Summary
Presentamos un procedimiento para el crecimiento de varias cepas de Magnetotacticum en dos tipos diferentes de medios de cultivo. Cepa gryphiswaldense Magnetotacticum MSR-1 se cultiva en líquido y gradiente de la concentración de O2 medios semisólidos mientras M. magneticum cepa 1 AMB y M. Magnetospirillum cepa MS-1 se cultivan en medio líquido.
Abstract
Magnétotactiques bacterias son procariotas Gram-negativos, móviles, principalmente acuáticos ubicuos en hábitats de agua dulce y marinos. Se caracterizan por su capacidad de magnetosomes biomineralize, que son magnéticos cristales tamaño de nanómetros de magnetita (Fe3O4) o greigite (Fe3S4) rodeados por una membrana de bicapa lipídica, en su citoplasma. Para la mayoría de las bacterias conocidas magnétotactiques, magnetosomes se montan en cadenas dentro del citoplasma, lo que confiere un permanente momento de dipolo magnético a las células y haciendo que alinear pasivamente con campos magnéticos externos. Debido a estas características específicas, magnétotactiques las bacterias tienen un gran potencial para aplicaciones comerciales y médicas. Sin embargo, la mayoría de especies son microaerofílicas y O2 concentración requisitos específicos, haciéndolos más difícil de cultivar rutinariamente que muchas otras bacterias como Escherichia coli. Aquí presentamos protocolos detallados para el cultivo de tres de las cepas más ampliamente estudiadas de bacterias magnétotactiques, todos pertenecientes al género Magnetotacticum. Estos métodos permiten un control preciso de la concentración de O2 a disposición de las bacterias, con el fin de asegurarse de que crecen normalmente y sintetizar magnetosomes. Cultivo de bacterias magnétotactiques para futuros estudios con estos procedimientos no requiere el experimentador a ser un experto en Microbiología. Los métodos generales presentados en este artículo pueden usarse para aislar y cultura otras bacterias magnétotactiques, aunque es probable que composición química de los medios de crecimiento tendrán que modificarse.
Introduction
Magnétotactiques bacterias (MTB) representan una amplia gama de procariotas gramnegativos ubicuos en ambientes acuáticos de agua dulce y marinos1. Estas bacterias comparten la habilidad de producir cristales magnéticos de magnetita (Fe3O4) o greigite (Fe3S4), que son en la mayoría de los casos montada en cadenas dentro de las células. Este motivo estructural particular es debido a la presencia de varias proteínas específicas que actúan tanto en el citoplasma de la bacteria y la membrana lipídica que envuelve cada cristal2. Cada cristal individual y su vesícula de membrana circundante se llama un magnetosome y es que van en tamaño desde unos 30 a 50 nm en Magnetotacticum especies3. Debido a la disposición de la cadena de magnetosomes, estas bacterias poseen un permanente momento de dipolo magnético que hace alinear pasivamente con campos magnéticos aplicados externamente. Por lo tanto, estas bacterias nadan activamente a lo largo de líneas del campo magnético, actuando como automotores micro-brújulas presumiblemente más efectivamente localizar las condiciones más favorables (por ej., concentración de O2 ) para el crecimiento.
Una propiedad interesante de MTB es su capacidad para regular la química y la cristalografía de los cristales de magnetosome. Mayoría de las cepas produce cristales de pureza relativamente elevada de magnetita o greigite, aunque algunos biomineralize ambos minerales4. En todos los casos, las bacterias son capaces de controlar con precisión el tamaño y la forma de sus cristales solo dominio magnético. Esto explica por qué una gran cantidad de investigación se lleva a cabo para desarrollar una mejor comprensión de cómo MTB realizar este proceso de biomineralización. Comprender este proceso permitiría a los investigadores a adaptar-hacer nanocristales magnéticos para muchos usos médicos y comerciales.
