Summary
نقدم هنا بروتوكولا مورين في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي مع البيوتين. هذا البروتوكول يتضمن معلومات عن كيفية نتخلل الكلي الماوس وعزل glomeruli وأداء إيمونوبريسيبيتيشن الذاتية من بروتين الفائدة.
Abstract
بروتينية ناتجة عن تعطيل عامل التصفية الكبيبي الذي يتكون البطانة فينيستراتيد والغشاء الكبيبي، وبودوسيتيس مع أغشية شق بهم. هيكل حساسة لتصفية الكبيبي، لا سيما الشق الحجاب الحاجز، يعتمد على التفاعل بين البروتينات السطحية الخلية المتنوعة. دراسة هذه الخلية البروتينات السطحية كانت حتى الآن محدودة للدراسات في المختبر أو تحليل النسجية. نقدم هنا، بيوتينيليشن مورين في فيفو وسم الأسلوب الذي يتيح دراسة الخلية الكبيبي البروتينات السطحية تحت الظروف الفسيولوجية وباثوفيسيولوجيك. هذا البروتوكول يتضمن معلومات عن كيفية نتخلل الكلي الماوس وعزل glomeruli وأداء إيمونوبريسيبيتيشن الذاتية من بروتين فائدة. كوانتيتيشن شبه خلية الكبيبي السطحية الوفرة متاحة بسهولة مع هذا الأسلوب الرواية، والوصول إلى نضح البيوتين جميع البروتينات ويمكن دراسة إيمونوبريسيبيتيشن. وباﻹضافة إلى ذلك، عزل glomeruli مع أو بدون بيوتينيليشن تمكن مزيد تحليل الكبيبي الجيش الملكي النيبالي والبروتين، فضلا عن ثقافة الخلية الكبيبي الأولية (أي، بودوسيتي الرئيسية الخلية الثقافة).
Introduction
بيله هو السمة مميزة للإصابة الكبيبي، وعادة ما يصاحب اضطراب تصفية الكبيبي1. وتتألف التصفية الكبيبي البطانة فينيستراتيد والغشاء الكبيبي، وبودوسيتيس. التركيب الجزيئي الدقيق لتصفية الكبيبي درجة عالية من الديناميكية ورهنا بروتين سطح الخلية الاتجار في كلا الكليتين صحية والمريضة2،3،،من45،6 . ثبت الالتقام بروتينات السطحية خلية أساسية لبقاء بودوسيتيس7. نيفرين وبودوكاليكسين بالبروتينات ترانسميمبراني أعرب عن بودوسيتيس. نيفرين هو العمود الفقري للغشاء الكبيبي طولية، بينما بودوكاليكسين سيالوجليكوبروتين طلاء العمليات الثانوية سيرا على الأقدام من بودوسيتيس8،،من910. الاتجار اندوسيتيك سابقا وقد تبين نيفرين وبودوكاليكسين3،،من1112،،من1314.
على حد علمنا، الالتقام الخلية البروتينات السطحية قد لا بعد وصفت في خلايا بطانية الكبيبي في الأدب. ومع ذلك، عموما خلايا بطانية التعبير عن جميع البروتينات اللازمة لأنواع مختلفة من الالتقام (أي، تعتمد على كلاثرين، وتعتمد على طوف الالتقام)15،16. ولذلك، قد درس الاتجار بسطح الخلية البطانية بهذا الأسلوب باستخدام، على سبيل المثال، الأوعية الدموية غشائي (هاء)-كادهيرين وجزيء الالتصاق داخل الخلايا (ICAM-2) كخلية سطح البروتين علامة لخلايا بطانية الكبيبي17 .
ولسوء الحظ، ليس هناك دقيقة في المختبر نموذج لحساسة الطبقات الثلاث الكبيبي عامل التصفية في الخلية التي يمكن دراستها الاتجار بالبروتين السطحي. والهدف من هذا الأسلوب التالي لدراسة البروتين الكبيبي الاتجار في فيفو. وبالإضافة إلى ذلك، يتضمن هذا البروتوكول معلومات عن كيفية عزل glomeruli، تمكين مزيد من التحليل الكبيبي الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات، أو خلايا. عزل الكبيبي مماثلة قد وصفت التقنيات بمختلف المجموعات18،19.
سابقا، ونحن وآخرون قد استخدمت السابقين فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي بيوتينيليشن2،3،4،،من2021. ومع ذلك، في هذا الأسلوب السابقين فيفو ، تعرضت glomeruli معزولة للإجهاد الميكانيكي، والتي قد تؤثر على الاتجار اندوسيتيك. وبدلاً من ذلك، على نطاق واسع قد استخدم الفلورة وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي في الأدب2،،من2022. مع هذا الأسلوب، ومع ذلك، يمكن تحليلها إلا عدد قليل من البروتينات داخل شريحة واحدة، وكوانتيتيشن الصور الفلورة في كثير من الأحيان صعبة.
