре 4 ° C.
    3. После добавления всех химических веществ Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 с 1 М растворе NaOH. Отказаться от свежеприготовленных среднего в 125 мл сыворотки бутылки. Залейте 60 мл среды в каждой бутылке.
    4. Пузырь N2 в среду 30 мин для удаления растворенных O2, используя небольшой трубки подключены к станции N2 , описанной в шаге 1. Место-бутилкаучука пробку на вершине каждой бутылке, оставив лишь небольшое отверстие для избыточного газа для выхода из бутылки.
      Предупреждение: Пены могут образовывать при восходящей с N2. Чтобы избежать производства пены соответственно скорректировать газового потока.
    5. Обжимной уплотнение каждая бутылка с подготовленной пробку и печатью алюминия. Алюминий уплотнение гарантирует, что бутылка остается закрытой во время остальной части протокола.
    6. Отсоедините от станции N2 иглы и тонкой трубы и заменить их с чистым иглам (1 дюйм, ≤ 23 G). Отрегулируйте клапаны N2 танка, так что нежный непрерывный поток газа выходит из бака (около 50 мл/мин).
      Примечание: Иглы больше чем 23G может оставить постоянный unsealable отверстия в пробку.
    7. Вставьте одну из иголок, подключенных к N2 танк в бутылку среды, через резиновую пробку. Сразу вставьте другой чистые иглы в такой же бутылке. Повторите этот шаг для других бутылок и пусть N2 потока для около 30 минут, чтобы заменить воздух в бутылки, N2.
    8. Отключите одну бутылку от станции N2 , удалив соответствующие иглы. Подождите несколько секунд до тех пор, пока давление в бутылке среднего уменьшается атмосферное давление и удалите вторую иглу. Повторите этот шаг для всех остальных бутылок.
      Предупреждение: Чтобы предотвратить повторный въезд бутылки среднего роста после шага 2.1.4 O2 , выполните 2.1.4 - 2.1.8 в быстрой последовательности. Если все бутылки не может быть подключен к станции N2 в то же время, перейти с 2.1.4-2.1.8 шаги для первого набора бутылок и затем повторите эти шаги для оставшихся бутылок.
    9. Автоклав бутылки. Дайте им остыть до комнатной температуры на ночь и хранить их при комнатной температуре, потом.
  2. Подготовка жидких роста средних AMB-1 и MS-1
    1. Приготовляют раствор железа quinate 10 мм. Сначала растворяют 0,19 g Хинная кислоты в 100 мл дистиллированной деионизированной воды, затем добавить 0,27 g FeCl3.6H2O. движение, чтобы растворить, пока не получено темно красный, четкое решение. Автоклав решения с помощью стандартного цикла (по крайней мере 15 минут воздействия при температуре 121 ° C).
      Примечание: Храните железа quinate раствора при комнатной температуре в темноте как стерильный раствор. Отменить решение, когда осадок становится очевидным.
    2. В стакан содержащие 1 Л дистиллированной деионизированной воды, добавьте следующее по порядку помешивая: 10,0 мл раствора дополнения витамина, 5,0 мл раствора минеральных добавок трассировки, 0,68 г х2PO40,848 г натрия сукцината двуосновной гексагидрат, 0,575 g ди натрия тартрат дигидрат, 0,083 г натрия ацетата тригидрат, 0,45 мл 0,1% водного раствора резазурина, 0,17 g NaNO3, 0,04 г, аскорбиновой кислоты и 3,0 мл 10 мм Fe(III) quinate раствор.
      Примечание: Отрегулируйте количествах пропорционально, если требуется меньшее количество среднего роста. Для N2 станции способны восходящей пять бутылок в то же время, как один построен в шаге 1 настоящего Протокола Подготовьте 300 мл среды.
      Предупреждение: Витамин, минерал и Fe(III) quinate акций решения должны храниться стерильные. Чтобы избежать загрязнения, используйте стандартные стерильных и стерильной пипеткой советы когда дозирования. Храните минеральные и витаминные решения в холодильник на 4 ° C.