Un obstáculo importante a la investigación extensa sobre MTB ha sido la dificultad de cultivarlas en el laboratorio. Mayoría de las especies, incluyendo las cepas utilizadas en este trabajo, es obligatoriamente microaerofílico cuando se cultiva con O2 como aceptor terminal de electrones. Esto explica por qué estas bacterias más a menudo se encuentran en la zona de transición entre condiciones anóxicas y óxicas (la interfaz oxic-anoxic, OAI). Esto claramente muestra que MTB O2 concentración requerimientos precisos que obviamente debe tenerse en cuenta al elaborar medios de cultivo para estos organismos. Por otra parte, la gran diversidad existente de MTB implica que diferentes cepas tendrán diferentes tipos de gradientes químicos y nutrientes para lograr un crecimiento óptimo.
En este trabajo, describimos los métodos para el cultivo de tres de la MTB más ampliamente estudiado: magneticum Magnetotacticum (cepa AMB-1), M. Magnetospirillum (MS-1) y M. gryphiswaldense (MSR-1). Estas especies pertenecen a la clase Alphaproteobacteria en el phylum proteobacterias filogenéticamente, son helicoidales en morfología y poseen un flagelo polar en cada extremo de la célula. Proporcionamos los protocolos para el cultivo de cepa MSR-1 en líquido y O gradiente de concentración semisólidos medios2 , basados en recetas medio previamente publicados5,6. También presentamos un protocolo detallado para el cultivo de cepas 1 AMB y 1 MS en modificado magnético Spirillum crecimiento medio (MGSM)7.
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Protocol
1. instalación de la estación2 de N
Nota: Elija el diámetro interno de la tubería por lo que se puede conectar al tanque de gas con fuga mínima y para que el cilindro de una jeringa de plástico de 1 mL se ajusta firmemente en esta tubería. Para ilustrar el completa N2 estación de burbujeo se proporciona en la figura 1.
- Con seguridad, instale un tanque de gas N2 cerca de un banco en el que hay espacio suficiente para configurar la estación de2 N (una longitud de aproximadamente 50 cm).
- Conectar al tanque de un pedazo de tubo tiempo suficiente para llegar a la zona donde se construirá la estación. Si es necesario, aplique cinta de teflón en la salida del tanque para evitar cualquier fuga.
- Para construir una estación capaz de burbujeantes cinco botellas de medio al mismo tiempo, cortar cuatro piezas de tubo de aproximadamente 5 cm de longitud.
- Montar las piezas de la tubería en una línea con tres vías en forma de T plástico conexiones. Conecte un extremo de esta línea a la pieza de tubería en la salida del tanque2 N a través de una conexión adicional en forma de T. Añadir un codo de 90° guarnición en el otro extremo.
- Use cinta para fijar la estructura a una barra metálica horizontal colocado aproximadamente 30 cm por encima del Banco.
- Conectar cinco pedazos de tubería (aproximadamente 20 cm de longitud) a las salidas libres de los accesorios instalados en paso 1.4.
- Sacar los pistones de cinco jeringas de plástico de 1,0 mL y cortar el extremo más grande de estas jeringas (es decir., la opuesta al lado de la aguja), manteniendo únicamente la parte graduada. Llene las jeringas con algodón, no demasiado.
- Coloque las jeringas en las piezas vertical largo 20 cm de la tubería y utilice agua jabonosa para asegurarse de que no hay ninguna salida cuando fluye N2 .
- Retire las tapas de cinco agujas de 25 G (0,5 x 25 mm) e inserte estas agujas en las piezas de 10 cm de tubo fino. Asegúrese de que las agujas se ajustan firmemente en el tubo.
PRECAUCIÓN: Existe el riesgo de apuñalar durante este paso. Hacerlo lentamente y con cuidado. - Coloque las agujas preparadas en paso 1.9 para las jeringuillas de la estación de2 N. Asegúrese de que N2 está fluyendo a través de todas las líneas de cinco y mantener la estación en modo de espera.
2. preparación de medio de crecimiento
Nota: Es posible ajustar la cantidad del medio preparado, como se explica en los puntos 2.1.2, 2.2.2 y 2.3.8. La cantidad de agua y sustancias químicas utilizadas sólo ajustarse proporcionalmente. El papel de todos los componentes del medio se describe en la tabla adicional 1.