يوفر هذا الأسلوب الرواية في فيفو أداة موثوقة لدراسة الخلية الكبيبي البروتين السطحي وفرة والاتجار دقة في صحية ومريضة الكلي، ويمكن استخدامه كإضافة إلى اختبارات الفلورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتم الحصول على الفئران كسلالة داخلية من مرفق الرعاية الحيوانية المحلية أو من "مختبرات جانفييه" في فرنسا. التحقيقات التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية الواردة في الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (الولايات المتحدة الوطنية معاهد للصحة المنشور رقم 85-23، تنقيح عام 1996). أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للموافقات ذات الصلة المؤسسية (حكومة ولاية لانوف مرجع رقم AZ:84-02.04. 2016.A435).
1-إعداد الأدوات والحلول، والمعدات
- تحضير 1 لتر من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة وتستكمل مع كلوريد المغنيسيوم 1 مم (MgCl2) وكلوريد الكالسيوم 0.1 ملم (كاكل2) (ببسكم) وتصفيته من خلال عامل تصفية عقيمة.
- إعداد 5 مل ببسكم العقيمة كل الماوس التروية ووضعه على الجليد.
- لكل الماوس، وإعداد 5 مل ببسكم العقيمة وتستكمل مع البيوتين 0.5 ملغ/مل.
- لكل الماوس، إعداد 5 مل ببسكم العقيمة وإضافة 0.8 x 108 حبات مغناطيسية (مثلاً.، 200 ميليلتر 4 × 108 حبات مليلتر الحل، دون معالجة مسبقة) الانصمام glomeruli. إعداد هذا الحل تحت مقاعد البدلاء ثقافة الخلية لإبقاء الخرز المغناطيسية في الأنبوب الأصلي العقيمة. وضع هذا الحل على الجليد.
- إعداد حل التبريد بإضافة 100 مم جليكاين إلى ببسكم (5 مل في الماوس) وإبقائه على الجليد.
- جعل حلاً كولاجيناز (0.378 يو/مليلتر كولاجيناز أ في ببسكم معقمة). كل الماوس، "الماصة؛" 1 مل الحل كولاجيناز في أنبوب 2 مل ووضعه على الجليد.
- للغسيل، وإعداد ببسكم العقيمة (راجع الخطوة 1، 1) في 50 مل أنبوب ووضعه على الجليد.
- التروية، استخدام مضخة المحاقن مع تدفق 2.0 مل/دقيقة.
- إعداد حقنه 10 مل بإبرة ز 21. ضع طرف الإبرة في قسطرة طويل 20-30 سم (القطر الداخلي، معرف = 0.58 mm). توصيل القسطرة (معرف 0.58 mm) مع قسطرة قصيرة 10 سم (معرف 0.28 ملم) وقطع طرف القسطرة أصغر منحرف لإدراج سهلة في الشريان الاورطي الماوس.
- حرف مزدوج إجراءات أثناء الجراحة، لقطع 5-7 سم الحرير الخيوط الثلاثة (4-0 6-0) للماوس.
- للجراحة، وإعداد 3 المشابك الجراحية والمقص الجراحي 2، ملاقط 2، ملاقط غرامة 2، 1 مقص غرامة، ومسحات. إعداد التخدير (مثل التخدير داخل الكيتامين وزنها 100 مغ/كغ وإكسيلازيني 5 مغ/كغ وزن الجسم).
- لعزل glomeruli لهاتين الكليتين، استخدام مصفاة خلية 100 ميكرومتر وانبوبين 50 مل الماسك مغناطيس.
- إعداد الفصول تحلل المخزن المؤقت: 20 مم 3-[(3-cholamidopropyl) ديميثيلامونيو]-1-بروبانيسولفوناتي (الفصول)؛ 20 مم تريس (هيدروكسيميثيل)-أمينوميثان (تريس) الرقم الهيدروجيني 7.5؛ سوديومتشورليدي 50 ملم (كلوريد الصوديوم)؛ سوديومفلوريدي 50 ملم (NaF)؛ 15 ملم غ4ف2س7؛ مم 0.1 الإيثيلين حمض (يدتا) pH 8.0; سوديومورثوفاناداتي 2 مم؛ ومم 2 أدينوسينيتريفوسفات (ATP).
- بارد من أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
2-الجراحة تحت المجهر
- تخدير الماوس (مثلاً، مع الكيتامين/إكسيلازيني إينترابيريتونيلي، راجع الخطوة 1.11). إجراء اختبار تو-قرصه لتأكيد التخدير المناسب.
- تطهير الجانب البطني للماوس مع الايزوبروبانول 70%.
- إجراء خفض متوسط عن طريق الجلد من الحوض إلى القص وإزالة الجلد من لفافة البطن باستخدام الملقط. قطع الجلد على كلا الجانبين في منتصف البطن مع المقص الجراحي.
- تغيير الأدوات الجراحية. تطبيق خفض متوسط من الرهابه إلى المثانة من خلال طبقة العضلات البطن وتقسيمها إلى أربعة أجزاء باستخدام الملقط، والمقص الجراحي. إرفاق جانبا اثنين العلوي مع المشابك نحو رقبة الماوس مع المشابك الجراحية اثنين.