    3. После добавления всех химических веществ скорректировать рН до 6,75 с использованием 1 М растворе NaOH.
    4. Обратитесь к 2.1.3-2.1.9 шаги для остальной части протокола.
  3. Подготовка полутвердых роста среднего для MSR-1
    1. Подготовьте 0,5 М фосфатного буфера раствор pH 7.0, растворяя 3.362 g K2HPO4 и 4.178 g KH2PO4 в 100 мл дистиллированной деионизированной воды. Проверка если pH 7.0 и регулировка рН слегка с KH2PO4 или NaOH при необходимости. Решение Храните в закрытой стеклянной бутылке (предпочтительнее пластика для того, чтобы избежать обмена кислорода).
    2. Подготовка 100 мл 0,02 М раствора хлористоводородной. Добавить 0,2 г FeCl2.4H2O это решение и размешать распустить для получения раствора хлорида железа 10 мм. Решение Храните в темноте в закрытой стеклянной бутылке.
    3. Приготовляют раствор бикарбоната натрия 0,8 М, растворяя 6.72 g3 NaHCO в 100 мл дистиллированной деионизированной воды. Решение Храните в закрытой стеклянной бутылке.
    4. Автоклав решения подготовлен в шагах 2.2.1 - 2.2.3, с помощью стандартного цикла (по крайней мере 15 минут воздействия при температуре 121 ° C). Храните их как стерильные растворы запасов в темноте.
    5. В стакан содержащие 1 Л дистиллированной деионизированной воды, добавьте следующее по порядку помешивая: 5 мл раствора минеральных добавок трассировки, 0,2 мл раствора 1% водного раствора резазурина, 0,4 г NaCl, 0,3 г, NH4Cl, 0,1 г MgSO4.7H2 O, 0,05 g CaCl,2.2H2O, 1 г натрия сукцината, 0,5 г, натрия ацетат, 0,2 г дрожжей экстракт и 1,6 г агара.
    6. Обложка стакан с алюминиевой фольгой и автоклав раствор, приготовленный на шаге 2.3.5.
    7. Незадолго до окончания цикла автоклава, подготовьте свежие 4% L-cysteine· HCl· H2O решение путем растворения 0.8 g L-cysteine· HCl· H2O в 20 мл дистиллированной деионизированной воды. Нейтрализовать решение до pH 7.0 с 5м растворе NaOH.
      Предупреждение: важно, что хвоща раствор готовят свежие во избежание окисления цистеина. Хранить минеральные раствор в холодильнике при температуре 4 ° C.
    8. После автоклавирования средний Остудите до 50 – 60 ° C и взять стакан под пламени горелки Бунзена. Удалить алюминиевой фольги и быстро добавить следующее в порядке помешивая осторожно: 0,5 мл раствора витамина, 2,8 мл стерильные фосфат буфера Стоковый раствор, 3 мл стерильной железа запасов раствора хлорида, 1.8 мл запасов стерильных бикарбоната натрия решение и 10 мл раствора фильтр стерилизации цистеина.
      Примечание: Отрегулируйте количествах пропорционально, если требуется меньшее количество среднего роста. Это обычно удобно подготовить пакет 120 мл среды.
      Предупреждение: Все решения должны оставаться стерильные для использования в будущем. Выполните шаг 2.3.8 с использованием стандартных стерилизации и стерильной пипеткой советы, когда дозирования.
    9. После добавления всех химических веществ передача теплую среду в 16 мл стерильного колпачок Хангейт трубы. Передача 12 мл среды в каждую пробирку и уплотнение трубы.
      Предупреждение: Чтобы избежать загрязнения, выполните шаг 2.3.9 под пламени горелки Бунзена. Выполните его, прежде чем агар затвердевает, в то время как средний находится на 40 ° C или выше.
    10. Трубы оставьте в покое на несколько часов, пока агар затвердевает и OAI становится очевидной, материализуя как розовый бесцветный интерфейс, примерно 1-3 см ниже поверхности среды.
      Примечание: Средство следует медленно поворачивайте бесцветный в трубе. Количество времени, необходимое для этого перехода является переменной и зависит количество O2 первоначально растворенные в среде.