- Preparación de medio de crecimiento líquido para MSR-1
- Preparar una solución de citrato férrico 10 mM mediante la adición de 0,245 g de citrato férrico a 100 mL de agua destilada desionizada. Calentar y agitar hasta para disolver, hasta un amarillo naranja claro se obtiene la solución. Autoclave de la solución utilizando un estándar de ciclo (por lo menos 15 min de exposición a 121 ° C) y luego almacenar esta solución a temperatura ambiente en la oscuridad.
Nota: Deseche la solución de citrato férrico cuando un precipitado se vuelve evidente. - En un vaso de precipitados que contiene 1 L de agua destilada desionizada, agregue lo siguiente en orden mientras revuelve: 1,0 mL del mineral traza suplemento solución, 0,1 g de KH2PO4, 0.15 g de MgSO4.7 H2O, 2,38 g de HEPES, 0,34 g de NaNO3 , 0,1 g de levadura extracto, 3.0 g de peptona de Soya bean, 4,35 mL de lactato de potasio (solución al 60% w/w) y 5 mL de la solución stock de fe (III) citrato de 10 mM.
Nota: Ajuste las cantidades proporcionalmente si se necesita una menor cantidad de medio de cultivo. Para una estación de2 N capaz de burbujeantes cinco botellas al mismo tiempo, como el construido en el paso 1 de este protocolo, preparar 300 mL de medio.
PRECAUCIÓN: Oligoelementos minerales y stock de fe (III) citrato las soluciones deben mantenerse estériles. Para evitar la contaminación, utilizar técnica estéril cuando usarlos (llama abierta tapas de botellas con un mechero de Bunsen) y usar puntas de pipeta estériles para dispensador. Almacenar la solución mineral en el refrigerador a 4 ° C. - Después de la adición de todos los productos químicos, ajustar el pH a 7,0 con solución de NaOH de 1 M. Dispense el medio recién preparado en botellas de 125 mL suero. Verter 60 mL de medio en cada botella.
- Burbuja N2 en el medio durante 30 minutos eliminar el disuelto O2, usando el tubo pequeño conectado con la estación de2 N se describe en el paso 1. Coloque un tapón de goma butílica encima de cada botella, dejando una pequeña abertura para permitir que el exceso de gas salir de la botella.
PRECAUCIÓN: Puede formar espuma mientras burbujeando con N2. Ajustar en consecuencia el flujo de gas para evitar la producción de espuma. - Doble sello de cada botella con el tapón preparado y un sello de aluminio. El sello de aluminio asegura que la botella permanece cerrada durante el resto del protocolo.
- Desconecte la estación de2 N las agujas y la tubería delgada y reemplazarlos con agujas limpias (1 pulgada, ≤ 23 G). Ajuste las válvulas del tanque2 N para que un suave flujo continuo de gas sale del tanque (alrededor de 50 mL/min).
Nota: Mayor de 23G de agujas pueden dejar permanentes unsealable agujeros en el tapón. - Inserte una de las agujas conectadas al tanque de2 N en una botella de medio, a través del tapón de goma. Inmediatamente inserte otra aguja limpia en la misma botella. Repita este paso para las otras botellas y deje N2 flujo durante unos 30 minutos reemplazar el aire de las botellas por N2.
- Desconecte una botella desde la estación de2 N retirando la aguja correspondiente. Espere unos segundos hasta que la presión en la botella del medio disminuye a la presión atmosférica y quitar la segunda aguja. Repita este paso para todas las botellas restantes.
PRECAUCIÓN: Para impedir que vuelva a entrar en las botellas de medio de cultivo después paso 2.1.4 O2 , realice los pasos 2.1.4 - 2.1.8 en rápida sucesión. Si todas las botellas no se puede conectar a la estación de2 N al mismo tiempo, continuar con pasos 2.1.4-2.1.8 para el primer conjunto de botellas y repita estos pasos para las restantes botellas. - Autoclave de las botellas. Dejan enfriar a temperatura ambiente durante la noche y almacenar a temperatura ambiente luego.