ملاحظة: يتم الآن فتح البطن. - وضع أجهزة الحشوي جانبا مع مسحه معقمة وقطع في الرباط الكبد فرنك مع مقص جيد.
- إعداد ربط (مع خيط حرير 4-0 6-0) حول الشريان الاورطي الدانية الشرايين الكلوية على ارتفاع الغدة الكظرية مع ملاقط غرامة اثنين. أحكم ربط الابهر الدانية إلغاء تدفق الدم بالملقط.
- مجاناً الابهر القاصي من اللفافة والدهون والأنسجة الأخرى وإعداد ربط حول الشريان المساريقي العلوي/الكبد الجمجمة الشرايين الكلوية استخدام الملاقط الجراحية الدقيقة.
- تعد عملية ربط (مع خيط حرير 4-0 6-0) حول الابهر القاصي الشرايين الكلوية والمشبك في الوريد الأجوف والشريان الاورطي في ذروة التشعب.
- قطع ثقب صغير في الشريان الاورطي القاصي للشرايين الكلوية حيث أن الثقب هو نصف قطر الشريان الاورطي. وضع القسطرة في الشريان الاورطي وإصلاحه مع حرف مزدوج الاستعداد.
تحذير: تجنب فقاعات في نظام التروية لمنع الانسداد الهواء. - تبدأ نضح ببسكم المثلج بمعدل تدفق 2 مل/دقيقة.
- قطع ثقب الوريد الكلوي على مستوى الشرايين الكلوية مع غرامة المقص الجراحي وتشديد الربط حول الشرايين الكبدية والمساريقي العلوي.
ملاحظة: الكلي ينبغي أن تتحول شاحب بعد البدء في التروية.
3. في فيفو بيوتينيليشن
- تغير المحاقن خالية الفقاعة إلى ببسكم المثلج وتستكمل مع البيوتين 0.5 ملغ/مل للسطح وضع العلامات، ونتخلل الكلي مع 5 مل بمعدل تدفق 2 مل/دقيقة.
ملاحظة: مزيج الحلول ببسكم (مثلاً، عن طريق تحويل أنابيب 50 مل) برفق لتجنب تشكيل فقاعات داخل الحل. وبعد التطلع للحل ضمن المحاقن، إجلاء أي فقاعات أو الهواء من المحاقن. استخدام قنية إضافية (21 ز) في المحاقن لملء الفراغ في قنية متصل بنظام القسطرة. وأخيراً، التمسك حقنه في القنية بالقسطرة دون فقاعات. - تغيير المحاقن خالية من الفقاعة إلى ببسكم المثلج وتستكمل مع 100 مم جليكاين آرو جلوميرولي، ونتخلل مع 5 مل في تدفق 2 مل/دقيقة.
- تغير المحاقن خالية الفقاعة إلى ببسكم المثلج وتستكمل مع 200 ميكروليتر المغناطيسي الخرز مليلتر ونتخلل الكلي في 2 مل/دقيقة.
ملاحظة: على السطح الكلي، سوف يكون الانصمام glomeruli مع البنى الخرز المغناطيسي مرئية.
4-عزل جلوميرولي من هاتين الكليتين
- قم بإزالة الكلي في هيلم والكبسولة. مكان الكليتين على الجليد في 15 مل ببسكم في طبق ثقافة خلية 10 سم. Euthanize الماوس مع التفكك عنق الرحم تحت التخدير بعد الحصاد الكلي. إجراءات جراحة ونضح الماضي حوالي 20-22 دقيقة.
- قص الكلي إلى قطع أصغر ممكن مع شفرة مزدوجة حافة جديدة. نقل الأنسجة في أنبوب 2 مل مع 1 مل كولاجيناز A (راجع الخطوة 1، 6) وخلاصة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قبل وبعد الهضم، تخلط بلطف مع 1000 ميكروليتر قطع ماصة.
- شطف الأنسجة هضمها من خلال 100 ميكرومتر مصفاة خلية باستخدام ببسكم المثلج. بلطف استخدام الخلية-مكشطة فرم الحوض الأنسجة المتبقية مصفاة الخلية وشطفه مع ببسكم المثلج بعد ذلك إلى إجمالي حجم 50 مل.
- الطرد المركزي بتعليق على 4 درجة مئوية 500 x غ 5 الحد الأدنى إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع أقل قليلاً من 1.5 مل ببسكم المثلج بينما فورتيكسينج بيليه. وبعد ذلك، وضع تعليق الكبيبي في أنبوب 2 مل جديدة.
5-الغسيل
- استخدام الماسك المغناطيس لسحب glomeruli لجانب واحد. انتظر 1 دقيقة قبل glomeruli قد تحرك باتجاه المغناطيس.