3. прививки MTB

Примечание: Культур штаммов AMB-1, МС-1 и MSR-1 могут быть получены коммерчески (Таблица материалов).

Предупреждение: Выполните все следующие шаги в стерильных условиях, под пламени горелки Бунзена.

  1. Прививка штаммов MSR-1, АМБ-1 и MS-1 в жидкой среде
    1. Печать пустого 125 мл сыворотки бутылка с бутил резиновой пробкой и уплотнение опрессовки алюминиевой. Вставьте две иглы в бутылке через пробку и подключите шприц, подготовленных как в шаге 1.7 к одному из них. Подключите шприц к цилиндр2 O через тот же тип трубки, который используется для станции N2 .
    2. Пусть O2 потока через бутылку для около 30 мин, чтобы обеспечить, что весь воздух в бутылке заменяется O2. Удалите обе иглы, позволяющие небольшое избыточное давление в бутылку, а затем в автоклаве. Позвольте бутылку, чтобы остыть до комнатной температуры перед использованием.
      Примечание: Чтобы сэкономить время, выполните шаги 3.1.1 и 3.1.2 во время подготовки среднего и автоклав бутылки вместе с носителя или складе решения.
    3. Стерилизуйте вершины пробки свежих средних бутылки и бутылки2 O, применяя несколько капель раствора этанол 70% Na górze их и передавая их через пламя горелки Бунзена.
    4. С помощью стерильных шприцев и игл, экстракт 1 мл O2 из бутылки2 O и перенести его в свежих средних бутылку. Убедитесь, что игла плотно вписывается на шприц во время этого шага чтобы избежать любой воздух в шприц.
    5. При использовании посевным материалом из другой культуры, выращенные в стеклянной бутылке, стерилизуйте пробки как свежие среднего бутылки, так и старые бутылки культуры, применяя несколько капель раствора этанол 70% Na górze их и передавая их через пламя горелки Бунзена. При использовании посевным материалом из трубки замороженных культуры, просто дайте ему тепло до комнатной температуры с трубки запаивается в пламя горелки Бунзена.
    6. При использовании посевным материалом из другой культуры, выращенные в стеклянной бутылке, прививать 1 мл старше культуры свежие среду. При использовании inoculate от замороженных запас, прививать только 0,1 мл для разбавления глицерина или этанного сульфоксида (ДМСО) используется в процессе замораживания. В обоих случаях используйте стерильные иглы и стерильный шприц.
    7. Инкубировать культуры на 32 ° C и прививать свежие среду после 4-7 дней.
  2. Прививка MSR-1 в O2 градиента полутвердых среднего
    1. Убедитесь, что трубка свежей среды отображается четко OAI, материализуются, розовый, бесцветный интерфейс.
    2. Если посевные приходит из другой O2 градиент концентрации полутвердых культуры, урожай бактерий путем дозирования 50 мкл культуры с наконечником стерильной пипеткой на группа, образованная бактериями. Медленно прививать эти бактерии на OAI в свежие среднего (розовый/бесцветный интерфейс), избегая тревожные интерфейс. Если посевные поступает из замороженных культуры, вместо действовать таким же образом, с 100 мкл посевным материалом.
    3. Уплотнение трубки и пусть бактерии растут между 25 ° C до 30 ° C. Перенести на свежий среднего, используя ту же процедуру, прежде чем группа бактерий достигает поверхности среды.

4. наблюдение за бактерий

  1. Стерилизуйте пробку бутылки культуры, применяя 70% этанола раствор поверх него и пропустив его через пламя горелки Бунзена. Для полутвердых средних открытая трубка под пламени горелки Бунзена. Используйте стерильные иглы и стерильный шприц для извлечения бактерий.
  2. Использование висит падение8 метод для обеспечения того, чтобы бактерии как магнитные, так и подвижные.
    Примечание: Фазово-контрастная микроскопия дает отличные результаты, но не является обязательным. Увеличениях от 10 X до 60 X являются подходящими.
  3. Использование просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) соблюдать структуру клетки и magnetosomes в деталях8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Успешной подготовке питательных сред можно оценить следующим образом. В конце процесса, четкие решения (т.е., без любой преципитат) должны быть получены (это верно для жидких сред и O2 градиента полутвердых среднего). Изображения, отображение ожидаемой аспект MSR-1 жидкой среды перед прививкой можно увидеть на рисунке 2a. Успешный средний полутвердых O2 градиент концентрации сигнализируется формирования OAI после нескольких часов, свидетельствует присутствие 1-3 см Розовая среды в верхней части трубки (рис. 3, метро A). Остальная часть среды должны быть бесцветными. Средства все розовый до прививки в знак полного окисления резазурина и поэтому неудачной подготовки градиента концентрации2 O.

Успешного роста в жидкой среде может быть проверена около 48 ч после прививки (или через несколько дней, если посевные поступает из замороженных культуры) просто путем изучения культур для мутность, с помощью источника света или спектрофотометра. Успешного роста подтверждается мутность, доказав, что бактерии фактически вырос (рис. 2b). Если носитель остается ясным после 48 ч, бактерии не выросли. Для жидких средних культуры растет нормально наличие бактерий, синтезирующих magnetosomes могут быть проверены после 48 ч, поместив бутылку среднего на Плиты магнитные перемешать и путем освещения с фонариком. На низкой скорости перемешивания носитель должен «вспышка», глядя попеременно темнее и ярче в зависимости от ориентации перемешивания магнита в отношении позиции экспериментатор. Для немагнитных культуры интенсивность света, рассеянного клетки к экспериментатор будет оставаться постоянным.