- Preparar una solución de citrato férrico 10 mM mediante la adición de 0,245 g de citrato férrico a 100 mL de agua destilada desionizada. Calentar y agitar hasta para disolver, hasta un amarillo naranja claro se obtiene la solución. Autoclave de la solución utilizando un estándar de ciclo (por lo menos 15 min de exposición a 121 ° C) y luego almacenar esta solución a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Preparación de medio de crecimiento líquido para AMB-1 y MS-1
- Preparar una solución de quinate férrico de 10 mM. Primero disolver 0,19 g de ácido quínico en 100 mL de agua desionizada destilada, luego añadir 0,27 g de FECLAS3.6H2O. remover para disolver, hasta obtener una solución clara, rojo oscurezca. Autoclave de la solución usando un ciclo estándar (por lo menos 15 min de exposición a 121 ° C).
Nota: Almacene la solución quinate férrica a temperatura ambiente en la oscuridad como una solución estéril. Desechar la solución cuando un precipitado se vuelve evidente. - En un vaso de precipitados que contiene 1 L de agua destilada desionizada, agregue lo siguiente en orden mientras revuelve: 10,0 mL de la solución de suplemento de vitamina, 5,0 mL de la solución de suplemento de minerales de rastro, 0,68 g de KH2PO4, 0,848 g de succinato de sodio dibásico hexahidrato, 0,575 g de di-Sodio tartrato dihidrato, 0,083 g de acetato de sodio trihidrato, 0,45 mL 0.1% acuosa resazurina, 0,17 g de NaNO3, 0.04 g de ácido ascórbico y 3,0 mL de la solución madre de fe (III) quinate de 10 mM.
Nota: Ajuste las cantidades proporcionalmente si se necesita una menor cantidad de medio de cultivo. Para una estación de2 N capaz de burbujeantes cinco botellas al mismo tiempo, como el construido en el paso 1 de este protocolo, preparar 300 mL de medio.
PRECAUCIÓN: Vitaminas, minerales traza y quinate soluciones stock de fe (III) deben mantenerse estériles. Para evitar la contaminación, utilizar técnica estéril estándar y las puntas de pipeta estériles del despachador. Almacenar las soluciones de vitaminas y minerales en un refrigerador a 4 ° C. - Después de la adición de todos los productos químicos, ajustar el pH a 6.75 usando solución de NaOH de 1 M.
- Se refieren a pasos 2.1.3-2.1.9 para el resto del protocolo.
- Preparar una solución de quinate férrico de 10 mM. Primero disolver 0,19 g de ácido quínico en 100 mL de agua desionizada destilada, luego añadir 0,27 g de FECLAS3.6H2O. remover para disolver, hasta obtener una solución clara, rojo oscurezca. Autoclave de la solución usando un ciclo estándar (por lo menos 15 min de exposición a 121 ° C).
- Preparación de medio de cultivo semisólido para MSR-1
- Preparar un 0,5 M fosfato buffer solución pH 7.0 disolviendo 3,362 g de K2HPO4 y 4,178 g de KH2PO4 en 100 mL de agua destilada desionizada. Compruebe si el pH es 7.0 y ajustar el pH con KH2PO4 o NaOH si es necesario. Almacenar la solución en un frasco de vidrio sellado (preferible al plástico con el fin de evitar el intercambio de oxígeno).
- Preparar 100 mL de una solución de clorhídrico de 0.02 M. Añadir 0,2 g de FECLAS2.4H2O a esta solución y mezclar para disolver para obtener una solución de cloruro de hierro de 10 mM. Almacenar la solución en la oscuridad en un frasco de vidrio sellado.
- Preparar una solución de bicarbonato de sodio de 0,8 M disolviendo 6,72 gramos de NaHCO3 en 100 mL de agua destilada desionizada. Almacenar la solución en un frasco de vidrio sellado.
- Autoclave de las soluciones preparan en pasos 2.2.1 - 2.2.3 usando un ciclo estándar (por lo menos 15 min de exposición a 121 ° C). Almacena soluciones como estériles en la oscuridad.
- En un vaso de precipitados que contiene 1 L de agua destilada desionizada, agregue lo siguiente en orden mientras revuelve: 5 mL de la solución de suplemento de minerales de rastro, 0.2 mL de solución acuosa de resazurina al 1%, 0,4 g de NaCl, 0,3 g de NH4Cl, 0,1 g de MgSO4.7H2 O, 0,05 g de CaCl2.2 h2O, 1 g de succinato de sodio, 0.5 g de acetato de sodio 0,2 g de levadura extracto, 1,6 g de agar.