- إزالة المادة طافية مع 1000 ميكروليتر ماصة بينما لا يزال أنبوب 2 مل في الماسك المغناطيس. أثناء الغسل الأول والثاني خطوات (راجع الخطوة 5، 3)، 250 ميكروليتر الجثث طافية في أنبوب لتجنب فقدان glomeruli. تنفيذ هذا الإجراء بسرعة لتجنب ترك أنبوبي الهياكل تنزل إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
ملاحظة: الإجراء الغسيل سوف تستمر لفترة أطول لولا ذلك. - إزالة أنبوب 2 مل من الماسك المغناطيس وإضافة 1 مل ببسكم، ماصة صعودا وهبوطاً (مهم جداً)، ثم دوامة.
- إعادة وضع الأنبوب في الماسك المغناطيس والبدء من جديد مع الخطوة 5.2.
- كرر الخطوات الغسيل حتى نقاء glomeruli بلغت 90%. لهذا، يدرس قاسمة ممثل من المادة طافية تحت مجهر (40-100 س).
ملاحظة: سوف تظهر Glomeruli كجولة الهياكل التي تحتوي على حبات مغناطيسية براون. هياكل ممدود شظايا أنبوبي، والخرز المغناطيسي مجاناً تظهر كنقط جولة براون. قد تظهر الخلية الحطام كالهياكل الضخمة. - إذا تم التوصل إلى النقاء، تقدير عدد جلوميرولي بحل جلوميرولي في 1 مل ببسكم. بعد خلط، تأخذ قاسمة 10 ميكروليتر وتعول glomeruli تحت المجهر. حساب عدد جلوميرولي بالمعادلة التالية: العدد النهائي ل glomeruli = عدد جلوميرولي في 10 ميكروليتر x 100 اليكووت.
- نجاح عزل glomeruli يؤدي إلى مجموعة من 10,000 40,000 glomeruli.
6-البروتين الاستخراج وإيمونوبريسيبيتيشن (IP)
- جمع glomeruli بالطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 6800 ز x للحد الأدنى 5 إزالة المادة طافية أثناء استخدام الماسك مغناطيس وريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت لتحلل المثلج (على سبيل المثال-، glomeruli 30,000 في ميكروليتر 300؛ الفصول، راجع الخطوة 1، 11). مجانسة العينات مع الخالطون أنسجة على أعلى سرعة لمدة 30 ثانية ولهم على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- إزالة المواد غير قابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي في 15,000 س ز لمدة 30 دقيقة على 4 درجة مئوية. "الماصة؛" المادة طافية الذي يتضمن الخلية ليساتي في أنبوب 1.5 مل جديدة. تجاهل بيليه.
- قياس تركيز البروتين من المادة طافية باستخدام بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي)-على أساس طريقة اتباع إرشادات الشركة المصنعة. تحلل ناجحة من 30,000 glomeruli غلة على كمية بروتين الكبيبي 700 1,000 ميكروغرام/مل. ضبط لكميات متساوية من البروتين مع تحلل المخزن المؤقت.
- تأخذ قاسمة 10% من الحجم الإجمالي الكبيبي ليستي وإضافة 2 × لايملي + ديثيوثريثول (DTT) قبل الحضانة لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية.
- للملكية الفكرية، واحتضان بقية ليساتي مع ستريبتافيدين [اغروس] الخرز بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر النفقات عامة.
- الطرد المركزي الخرز [اغروس] في ز 1000 x لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية، وإضافة 800 ميكروليتر من تحلل المخزن المؤقت لغسل الخرز لربط البروتين غير محدد.
- تكرار الغسيل 3 مرات، وإزالة المادة طافية تماما.
- إضافة 30 ميكروليتر من 2 × لايمملي + DTT واحتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تحميل والمسابير الملكية الفكرية على المخزونات 10% جل وتشغيل هلام الحزب الديمقراطي الصربي في 70 الخامس لمدة 30 دقيقة، ثم في 20 مللي أمبير لكل جل ل 1.5 h. بعد ذلك لطخة الهلام ح 2 200 mA في غشاء النيتروسليلوز.
- كتلة الغشاء النيتروسليلوز بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع ألبومين المصل البقري 5% (BSA) في الغسيل المخزن المؤقت.
- احتضان الغشاء بالضد المصالح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. يغسل مع الغسيل المخزن المؤقت 3 مرات لمدة 5 دقائق على شاكر واحتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الثانوية معلم برنامج الصحة الإنجابية ح 1 في درجة حرارة الغرفة. كرر الخطوة الغسيل.
- تصور ويَسْبِر إيمونوبريسيبيتيشن على الغشاء باستخدام عامل تشيميلومينيسسينت قرار فائقة مع كاميرا CCD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لعزل جلوميرولي بدقة، من الضروري أن نتخلل موريني الكلي مع ببسكم أولاً. يتحول التروية مع ببسكم الكلي شاحبة (الشكل 1أ). الانصمام glomeruli مع الخرز المغناطيسي سوف تظهر كنقط بني على السطح الكلي (الشكل 1ب). قد تظهر عزلة glomeruli مع الماسك المغناطيس التلوث مع توبولي الكلوي (الشكل 1ج). قبل المزيد من التحليل ل glomeruli، درجة نقاء > 95% من جلوميرولي يحتاج إلى تحقيقه بالغسيل glomeruli أكثر دقة (الشكل 1د).
