Vi presenterar ett förfarande för att odla flera stammar av Magnetospirillum i två olika typer av tillväxtmassmedia. Magnetospirillum gryphiswaldense stam MSR-1 odlas i både flytande och O2 koncentrationsgradient halvfasta media medan M. magneticum stam AMB-1 och M. magnetotacticum stam MS-1 odlas i flytande medium.
Magnetotactic bakterier är gramnegativa, rörliga, främst vattenlevande prokaryoter som är allestädes närvarande i sötvatten och marina livsmiljöer. De kännetecknas av sin förmåga att biomineralize magnetosomes, som är magnetiska nanometer stora kristaller av magnetit (Fe3O4) eller greigite (Fe3S4) omgiven av en lipid lipidens membran, inom deras cytoplasman. För de flesta kända magnetotactic bakterier monteras magnetosomes i kedjor inuti cytoplasman, därmed ger en permanent magnetiskt dipolmoment till cellerna och orsakar dem att anpassa passivt med externa magnetfält. På grund av dessa särdrag har magnetotactic bakterier en stor potential för kommersiella och medicinska tillämpningar. Men de flesta arter är microaerofil och har specifika O2 koncentration krav, vilket gör dem svårare att växa rutinmässigt än många andra bakterier som Escherichia coli. Här presenterar vi detaljerade protokoll för växande tre av de mest studerade stammarna av magnetotactic bakterier, alla som tillhör släktet Magnetospirillum. Dessa metoder möjliggör exakt kontroll av O2 koncentrationen görs tillgängliga för bakterier, för att säkerställa att de växa normalt och syntetisera magnetosomes. Växande magnetotactic bakterier för ytterligare studier med hjälp av dessa förfaranden kräver inte experimentalist vara expert i mikrobiologi. De allmänna metoder som presenteras i den här artikeln kan också användas för att isolera och kultur andra magnetotactic bakterier, även om det är sannolikt att tillväxt medier kemiska sammansättning kommer att behöva ändras.
Magnetotactic bakterier (MTB) representerar ett brett utbud av gramnegativ prokaryoter allestädes närvarande i sötvatten och Marina akvatiska livsmiljöer1. Dessa bakterier dela förmågan att producera magnetiska kristaller av antingen magnetit (Fe3O4) eller greigite (Fe3S4), som har de flesta fall monteras till kedjor inuti cellerna. Detta särskilda strukturella motiv beror på närvaron av flera specifika proteiner som agerar både i cytoplasman av bakterier och på lipid membranet som omger varje kristall2. Varje enskild kristall och dess omgivande membran vesikler kallas en magnetosome och är varierar i storlek från ca 30 till 50 nm i Magnetospirillum Art3. På grund av kedjan ordningen av magnetosomes besitter dessa bakterier en permanent magnetiskt dipolmoment som gör dem justera passivt med anbringas utanpå magnetfält. Därför, dessa bakterier aktivt simma längs magnetiska fältlinjer, agerar som självgående mikro-kompasser förmodligen till mer effektivt lokalisera de mest gynnsamma villkor (t.ex., O2 koncentration) för tillväxt.
En intressant egenskap av MTB är deras förmåga att reglera både kemi och kristallografi av deras magnetosome kristaller. De flesta stammar producerar relativt hög renhet kristaller av antingen magnetit eller greigite, även om vissa biomineralize båda mineraler4. Bakterierna är i alla fall kunna kontrollera exakt storleken och formen på deras enda magnetiska domän kristaller. Detta förklarar varför en stor mängd forskning är åtagit sig att utveckla en bättre förståelse av hur MTB utföra proceduren biomineralization. Förstå denna process kan ge forskarna att skräddarsy magnetiska nanokristaller för många kommersiella och medicinska tillämpningar.
Ett betydande hinder för omfattande forskning på MTB har varit svårigheten att odla dem i laboratoriet. De flesta arter, inklusive de stammar som används i detta arbete är frövivlar namnet när vuxit med O2 som en terminal Elektronacceptor. Detta förklarar varför dessa bakterier finns oftast vid övergångszonen mellan genotoxisk och anoxiska förhållanden (oxic-anoxiska gränssnittet, OAI). Detta visar tydligt att MTB har exakt O2 koncentration krav som uppenbarligen behöver beaktas när utforma Odlingsmedier för dessa organismer. Dessutom innebär MTB befintliga mångfald att olika stammar kommer att behöva olika typer av kemiska gradienter och näringsämnen för att uppnå optimal tillväxt.
I detta arbete, beskriver vi metoderna för odling av tre av de mest studerade MTB: Magnetospirillum magneticum (stam AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) och M. gryphiswaldense (MSR-1). Dessa arter fylogenetiskt tillhör klassen Alphaproteobacteria i den Proteobacteria stammen, är spiralformade i morfologi och besitter en polar flagellen i varje ände av cellen. Vi tillhandahåller protokollen för växande stam MSR-1 i både flytande och O2 koncentrationsgradient halvfasta media, baserat på tidigare publicerade medelstora recept5,6. Vi presenterar också ett detaljerat protokoll för växande stammar AMB-1 och MS-1 i modifierade magnetiska Spirillum tillväxt Medium (MGSM)7.
De särskilda O2 koncentration kraven i MTB gör dem icke-trivialt att växa i laboratoriet. Ett viktigt steg för protokollet för flytande medium är inledande avlägsnande av alla O2 från medlet för att styra slutliga koncentration genom att lägga till en bestämd volym av O2, strax före inympning. Det har visat att MSR-1 växer under nästan helt aeroba förhållanden, dock är magnetism av cellerna är drastiskt. Resultaten från samma studie visade att stammar AMB-1 och MS-1 int…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Richard B. Frankel för hans hjälp med MTB kulturer, Adam P. Hitchcock Xiaohui Zhu för deras stöd medan inställningen upp MTB kulturer vid McMaster University och Marcia Reid för utbildning och tillträde till anläggningen elektronmikroskopi (McMaster University, Hälsouniversitetet). Detta arbete stöds av de naturliga vetenskaperna och Engineering Research rådet av Kanada (NSERC) och oss National Science Foundation.
AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
Resazurin | Difco | 0704-13 | |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
NaCl | Caledon | 7560-1 | |
NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
25G x 1 needles | BD | 305125 | |
125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 – 12 N |