- Cubrir el vaso con papel de aluminio y autoclave la solución preparada en el paso 2.3.5.
- Justo antes del final del ciclo de autoclave, preparar un fresco 4% L-cysteine· HCl· Solución de H2O por disolver 0,8 g de L-cysteine· HCl· H2O 20 ml de agua destilada desionizada. Neutralizar la solución a pH 7,0 con solución de NaOH de 5 M.
PRECAUCIÓN: es importante que la solución de cisteína se prepara fresco para evitar la oxidación de la cisteína. Almacenar la solución mineral en el refrigerador a 4 ° C. - Después de la esterilización en autoclave, deje enfriar el medio hasta 50 – 60 ° C y poner el vaso bajo la llama de un mechero de Bunsen. Retire el papel de aluminio y añadir rápidamente los siguientes en orden agitando suavemente: 0,5 mL de la solución de vitamina, 2,8 mL de la solución madre del tampón de fosfato estéril, 3 mL de la solución madre de hierro estéril cloruro, 1,8 mL del stock de bicarbonato de sodio estéril solución y 10 mL de solución de cisteína filtro esterilizado.
Nota: Ajuste las cantidades proporcionalmente si se necesita una menor cantidad de medio de cultivo. Normalmente es conveniente preparar un lote de 120 mL de medio.
PRECAUCIÓN: Todas las soluciones deben permanecer estériles para uso futuro. Realizar paso 2.3.8 utilizar técnica estéril y pipeta estéril consejos del despachador. - Después de la adición de todos los productos químicos, transferir el medio caliente en tubos de 16 mL tapa a rosca estéril Hungate. Transferir 12 mL de medio en cada tubo y sellar los tubos.
PRECAUCIÓN: Para evitar la contaminación, realizar paso 2.3.9 bajo la llama de un mechero de Bunsen. Realizar antes de que el agar se solidifica, mientras que el medio es a 40 ° C o superior. - Deje los tubos reposar durante varias horas hasta que el agar se solidifica y la OAI se hace evidente, materializando como un rosado a incoloro interfaz, aproximadamente 1 a 3 cm debajo de la superficie del medio.
Nota: El medio debe girar lentamente descolorido en el tubo. La cantidad de tiempo necesario para esta transición es variable y depende de la cantidad de O2 disuelto inicialmente en el medio.
3. inoculación de MTB
Nota: Los cultivos de las cepas AMB-1, MS-1 y MSR-1 pueden obtenerse comercialmente (Tabla de materiales).
PRECAUCIÓN: Realice los siguientes pasos en condiciones estériles, bajo la llama de un mechero de Bunsen.
- Inoculación de las cepas MSR-1, 1 AMB y 1 MS en medio líquido
- Sellar una botella de suero vacío 125 mL con un tapón de goma butílica y un sello de presión de aluminio. Inserte dos agujas en la botella con el tapón y conectar una jeringa preparada como en 1.7 paso a uno de ellos. Conectar la jeringa a un cilindro de O2 por el mismo tipo de tubería que el utilizado para la estación de2 N.
- Que flujo de O2 a través de la botella durante unos 30 minutos, para asegurar que todo el aire en la botella es sustituido por O2. Retirar ambas agujas, lo que permite una ligera sobrepresión en la botella y entonces el autoclave. Deje que la botella se enfríe a temperatura ambiente antes de usar.
Nota: Para ahorrar tiempo, realice los pasos 3.1.1 y 3.1.2 durante la preparación media y autoclave la botella junto con el medio o las soluciones stock. - Esterilizar las tapas de los tapones de la botella de medio fresca y la botella de2 O aplicando unas gotitas de solución de etanol 70% encima de ellos y pasar a través de la llama de un mechero de Bunsen.
- Utilizando una jeringa y una aguja estériles, extraer 1 mL de O2 de la botella de2 O y transferencia dentro de la botella de medio fresca. Asegúrese que la aguja firmemente en la jeringa durante este paso para evitar el aire en la jeringa.