Успешного роста в полутвердых среднего обозначается формирования группа микроаэрофильных бактерий в интерфейсе розовый/бесцветный. Из-за потребления O2 бактерии и изменения градиента2 O группа будет медленно мигрируют следовать OAI (рис. 3, метро B).

Висячие падение метод позволяет наблюдателей для проверки, что бактерии, как магнитные, так и подвижные. Через несколько минут MTB следует сосредоточить на краю падение подвесной, доказав, что они активно плавать вдоль линий магнитного поля, (рисунок 4a). Чтобы убедиться, что клетки являются магнитные, флип ориентацию магнита, сидя рядом с падения. Бактерии должны начать плавательный направлении противоположного края (рис. 4В). Наконец форма magnetosomes может быть проверена с ТЕА. Кристаллы Cuboctahedral около 30-45 Нм в диаметре должны соблюдаться9. Эти кристаллы обычно расположены в одной длинной цепи или несколько короче цепей в видов учился здесь (рис. 5).

Figure 1
Рисунок 1 : Иллюстрация N2 газом станции. () схематическое представление. (b) изображения установки. Успешный станция будет иметь соответствующей длины труб большого и тонкий так что конце тонкой трубки, описанные в шаге 1.9 протокола остается погруженным в среднесрочной восходящей этапе газ. Поток газа следует также регулируемые во все времена, для обеспечения удаления всех O2 и что средство не разлива. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Бутылки жидких роста средних до и после прививки. () ясно MSR-1 носитель перед прививкой. (b) мутная MSR-1 средний после 3 дней успешного роста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Трубы O2 градиент полутвердых среднего до (метро A) и через 10 дней после прививки (труба B). Группа бактерий в трубку B обозначается красной стрелкой.

Figure 4
Рисунок 4 : Типичные результаты висит капли эксперимент на 20 X увеличение с помощью фазово-контрастной микроскопии. () MTB плавать на Южный полюс магнита и накапливаются в интерфейсе жидкостное/воздушное. (b) 1 мин после листать магнит, большинство клеток покинули поле зрения.

Figure 5
Рисунок 5 : ТЕА наблюдения ячейки AMB-1. Магнетосома цепочек обозначаются красными стрелками. Два жгутиков обозначаются черными стрелками.

Дополнительная таблица 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

O2 концентрация требования MTB делают их нетривиальных расти в лаборатории. Ключевым шагом протокола для жидкой среды является первоначальное удаление всех O2 с носителя для управления конечной концентрации, добавляя определенный объем O2, как раз перед прививкой. Было показано, что MSR-1 растет почти полностью аэробных условиях, однако, резко снижается магнетизм клеток. Результаты от того же исследования показали, что штаммы AMB-1 и MS-1 не растут под полностью аэробных условиях6. Для полутвердых культуры MSR-1 сначала все O2 уменьшается раствором цистеина и затем появляется градиент концентрации O2 , приводит к образованию OAI. Если культура не растут хорошо или не магнитная, концентрации2 O должно быть первое, что нужно проверить.

Полутвердых роста среднего является интересным выбором для изоляции неизвестных MTB или растущих видов, которые являются весьма чувствительными к обоих O2 и окислительно-восстановительного градиенты, как он обеспечивает существование стабильного градиентов и бактерии, чтобы позиционировать себя на местоположение, предлагая оптимальные условия роста. Жидкой среде более удобно работать с когда необходимы более высокие объемы (например., для экстракции ДНК), или когда дальнейший анализ должен проводиться на клетки (например., Магнетосома исследования) как он позволяет проще разделения клетки среднего роста. Агар в полутвердых средних действительно может помешать с ячейкой лесозаготовительной техники.

В некоторых культурах клетки иногда становятся не подвижные, вероятно благодаря спонтанной мутации. Non подвижные клетки выжить и развиваться в среднего роста, так как им не нужно доплыть до найти питательные вещества, необходимые для их выживания. Метод стандартного гонки трек10 затем может использоваться для восстановления подвижных культуры, поскольку только подвижные клетки могут плавать вниз гонки трек. Потери магнитной фенотип также может произойти в культуре, даже если концентрация2 O является оптимальным, опять же благодаря спонтанной мутации11. В этом случае лучше начать новую культуру путем прививки замороженные запасы одичал тип бактерий в свежие среду. Кроме того метод гонки трек можно также разрешить восстановление магнитного культуры.