في فيفو بيوتينيليشن يعتمد على القدرة على تسمية الخلية البروتينات السطحية مع البيوتين. لدراسة هذا، هي perfused موريني الكلي مع ببسكم أو البيوتين نفاذية غشاء الخلية. كما هو مبين في الشكل 2، البيوتين تسميات الحلقات الشعرية في perfused البيوتين ولكن ليس في عنصر تحكم الماوس الكليتين. للتحقيق في الخلية البروتينات السطحية من الكبيبة المسمى من قبل في فيفو نضح البيوتين، يتم إيمونوبريسيبيتيشن الكسر البيوتين من مقتطفات الكبيبي. الشكل 3 يوضح أن البروتينات transmembrane الكبيبي نيفرين وبودوكاليكسين من إيمونوبريسيبيتاتيد داخل الكسر البيوتين. ومع ذلك، في مكافحة الفئران، لا نيفرين أو بودوكاليكسين يتم الكشف عن في جزء إيمونوبريسيبيتاتيد من البروتينات بيوتينيلاتيد. كعنصر تحكم سلبية، ينظم خارج الخلية البروتين داخل الخلايا-الإشارة p42 مؤنزم و p44 (إيرك) غير موجودة في جزء إيمونوبريسيبيتاتيد من البروتينات بيوتينيلاتيد للتحكم والماوس perfused البيوتين الكليتين. لتأكيد أن نيفرين بروتين سطح الخلية فعلا بيوتينيلاتيد بهذا الأسلوب، عجل نيفرين من التحكم والماوس perfused البيوتين الكليتين. تصور البيوتين، هو الملون الكسر إيمونوبريسيبيتاتيد مع ستريبتافيدين. الشكل 3 ب يظهر نيفرين بيوتينيلاتيد في perfused البيوتين ولكن عدم السيطرة على الحيوانات. ضوابط ليساتي تشير إلى كميات متساوية من البروتين في السيطرة والحيوانات perfused البيوتين. بروتين غشائي الأوعية الدموية غشائي (هاء)-كادهيرين إيمونوبريسيبيتاتيد داخل الكسر البيوتين كما هو موضح في الشكل 3ج. في مكافحة الفئران، عجلت VE لا-كادهيرين، بينما VE-كادهيرين موجود في ليساتيس للسيطرة والحيوانات perfused البيوتين. جزيء الالتصاق داخل الخلية 2 (ICAM-2) هو عجل من الحيوانات perfused البيوتين، وهو العثور على لا المتكاملة-2 في مراقبة الحيوانات. وتظهر ليساتيس للسيطرة والحيوانات perfused البيوتين كميات متساوية من المتكاملة-2 (الشكل 3ج). بمثابة أكتين تحميل عنصر التحكم.
يمكن استخدام هذا الأسلوب تحديد حجم كميات من البروتينات السطحية خلية الكبيبي في نماذج حدوث (مثل التهاب كلي، NTN). في المرحلة المبكرة من NTN [يوم 1 (1-د) بعد حقن المصل NTN]، يزيد من سرعة بروتينية. في مرحلة لاحقة من NTN [يوم 18 (د 18)]، بروتينية يقلل إلى حد كبير. ويبين الشكل 4 نيفرين الخلية السطحية وفرة في مبكرة NTN (1-د). ويبين في فيفو بيوتينيليشن المقايسة (الشكل 4أ) تخفيض نيفرين سطح الخلية في NTN الحيوانات بالمقارنة مع عناصر التحكم. يبين التحليل دينسيتوميتريك انخفاض كبير في بيوتينيلاتيد نيفرين (57 في المائة) في الحيوانات NTN مقارنة بعناصر التحكم (الشكل 4ج). ويكشف التحليل الكمي من مجموع نيفرين إلى أكتين لا توجد اختلافات كبيرة بين الضوابط والفئران NTN (الشكل 4ب). استخدام p57 بودوسيتي خلية محددة تلطيخ، عرض أرقام بودوسيتي كميات متساوية في الحيوانات NTN والتحكم (4 أرقام و 4E). يعرض الرقم 5 نتائج نيفرين الخلية وفرة السطحية في أواخر NTN (18 د). الشكل 5 أ يظهر الإنزيم بيوتينيليشن في فيفو في السيطرة والفئران NTN تشير إلى انتعاش نيفرين سطح الخلية. تحليل دينسيتوميتريك يعرض لا اختلافات كبيرة من الخلايا السطحية نيفرين في السيطرة والفئران NTN (الشكل 5ب). نيفرين الإجمالي انخفض بنسبة 25% في الفئران NTN (الشكل 5ج). كانت انخفضت أرقام بودوسيتي في الفئران NTN مقارنة بعناصر التحكم بحوالي 19% (الأرقام 5 و 5E).