- Si el inóculo de otra cultura en una botella de vidrio, esterilizar los tapones de la botella de medio fresca y el frasco de cultivo mayores aplicando unas gotitas de solución de etanol 70% encima de ellos y pasar a través de la llama de un mechero de Bunsen. Si utiliza el inóculo de un tubo de cultivo congelado, sólo que caliente hasta la temperatura ambiente con el tubo de sellado bajo la llama de un mechero de Bunsen.
- Si el inóculo de otra cultura en una botella de vidrio, inocular 1 mL de la mayor cultura en el medio fresco. Si el inóculo de un stock congelado, inocular solamente 0,1 mL para diluir el glicerol o dimetil sulfóxido (DMSO) utilizado en el proceso de congelación. En ambos casos, utilice una aguja estéril y una jeringa estéril.
- Incubar el cultivo a 32 ° C e inocular en medio fresco después de 4 a 7 días.
- Inoculación de MSR-1 en medio semisólido gradiente de O2
- Verifique que el tubo de medio fresco muestra una OAI bien definido, materializado por un color de rosa a incoloro interfaz.
- Si el inóculo procede de otra cultura semisólida gradiente de la concentración de O2 , recoger las bacterias por Pipetear 50 μl de la cultura con una pipeta estéril a la banda formada por las bacterias. Lentamente inocular estas bacterias en la OAI en el medio fresco (interfaz de color de rosa/descolorido), evitando molestar a la interfaz. Si el inóculo procede de una cultura congelada, proceda de la misma manera con 100 μl del inóculo en su lugar.
- Sellar el tubo y deje que las bacterias crecen entre 25 ° C y 30 ° C. Transferencia a medio fresco con el mismo procedimiento antes de la banda de bacterias llega a la superficie del medio.
4. observación de las bacterias
- Esterilizar el tapón de la botella de cultivo aplicando solución de etanol 70% en la parte superior y pasar por la llama de un mechero de Bunsen. Para el medio semisólido, abra el tubo con la llama de un mechero de Bunsen. Use una aguja estéril y una jeringa estéril para extraer las bacterias.
- Uso el colgante gota método8 para asegurar que las bacterias son magnéticas y móviles.
Nota: Microscopio de contraste de fase da grandes resultados pero no es obligatorio. Son aumentos que van desde 10 X hasta 60 X. - Utilizar microscopia electrónica de transmisión (TEM) para observar la estructura celular y los magnetosomes en detalle8.
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Representative Results
Exitosa preparación de los medios de crecimiento puede ser evaluada como sigue. Al final del proceso, claro soluciones (es decir., libre de cualquier precipitado) se debe obtener (esto es válido para los medios líquidos y el medio semisólido gradiente de O2 ). Una foto mostrando el aspecto esperado de medio líquido de MSR-1 antes de la inoculación puede verse en la Figura 2a. Un éxito medio semisólido O2 gradiente de concentración se señala por la formación de una OAI después de unas horas, indicada por la presencia de 1 – 3 cm de color rosa medio en la parte superior del tubo (figura 3, tubo). El resto del medio debe ser incoloro. Un medio del todo color de rosa antes de la inoculación es un signo de oxidación completa de la resazurina y por lo tanto, de una realización fracasada del gradiente de la concentración de O2 .
Exitoso crecimiento en medio líquido se puede comprobar aproximadamente 48 h después de la inoculación (o después de algunos días si el inóculo procede de una cultura congelada) simplemente mediante el examen de las culturas de turbidez usando una fuente de luz o un espectrofotómetro. Crecimiento exitosa se confirma por turbidez demostrando que las bacterias crecieron realmente (figura 2b). Si el medio queda claro después de 48 h, las bacterias no han crecido. Para una cultura del medio líquida creciendo normalmente, puede comprobarse la presencia de bacterias, síntesis de magnetosomes después de 48 h colocando la botella de medio en una placa de agitación magnética y por iluminar con una linterna. En una baja velocidad de agitación, el medio debe "flash", mirando alternativamente más oscuro y brillante dependiendo de la orientación del imán respecto a la posición del experimentador agitación. Para una cultura no-magnético, la intensidad de luz dispersada por las células hacia el experimentador permanecerá constante.
Exitoso crecimiento en medio semisólido se indica mediante la formación de una banda microaerophilic bacterias en la interfaz de color de rosa/incoloro. Debido al consumo de O2 por las bacterias y los cambios en el gradiente de O2 , la banda se migrará lentamente para seguir la OAI (figura 3, tubo B).