Важно, чтобы избежать загрязнения культуры другими организмами, и поэтому большая часть протокола должны выполняться с помощью стерильных методов. Манипуляции под пламени горелки Бунзена обычно дает удовлетворительные результаты в поддержание асептических условий. Однако если культура выращивается в подверженных загрязнению окружающей среды, дополнительные меры предосторожности должны приниматься, как работающие в Ламинарный шкаф при подготовке средне и прививки бактерий. Следует отметить, что риск заражения выше в полутвердых среде как трубы должны быть открыты каждый раз, когда клетки будут удалены.

Эти протоколы обеспечивают рост достаточно бактерий, выполнять различные виды экспериментов, например физические исследования, основанные на оптической микроскопии12,13, электронной микроскопии изображений14,15, Рентгеновский spectromicroscopy анализы16, геномных и белка исследования17,18. При необходимости, более высокие концентрации бактерий в подвеска может быть достиган центрифугирования. Кроме того magnetosomes можно извлечь и очищенный для дальнейших заявок от клеток гранулы или плотной клеточных суспензий, полученные путем центрифугирования19.

Рост СМИ формулировки обычно основаны на тех же руководящих принципах (см. Дополнительная таблица 1 краткое изложение перечня роли каждого компонента в СМИ роста описано здесь). Источника углерода должны быть доступны для бактерий, через органических кислот (например., сукцинат, ацетат, тартрат, лактат) или неорганических соединений, таких как бикарбонат. Выбор подходящего углерода источника зависит от метаболизма бактерий. Азота в ДНК и белков и фосфора (ДНК, мембраны) также требуются и предоставляемые NaNO3, NH4Cl и KH24 PO в рецептах, описанных здесь. Буфер (HEPES, фосфатного буфера) необходимо противостоять изменениям рН. Раствора минеральных добавок трассировки содержит кофакторы ферментов и витаминов может использоваться бактериями как коферменты или функциональных групп для некоторых ферментов. Дрожжевой экстракт и соевый Пептон бин источником аминокислот и солей, используемые для производства белка. Так как MTB редокс чувствительных, один или несколько восстановителями часто должны добавляться в носитель (например., хвоща, аскорбиновая кислота, лактата). Основным источником железа (например., железа цитрат, железа quinate, железа хлорид) необходима в средстве для biomineralization. И наконец небольшое количество O2 требуется для микроаэрофильных бактерий как терминал электрон акцептора. Обязывать анаэробных MTB использования других соединений, таких как нитрат или закиси вместо.

Основным ограничением этих протоколов является, что нет никакой гарантии, что они будут работать для других видов MTB. Штаммы AMB-1, МС-1 и MSR-1 все пресноводные MTB и поэтому рецепты, описанные в этой статье не может использоваться для расти морской magnetospirilla Magnetospira thiophila штамм MMS-1, Magnetospira штамм QH-2 или других морских MTB которые требуют более высокие концентрации соли. Однако выращивать другие штаммы MTB и для изоляции новых штаммов, общие методы, представленные в этой статье для жидких и полутвердых СМИ может использоваться для подготовки средств массовой информации с различными рецептами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим за его помощь с MTB культур, Адам P. Hitchcock и Чжу Ксяохуи за их поддержку при создании MTB культур в университете МакМастер и Марсия Рид для профессиональной подготовки и доступа к Фонду электронной микроскопии (Университет Макмастера, Ричард б. Френкель Факультет наук о здоровье). Эта работа была поддержана естественных наук и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ) и нас национального научного фонда.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMB-1 American Type Culture Collection (ATCC) ATCC 700264
MS-1 ATCC ATCC 31632 
MSR-1 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) DSM 6361
Ferric citrate Sigma-Aldrich F3388-250G
Trace mineral supplement ATCC MD-TMS
KH2PO4 EMD PX1565-1
MgSO4.7 H2O EMD MX0070-1
HEPES BioShop Canada Inc HEP001.250
NaNO3 Sigma-Aldrich S5506-250G
Yeast extract Fischer scientific DF210929
Peptone Fischer scientific DF0436-17-5
Potassium L-lactate solution (60%) Sigma-Aldrich 60389-250ML-F
D-(-)-Quinic acid Sigma-Aldrich 138622
FeCl3.6H2O Fischer scientific I88-100
Vitamin supplement ATCC MD-VS
Sodium succinate hexahydrate Fischer scientific S413-500
Sodium L-tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich 228729-100G
Sodium acetate trihydrate EMD SX0255-1
Resazurin Difco 0704-13
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-25G
K2HPO4 Caledon 6620-1-65
FeCl2 .4H2O Sigma-Aldrich 44939-250G
Sodium bicarbonate EMD SX0320-1
NaCl Caledon 7560-1
NH4Cl EMD 1011450500
CaCl2.2 H2O EMD 1023820500
Agar A Bio Basic Canada Inc FB0010
L-cysteine.HCl.H2O Sigma-Aldrich C7880-100G
1.0 mL syringes Fischer scientific B309659
25G  x 1 needles BD 305125
125 mL serum bottles Wheaton 223748
20 mm aluminum seals Wheaton 224223-01
20mm E-Z Crimper Wheaton W225303
Butyl-rubber stoppers Bellco Glass, Inc. 2048-11800
Hungate tubes Chemglass (VWR) CLS-4208-01
Septum stopper, 13mm, Hungate Bellco Glass, Inc. 2047-11600
Glass culture Tubes Corning (VWR) 9826-16X
Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent Sigma-Aldrich H1758-100ML 11.6 - 12 N