الشكل 1 : نضح الكلي وعزل glomeruli. (أ) عرض من خلال المجهر إلى مكان مورين بعد التروية مع ببسكم. تتم الإشارة إلى القسطرة في الشريان الاورطي مع سهم. ويؤدي نضح مع ببسكم الكلي دورة بالي. (ب) الانصمام glomeruli مع حبات مغناطيسية تظهر كنقط بني على السطح الكلي. (ج) عرض على الرغم من المجهر تبين أنا) تلوث glomeruli (براون جولة هياكل)؛ ثانيا) مع توبولي (هياكل ممدود الخفيفة)؛ وثالثاً) خلية الحطام. هو نقاء glomeruli حوالي 50%. حبات مغناطيسية حرة تظهر كنقط براون (التكبير 100 X). (د) عرض من خلال المجهر تبين درجة نقاء 95% من جلوميرولي (التكبير 100 X). تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: البيوتين الكشف عنها في الحلقة الشعرية الكبيبي- صورة الفلورة الممثل للماوس glomeruli (C57BL/6) perfused مع ببسكم (المراقبة) والبيوتين (البيوتين). هو تصور البيوتين (الأخضر) التي ستريبتافيدين في الحلقة الشعرية الكبيبي فقط في الفئران perfused البيوتين. لا تظهر الفئران التحكم تلطيخ البيوتين الكبيبي. تم الكشف عن WT1 (أحمر) في نواة بودوسيتيس في الفئران على حد سواء. وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: في فيفو البيوتين وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي- (أ) الغربية لطخة تحليل إيمونوبريسيبيتاتيد (IP) بيوتينيلاتيد الخلية البروتينات السطحية (الملكية الفكرية: streptavidin [اغروس] الخرز) وليساتيس (ليساتي) من الكلي من perfused ببسكم (المراقبة) والفئران perfused البيوتين (البيوتين). فقط اكتشاف البروتينات transmembrane نيفرين وبودوكاليكسين في عينات إيمونوبريسيبيتاتيد من الماوس perfused البيوتين الكليتين. في الفئران التحكم، لا يتم كشف نيفرين وبودوكاليكسين في تحقيقات إيمونوبريسيبيتاتيد من الماوس التحكم الكلي. في ليساتيس للسيطرة والحيوانات perfused البيوتين، مبينة مجموع نيفرين وبودوكاليكسين على قدم المساواة في كلتا المجموعتين. ينظم خارج الخلية البروتين داخل الخلايا-الإشارة p42 مؤنزم و p44 (إيرك) لم يتم الكشف عن في تحقيقات إيمونوبريسيبيتاتيد التحكم والماوس perfused البيوتين الكلي. في ليساتيس من كلا الفريقين الماوس، يتم الكشف عن إيرك في كميات متساوية. الأكتين هو الملون كعنصر تحكم تحميل. (ب) الغربية لطخة تحليل نيفرين إيمونوبريسيبيتاتيد (IP: α-نيفرين) في perfused ببسكم (المراقبة) والفئران perfused البيوتين (البيوتين). في الكليتين perfused البيوتين، هو تصور نيفرين مع تلطيخ streptavidin، بينما تم العثور على لا الكشف عن نيفرين في مكافحة الفئران. كسر إيمونوبريسيبيتاتيد نيفرين (الملكية الفكرية: α-نيفرين، البنك الدولي: نيفرين) فضلا عن الكسر ليستي (، البنك الدولي: نيفرين) الملون لإظهار نيفرين كميات متساوية من نيفرين. يتم استخدام عنصر تحكم تحميل أكتين. (ج) الغربية وصمة عار التحليل إيمونوبريسيبيتاتيد بيوتينيلاتيد الخلية البروتين السطحي (الملكية الفكرية: streptavidin [اغروس] الخرز) وليساتيس (ليساتي) من الكلي من ببسكم perfused (تحكم) والفئران perfused البيوتين (البيوتين). بروتين ترانسميمبراني ماركر الأوعية الدموية غشائي (هاء)-كادهيرين وجزيء الالتصاق داخل الخلية 2 (ICAM-2) يتم الكشف عن فقط في جزء إيمونوبريسيبيتاتيد من الحيوانات perfused البيوتين. في مكافحة الفئران، يتم الكشف عن لا VE-كادهيرين أو المتكاملة-2. بمثابة عنصر تحكم تحميل أكتين. وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : البروتين الكبيبي نيفرين وفرة في بداية حدوث التهاب كلي (NTN). (أ) الغربية لطخة تحليل نيفرين السطحية (الملكية الفكرية: α-نيفرين، البنك الدولي: streptavidin) ومجموع نيفرين (الملكية الفكرية: α-نيفرين أو ليساتي، البنك الدولي: نيفرين) في السيطرة وكلي المعالجة بالمصل الفئران (NTN د 1). بمثابة عنصر تحكم تحميل أكتين. مقارنة بضوابط، NTN تظهر الفئران المعالجة خفضت نيفرين سطح الخلية (الملكية الفكرية: α-نيفرين، streptavidin البنك الدولي) بالمقارنة مع عناصر التحكم. (ب) التحليل الكمي من مجموع نيفرين/أكتين في السيطرة والفئران د NTN 1 [التحكم n = 4، ن NTN = 6، الاختلافات غير الهامة (ns)]. (ج) دينسيتوميتريك تحليل نيفرين السطحية (بيوتينيلاتيد نيفرين/مجموع نيفرين) خلية في عنصر التحكم والفئران NTN (* التحكم ف < 0.01، n = 4، ن NTN = 6). (د) إيمونوهيستوتشيميستري p57 عرض بودوسيتيس في السيطرة والفئران NTN 1 د. (ﻫ (تحليل كمي p57 الخلايا إيجابية في منطقة خصل (ميكرو2). (glomeruli 40 كل الماوس كمياً، ns). إظهار بيانات لطخة غربية وسائل ± بودوسيتي التنمية المستدامة. التهم إظهار وسائل ± sem. أونبايريد تي-اختبار مع تصحيح وولش. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : البروتين الكبيبي نيفرين وفرة في حدوث التهاب كلي الراحل (NTN). (أ) الغربية لطخة تحليل نيفرين السطحية (الملكية الفكرية: α-نيفرين، البنك الدولي: streptavidin) ومجموع نيفرين (الملكية الفكرية: α-نيفرين أو، البنك الدولي: نيفرين) في مصل مراقبة وكلي يعامل الفئران (NTN د 18). بالمقارنة مع عناصر التحكم، تظهر الفئران د NTN 18 كميات متساوية من الخلية نيفرين السطحية (الملكية الفكرية: α-نيفرين، البنك الدولي: streptavidin). NTN معاملة الفئران في عرض يوم 18 نيفرين مجموع أقل، واكتين بمثابة عنصر تحكم تحميل. (ب) دينسيتوميتريك التحليل يعرض لا اختلافات كبيرة في خلية نيفرين السطحية بين الضوابط والفئران د NTN 18 (التحكم n = 4، ن NTN = 3). (ج) دينسيتوميتريك تحليل مجموع نيفرين إلى أكتين. في الفئران NTN في يوم 18، هناك أقل تعبيراً عن نيفرين مقارنة بعناصر التحكم (التحكم n = 4، ن NTN = 3، * * ف < 0.001). (د) إيمونوهيستوتشيميستري p57 عرض بودوسيتيس في السيطرة والفئران د NTN 18. هناك أقل الخلايا إيجابية p57 (أحمر) في الفئران د NTN 18 بالمقارنة مع عناصر التحكم. حبات مغناطيسية تظهر كنقاط سوداء. (ﻫ (تحليل كمي p57 الخلايا إيجابية في منطقة خصل الكبيبي (ميكرو2) (* * * التحكم ف < 0.0001، ن = 2، NTN n = 2، glomeruli 40 كل الماوس كمياً). إظهار بيانات لطخة غربية وسائل ± بودوسيتي التنمية المستدامة. التهم إظهار ± وسائل التحليل الإحصائي sem.: مزاوج تي-اختبار مع تصحيح وولش. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة عرض يتيح نجاح عزل glomeruli للتحقيق في الجيش الملكي النيبالي الكبيبي أو البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤديها الثقافات الخلية الكبيبي الأولية من glomeruli معزولة. إذا تم تطبيق البيوتين قبل عزلة الكبيبي، يمكن إجراء وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن دراستها في فيفو خلية الكبيبي الاتجار البروتين السطحي، ومن الممكن كوانتيتيشن شبه من وفرة البروتين. هي الخطوات الأكثر أهمية لنجاح الاختبار وفرة بروتين سطح الخلية الكبيبي 1) تطوير الخبرات اليدوية في الماوس جراحة خاصة كانوليشن من الشريان الاورطي، 2) فقاعة خالية من اتصال محاقن لتفادي الانصمام الهواء جلوميرولي، و 3) يعملون في ظل ظروف الجليد قد بدأت التروية مع ببسكم مرة واحدة.
لهذا الأسلوب، ضروري الخبرة اليدوية في جراحة الماوس. كانوليشن من الشريان الاورطي أهمية خاصة، كما سيمنع تشريح السفينة التروية للكليتين. القطع في الشريان الاورطي يجب أن تكون كبيرة بما يكفي (50 في المائة تقريبا من قطر السفينة) لإنشاء مساحة كافية لإدخال القسطرة. إذا تم قطع القسطرة قطرياً، سيكون من الأسهل إدخال القسطرة في الشريان الاورطي. بالإضافة إلى التشريح، القسطرة المدخلة ينبغي أن توضع عالية داخل الشريان الاورطي من أجل عدم إعاقة الشرايين الكلوية. وإلا سوف لا perfused الشرايين الكلوية مع البيوتين والخرز المغناطيسية.
البيوتين هو فيتامين صغيرة التي تربط مع النسب العالية للبروتينات ستريبتافيدين. بسبب صغر حجمها (244 دا)، لا يغير من وظيفة البروتينات conjugated البيوتين وسوف تتم تصفيته من خلال الكبيبة. بالحضانة مع streptavidin، يمكن بسهولة فصل البروتينات بيوتينيلاتيد من البروتينات غير المميزة بالخرز [اغروس] أو أساليب أخرى. ن-هيدروكسيسوكسيميدي (NHS) استرات البيوتين ربط أمين (-NH2) مجموعات من البروتينات، ووفيرة في سلاسل جانبية من بقايا يسين، على سبيل المثال. سولفو--دائرة الصحة الوطنية--LC-البيوتين هو المياه القابلة للذوبان والخلية-كتيمة، إذا كانت أغشية الخلية سليمة. لقد ثبت سولفو--دائرة الصحة الوطنية--LC-البيوتين لتسمية الخلية البروتينات السطحية23. ملزم استرات المستشفيات البيوتين إلى مجموعات أمين اعتماداً على درجة الحموضة (7-9) واستخدام المخازن المؤقتة الحرة أمين (أي، ببسكم). ولذلك استخدمت ببسكم مع الرقم الهيدروجيني 7.4 نتخلل الكلي الماوس مع البيوتين، كما أنه يجمع بين خصائص فسيولوجية مثالية مع الذوبان الأمثل ووظيفة البيوتين. إخماد البروتينات بعد وضع العلامات، يتم نضح ببسكم مع جليكاين، يسمح البيوتين مجاناً تصبح مرتبطة بمجموعات أمين من جليكاين. لمنع العمليات الخلوية بعد وفاة الحيوان، من المهم إجراء نضح مع حلاً المثلج ومواصلة العمل على الجليد.
مشابهة لأساليب السابقين فيفو بيوتينيليشن، الإجهاد الميكانيكي لتجهيز glomeruli خلال في فيفو بيوتينيليشن بروتوكولات أيار أيضا أثر الالتقام، السريع مما يشير إلى الأحداث، وسلامة الجيش الملكي النيبالي. ولذلك من الضروري أن جميع خطوات المعالجة تتم على الجليد التقليل من خطر النشاط الأنزيمي الخلوية.
بروتينوريك النماذج الحيوانية مثل كلي مصل التهاب الكلية (NTN) تلف الكليتين الماوس شديدا. على وجه الخصوص، نتائج NTN في توسيع ميسانجيال والتصلب الكبيبي، وآفات أنبوبي، مما يؤدي إلى تليف الكلي في مراحل متقدمة من المرض (42 يوما)24. نضح البصر من جلوميرولي سكليروسيد في نماذج المرض قد يؤدي إلى نتائج متحيزة لوفرة البروتين. جلوميرولي سكليروسيد سوف يرجح أن لا يكون perfused مع الخرز المغناطيسية وهكذا قد لا تصبح معزولة في هذا الأسلوب. في نماذج المرض مما يؤدي إلى التصلب الكبيبي الحاد، يمكن استخدام تقنيات لعزل glomeruli عبر مختلف الخطوات النخل بديل للأسلوب المغناطيسي الخرز المستخدمة في هذا البروتوكول25. ومع ذلك، في حالة شدة سكليروسيد جلوميرولي، قد تكون التروية حتى مع البيوتين البصر. وباﻹضافة إلى ذلك، السابقين فيفو بيوتينيليشن، التي هي glomeruli المستخرجة حمم السابقين فيفو في البيوتين حلول21، ربما لا سيكون مفيداً في هذه النماذج. وبدلاً من ذلك، استخدام الفلورة للكشف عن وفرة البروتين في شدة المريضة جلوميرولي قد يكون من المفيد، كما أنها لا تعتمد على نضح glomeruli.
كوانتيتيشن شبه من وفرة البروتين باستخدام هذا الأسلوب يعمل جيدا باستخدام قياس كثافة. ومع ذلك، يمكن غاب عن الفروق الصغيرة في وفرة البروتين نتيجة لحد الكشف لقياس كثافة.
يمكن نقل هذا الأسلوب وصف للأجهزة الأخرى الحيوانية التي هي perfused، شرط أن هياكل الفائدة يتم الوصول إليها عن طريق تقنيات العزل أو البروتين السطحي للفائدة الخاصة بهيكل الجهاز أو نوع خلية واحدة. على الرغم من أن جميع البروتينات السطحية بيوتينيلاتيد بهذا الأسلوب، استخدام جسم معين إيمونوبريسيبيتيشن سوف يؤدي إلى جزء صغير من الخلية البروتين السطحي التعبير عن البروتين محددة (كما هو موضح نيفرين في الشكل 3ب).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون بلانكا دوفنجاك لها المساعدة التقنية استثنائية. ودعم هذا العمل Deutsche الأوقيانوغرافية (www.dfg.de) WO1811/2-1 إلى M.W. و QU280/3-1 للذكاء. وكان ممولاً أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات، وتحليل البيانات، وقرار نشر، وإعداد المخطوط.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
- Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
- Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
- Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
- Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
- Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
- Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
- Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).
- Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
- Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
- Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
- Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
- Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
- Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
- Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).