El colgante gota método permite al observador para comprobar que las bacterias son magnéticas y móviles. Después de unos minutos, MTB debería concentrarse en el borde de la gota colgante, demostrando que nadan activamente a lo largo de las líneas de campo magnético (figura 4a). Para asegurarse de que las células son magnéticas, voltear la orientación del imán está sentado al lado de la gota. La bacteria debe empezar a nadar hacia la orilla opuesta (Figura 4b). Por último, la forma de los magnetosomes puede comprobarse con TEM. Cristales cubo-octaédricos de unos 30 – 45 nm de diámetro debe observarse9. Estos cristales se arreglan normalmente en una larga cadena o varias cadenas más cortas en las especies aquí estudiaron (figura 5).
Figura 1 : Ilustración de N2 estación de gas. (a) representación esquemática. (b) imagen de la instalación. Una estación exitosa tendrá la longitud adecuada del tubo grande y fina de modo que el extremo de la tubería fina que se describe en paso 1.9 del protocolo permanece inmerso en el medio durante el paso de burbujas de gas. El flujo de gas también debe ser ajustable en todo momento, para asegurarse de que todos O2 se quita y que el medio no derrame. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Botellas de medio de crecimiento líquido antes y después de la inoculación de. (a) clara MSR-1 medio antes de la inoculación. medio (b) turbio MSR-1 después de tres días de exitoso crecimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Tubos de O2 gradiente medio semisólido antes (tubo A) y 10 días después de la inoculación (tubo B). La banda de bacterias en el tubo B se indica mediante una flecha roja.
Figura 4 : Resultados típicos de una gota colgante experimentan a 20 X magnificación con microscopio de contraste de fase. (un) MTB nadan hacia el polo sur de un imán y se acumulan en la interfase aire/líquido. (b) 1 min después de girar el imán, la mayoría de las células ha dejado el campo de visión.
Figura 5 : Observación de TEM de un celular AMB-1. Cadenas de Magnetosome se indican con flechas rojas. Los dos flagelos se indican mediante flechas negras.
Complementario tabla 1. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Los requisitos específicos de concentración de2 O de MTB hacen no trivial para crecer en el laboratorio. Un paso clave del Protocolo de medio líquido es la eliminación inicial de todos O2 del medio para el control de la concentración final mediante la adición de un volumen definido de O2, justo antes de la inoculación. Se ha demostrado que el MSR-1 crece en condiciones aerobias casi completamente, sin embargo, el magnetismo de las células se reduce drásticamente. Los resultados del mismo estudio demostraron que las cepas 1 AMB y 1 MS no crecen bajo condiciones totalmente aeróbico6. Para el cultivo semisólido de MSR-1, O2 se reduce primero por la solución de cisteína y entonces aparece el gradiente de la concentración de O2 , conduciendo a la formación de la OAI. Si una cultura no crece bien o no es magnética, la concentración de O2 debe ser lo primero a comprobar.
Medio de cultivo semisólido es una interesante opción para aislar MTB desconocido o el crecimiento de las especies que son muy sensibles a ambos gradientes O de2 y redox, ya que asegura la existencia de gradientes estables y permite a las bacterias a posicionarse en el la ubicación que ofrece las mejores condiciones de crecimiento. Medio líquido es más conveniente trabajar con cuando se necesitan mayores volúmenes (e.g., para la extracción de ADN), o cuando necesita más análisis que se llevará a cabo en las células (e.g., estudios magnetosome) ya que permite una más fácil separación de las células de el medio de crecimiento. El agar en medio semisólido de hecho podría interferir con la célula técnica de la cosecha.
En algunas culturas, las células a veces se convierten en no-motile, probablemente debido a mutaciones espontáneas. Las células no-motile sobreviven y crecen en el medio de crecimiento, ya que no necesitan nadar para encontrar nutrientes necesarios para su supervivencia. La pista estándar de carreras método10 puede utilizarse entonces para recuperar una cultura mótiles ya células móviles sólo pueden nadar hacia abajo de la pista de carreras. La pérdida del fenotipo magnética puede ocurrir también en la cultura aunque la concentración de O2 es óptima, otra vez debido a mutaciones espontáneas11. En ese caso la mejor solución es iniciar una nueva cultura inoculando congelado las poblaciones de las bacterias de tipo silvestre en medio fresco. Por otra parte, la técnica de la pista de carreras también puede permitir la recuperación de una cultura magnética.
Es esencial para evitar la contaminación de la cultura por otros organismos y por lo tanto la mayor parte del protocolo debe realizarse usando técnicas estériles. Manipular bajo la llama de un mechero de Bunsen generalmente da resultados satisfactorios para mantener condiciones de asepsia. Sin embargo, si el cultivo es crecido en un ambiente propenso a la contaminación, adicionales deben tomarse precauciones, trabajar en campana de flujo laminar al preparar el medio como inocular la bacteria. Cabe señalar que el riesgo de contaminación es mayor en medio semisólido como los tubos deben abrirse cada vez que se eliminan las células.
Estos protocolos permiten el crecimiento de suficientes bacterias para realizar muchos tipos de experimentos, tales como estudios físicos basados en microscopía óptica12,13, microscopia electrónica de14,15, Rayos x spectromicroscopy análisis16, genómica y proteínas estudios17,18. Si es necesario, mayores concentraciones de bacterias en suspensión se logra mediante centrifugación. Además, puede extraerse y purificarse para más aplicaciones de gránulos de la célula o suspensiones celulares densos obtenidos por centrifugación19magnetosomes.
Formulaciones de medios de crecimiento generalmente se basan en los mismos principios rectores (ver complementarios tabla 1 para un resumen de la lista de la función de cada componente en los medios de crecimiento descritos aquí). Una fuente de carbono debe estar disponible para las bacterias, por medio de ácidos orgánicos (por ej., acetato, succinato, lactato, tartrato) o compuestos inorgánicos como el bicarbonato. La elección de una fuente de carbono adecuada depende el metabolismo de las bacterias. Nitrógeno presente en ADN y proteínas y fósforo (ADN, membranas) también son necesario y proporcionados por NaNO3, NH4Cl y KH2PO4 en las recetas se describen aquí. Un buffer (HEPES, tampón fosfato) es necesario para resistir cambios de pH. La solución de suplemento mineral traza contiene cofactores de las enzimas y las vitaminas pueden utilizarse por las bacterias como coenzimas o grupos funcionales de ciertas enzimas. Peptona de haba de soja y extracto de levadura proporcionan una fuente de aminoácidos y sales utilizadas para la producción de proteínas. Desde MTB son redox sensible, uno o varios agentes reductores a menudo debe añadirse al medio (e.g., cisteína, ácido ascórbico, lactato). Una fuente importante de hierro (por ej., citrato férrico, férrico cloruro de hierro, quinate) es necesario en el medio de biomineralización. Por último, una pequeña cantidad de O2 se requiere para las bacterias microaerofílicas como aceptador terminal del electrón. Obliga uso MTB anaerobio otros compuestos como el nitrato o el óxido nitroso en su lugar.
La principal limitación de estos protocolos es que no hay ninguna garantía de que trabajan para otras especies de MTB. Las cepas AMB-1, MS-1 y MSR-1 son MTB todo agua dulce y por lo tanto, las recetas se describen en este artículo no pueden utilizarse para crecer Marina magnetospirilla como Magnetospira thiophila cepa MMS-1, cepa Magnetospira QH-2 u otra MTB marine, que requieren altas concentraciones de sal. Sin embargo, para cultivar otras cepas de MTB y para el aislamiento de nuevas cepas, los métodos generales presentados en este artículo para los medios líquidos y semi sólidos pueden utilizarse para preparar los medios de comunicación con diferentes recetas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Richard B. Frankel por su ayuda con MTB culturas Adam P. Hitchcock y Xiaohui Zhu su apoyo durante la configuración de las culturas MTB en la Universidad de McMaster y Marcia Reid para la formación y el acceso a las instalaciones de microscopía electrónica (McMaster University, Facultad de Ciencias de la salud). Este trabajo fue apoyado por las ciencias naturales e Ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC) y la Fundación Nacional de ciencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 - 12 N |
References
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