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).
  2. Uebe, R., Schüler, D. Magnetosome biogenesis in magnetotactic bacteria. Nature Reviews Microbiology. 14 (10), 621 (2016).
  3. Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chemical Reviews. 108 (11), 4875-4898 (2008).
  4. Bazylinski, D. A., et al. Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).
  5. Lefèvre, C. T., et al. Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria. Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).
  6. Heyen, U., Schüler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 536-544 (2003).
  7. Blakemore, R. P., Maratea, D., Wolfe, R. S. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. Journal of bacteriology. 140 (2), 720-729 (1979).
  8. Oestreicher, Z., Lower, S. K., Lin, W., Lower, B. H. Collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  9. Pósfai, M., Lefèvre, M., Trubitsyn, C., Bazylinski, D. A., Frankel, R. Phylogenetic significance of composition and crystal morphology of magnetosome minerals. Frontiers in Microbiology. 4, 344 (2013).
  10. Wolfe, R. S., Thauer, R. K., Pfennig, N. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Ecology. 3 (1), 31-35 (1987).
  11. Schübbe, S., et al. Characterization of a spontaneous nonmagnetic mutant of Magnetospirillum gryphiswaldense reveals a large deletion comprising a putative magnetosome island. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5779-5790 (2003).
  12. Nadkarni, R., Barkley, S., Fradin, C. A comparison of methods to measure the magnetic moment of magnetotactic bacteria through analysis of their trajectories in external magnetic fields. PloS One. 8 (12), e82064 (2013).
  13. Waisbord, N., Lefèvre, C. T., Bocquet, L., Ybert, C., Cottin-Bizonne, C. Destabilization of a flow focused suspension of magnetotactic bacteria. Physical Review Fluids. 1 (5), 053203 (2016).
  14. Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3839-3844 (2004).
  15. Scheffel, A., et al. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature. 440 (7080), 110 (2006).
  16. Zhu, X., et al. Measuring spectroscopy and magnetism of extracted and intracellular magnetosomes using soft X-ray ptychography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (51), E8219-E8227 (2016).
  17. Schüler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Archives of Microbiology. 181 (1), 1-7 (2004).
  18. Kolinko, I., et al. Biosynthesis of magnetic nanostructures in a foreign organism by transfer of bacterial magnetosome gene clusters. Nature Nanotechnology. 9 (3), 193 (2014).
  19. Hergt, R., et al. Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).
  20. Lefevre, C. T., et al. Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The ISME Journal. 6 (2), 440 (2012).
  21. Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).
  22. Zhu, K., et al. Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea. Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).

Tags

Биология выпуск 140 магнетотактик бактерий магнитотаксис Magnetospirillum АМБ-1 МС-1 MSR-1 Magnetosomes Oxic аноксии интерфейс.
Выращивание магнетотактик бактерии рода <em>Magnetospirillum</em>: штаммов MSR-1, АМБ-1 и MS-1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Le Nagard, L., Morillo-López,… More

Le Nagard, L., Morillo-López, V., Fradin, C., Bazylinski, D. A. Growing Magnetotactic Bacteria of the Genus Magnetospirillum: Strains MSR-1, AMB-1 and MS-1. J. Vis. Exp. (140), e58536, doi:10.3791/58536 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter